Summary
準備し、彼らの最終的な分析のための乾燥血液スポット (DBS) の処理まだよくほとんどの診断アプリケーションの標準化されています。この欠点を克服するために包括的なステップバイ ステップのプロトコルを提案し、その後ウイルス感染症のマーカーを検出するための有効性について評価します。
Abstract
紙カードに血液を収集し、診断前の世紀を起源に乾燥血痕 (DBS) を使用した際のアイデア。その後、DBS テストに主に残ったが何十年もの集中リソース制限の設定で特に感染症の診断や遺伝性代謝疾患の新生児のスクリーニングを体系的かつ唯一最近の様々 ながあります。新しい、革新的な DBS アプリケーション出現し始めています。長年にわたって事前分析変数は新生児スクリーニング、準備を含む全体の事前分析フェーズと DBS のための処理を除いて今日でも、DBS のテストの分野でだけ不適切と考え、最終的な分析では標準化されていません。このような背景を考えると、アル重要な段階をカバーする、包括的なステップバイ ステップのプロトコルを提案する、すなわち、血液のコレクション血液スポット; の準備乾燥血液スポット;DBS; の貯蔵及び輸送最終的には DBS と DBS 波の解析の溶出。このプロトコルの有効性の最初評価されます 1,762 結合血清/DBS ペアと B 型肝炎ウイルス、C 型肝炎ウイルス、および自動分析プラットフォームでひと免疫不全ウイルス感染症のマーカーを検出するため。第二段階でプロトコルにベルリンとエッセンのドイツ都市でアクティブな麻薬常用者に行われたパイロット調査の間に利用されました。
Introduction
セルロースの紙カードに集められた血を使用してのアイデアは生得的にアイヴァー キリスト教を強打する (1869 年-1918 年)、現代臨床微量分析1、2の父。1913 年に、ビッグバンこの濾紙法2を用いたケルダール法波乾燥血液スポット (DBS)3のと、後で、また窒素測定からのブドウ糖を決定しました。その後、いくつかの調査官は梅毒2の診断に血清学的テストの DBS の使用に報告しました。早く 1924 年にチャップマン要約 DBS テストの利点とき彼特に強調、今日まだ有効な 4 つの項目: (1) 従来のに比べて静脈穿刺、少ない血液量が必要でありこの事実は小児で最も重要な診断;(2) 血のコレクションはシンプル、非侵襲的で安価です;(3) 細菌汚染や溶血の危険性は最小限です。検体2、4の劣化がほとんどない長時間 (4) DBS を保存ことができます。その梅毒のテストでは、ほかの DB 技術のさらに初期のアプリケーション、例えば麻疹、流行性耳下腺炎、ポリオ ウイルス、パラインフルエンザ ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス (RSV) に対する抗体の検出に含まれて 1953年2、糞便中に赤痢菌の同定フィルター紙の上に乾燥し、DBS 流行地域での撮影を行い, 以上 3 ヵ月後5 で住血吸虫に対する抗体の検出と同様、オランダのライデンにインドネシアから普通郵便で発送.1963 年、強打の元通信2、6後、50 年ガスリー最終的に掲載された DBS 新生児7、8からかかとプリック テストによって得られるからフェニルケトン尿症の診断のための彼の有名な方法。
その時から DBS が収集するため一般的に適用できるメソッドと見なされて、保管、輸送、およびさまざまな人間の体液5、分析診断での使用は引き続きの診断に主に焦点を当てて感染は、特にリソース制限の設定と十年9、10の遺伝性代謝疾患の新生児の組織的スクリーニング。2005 年以来、しかし、さまざまな新しい、革新的な DBS アプリケーションは出現し始めています。これは、現時点では毎年 DBS の科学的な出版物ほぼ 450 にそれぞれ約 50 から数の指数関数的増加で起因しました。新興のアプリケーションはコゲノミクスと薬物動態学的研究、メタボリック ・ プロファイリング、治療薬物モニタリング、法医中毒学、または環境汚染制御10、11として多様な分野があります。
したがって、過去臨床検査診断で勝利の行進を作ったが、DBS のテスト 100 年2。臨床化学12のようにただし、この 3 月中に事前分析変数適切に考慮されなかった多くの年のため。確かに、CDC のフィルター紙評価プロジェクト13または新生児スクリーニングの14、事前分析フェーズのフレームワークのフィルター紙の上の血のコレクションの国家標準の策定などの著名な活動の後、今日もまだ主として過小評価されているほとんどの応用5, 10が DBS のテストである、他のフィールドで。
このような背景を考えると、準備の次の通信で DBS を処理用イムノアッセイにおける分子技術の必須の手順のすべてをカバーする包括的なステップバイ ステップ プロトコル14 16が示唆された: (1)血液のコレクション(血液スポット; の準備 2)(3) 乾燥血液スポット;(4) 保管および輸送;(DBS; の溶出 5)DBS の波の最後に (6) 解析。プロトコルの有効性は B 型肝炎ウイルス (HBV) 表面抗原 (HBsAg)、b 型肝炎コア抗原 (反 HBc)、b 型肝炎ウイルス表面抗原 (HBs) HBV DNA への抗体に対する抗体を検出するため、1,762 結合血清/DBS ペアでまず評価された抗体C 型肝炎ウイルス (HCV) (HCV) を HCV RNA およびひと免疫不全ウイルス (HIV) 1-p24-抗原/反-HIV 1/2 完全に自動化されたプラットフォームまたは敏感な定性的な核酸を使用してテストします。17.、パイロット研究「薬と慢性伝染病」("DRUCK 研究") アクティブに c 型肝炎によって、コッホ-研究所の緊密な連携で国家資料センターで行った 2 番目のステップでプロトコルが利用ベルリンとエッセンの18のドイツ都市の麻薬常用者。
Protocol
プロトコルは、医療診断で使用する設計されている、ので応用はヘルシンキ宣言19の原則に従う必要があります。この通信で示された結果の最初の部分の両方の患者によって個別契約および倫理委員会の承認のように思えた不可欠である 2 つの理由: (1)"に""すべての患者は、エッセン大学病院への入場書かれた同意するすべての必要な生化学的、細菌学的、ウイルス学的調査」17 (2)「DBS テストの評価で使用されるすべてのサンプル ルーチンの臨床診断の過程でウイルスの研究所に送られました。したがって、特に、研究目的のため収集された標本のどれもないシングル追加採血を行った、材料のどれもが通常の過程で医師によって必要なそれら以外のパラメーターのテストだった診断作業を。17 「薬と慢性伝染病」(DRUCK 研究")18、、DBS テスト最終的に使用されたベルリンそしてシュトゥットガルトのドイツ都市で積極的に薬を注射する人々 を評価する研究はデータのための中央政府長官によって承認されました。保護と自由の情報 (ベルリン、ドイツ) と同様医療大学シャリテ、(ベルリン、ドイツ) の倫理委員会によって。
1. 血のコレクション
- 静脈穿刺14、15、20、21
- 使い捨てラテックスのゴム手袋を入れて、適切な消毒薬、例えば70% イソプロピル アルコール目的の穿刺部位 (できれば正中肘静脈肘窩で) の部分をきれいに。
- 止血血管を広げるために推定される穿刺部位の上 4-6 インチ。患者の静脈に針をガイドし、抗凝固剤として EDTA を含む接続された血管が優しく埋める場所は、一度。
- 採血が完了したら、ターニケットをリリース、針を撤回します。乾いたガーゼのパッドを押してその後が保持できる場所で包帯穿刺部位に。
- 皮膚穿刺 (図 1 a)13-15、20、22、23
- 使い捨てラテックスのゴム手袋のペアに置きます。
- 皮膚穿刺前に、患者は彼/彼女の手を温めたほうがいい。指マッサージ anterogradely エンリッチに穿孔部位への血流があります。
- 適切な消毒剤、例えば70% イソプロピル アルコール以外書く手の 3 番目または 4 番目の指の先端の末節骨の掌側の皮膚をきれいにします。単回使用の安全性の尖頭アーチによって皮膚を穿刺します。指は、指先に血液を重力に容易な位置に開催する必要があります。
- 皮膚穿刺による毛細血管血のコレクションが完了したら、指先に包帯を配置します。
2. 血液スポットの準備
- 静脈穿刺15によって収集された血からの準備
- フィルター カード収集した抗凝固 (EDTA) 全体静脈血をできるだけ早くスポットします。採血後 24 時間以上の乾燥血液スポットを準備することはできません。
- フィルター カードに患者を識別するために必要なすべての情報を置きます。1 枚のカードは、単一の個人の血液のみで発見する必要があります。
- 使い捨てラテックスのゴム手袋を入れてください。
- ゆっくりの反転、採血管 2-4 回、その後慎重にストッパーを開きます。
- 50 μ l のピペットを用いたディスポーザブル チップ全体静脈血を吸い出しなさい。ピペットの先端を直接フィルター ペーパーに触れることがなく、1 つの円の中心に血を転送します。円が完全に飽和してみてください。
- カードのすべての必要なサークルに合わせてこの手順を繰り返します。
- 血からの準備は、皮膚によって収集された (図 1 bと1 C)13-16 23を穿刺
- 余分な組織液が含まれて可能性がありますので、ガーゼのパッドと血の最初のドロップをふき取りなさい。穿刺部位の血流を増加して指をマッサージします。直接指先で画面に触れることがなくフィルター カードの円の 1 つに次のドロップを転送します。毛管力のみによってフィルターのテクスチャに浸漬する血を許可します。
- 指先の毛細血管の血液のフォームの次の大きな下落と次のサークルで収集します。すべての必要なサークルが満ちているまたは血流を停止するまでは、この手順を続行します。
- 絞るまたは「ミルク」指に過度に血流がフィルター カードのすべての必要な円を記入するのに十分でない場合はしないでください。血流が停止した場合は、指の先端に包帯を配置します。試験のより多くの血液が必要な場合は、別の指で 2 番目の皮膚穿刺を実行します。
3. 乾燥血液スポットの
- 血液スポットを乾燥に入れてきれいな紙の上カード バイオハザード安全キャビネットにタオルし、それら乾燥、フィルターできれば O/N (しかし、少なくとも 4 時間)、常温熱の外部ソースの不在で。乾燥工程が完了、血液スポットは、一様に暗い茶色色を持っている、赤い領域が表示されていないときもう (図 1)13, 15, 16。
4. 保管、乾燥血液スポット (DBS) の輸送
注: 後乾燥血液スポットの処理を中断できます。フィルター カードは、ストアド13-16、23を今することができます。
- ストレージ、単一、ガス不透過性ジッパー袋に入れて、湿気 (図 1E) から標本を保護するために 1 に 2 乾燥袋を含むフィルター紙のカードを置きます。必要に応じて、湿度インジケーター カードを追加します。
- -20 ° C の温度で冷凍庫にこのバッグを転送またはできるだけ早くを下げます。冷凍庫はフィールドの条件の下で利用できない場合、ストレージ-4 ° c または周囲温度でも実現可能です最大 14 日間
- ドライアイスで凍結の DBS の標本を輸送します。最初周囲温度で保たれるフィルター カード、内側のコンテナーとしても、インナーとしてもジッパー袋、封筒の外側から成っている三重包装システムを使用します。普通郵便での出荷のため外側の封筒でコンテンツのマーキングが必要ないが、国際バイオハザードのシンボルは、プライマリ内部コンテナー16に貼付されなければなりません。
- さらに乾燥剤のパックおよび/または追加の湿度インジケーター カードがピンク色に変更された場合の処理からフィルター カードを除外します。
5. 乾燥血液の溶出スポット13、15、16、23
- グレード 903 フィルター カード (図 1 f) の各血まみれのサークルから一人用 6 mm デバイスと 1 つのスポットをパンチします。12 ウェル プレートのウェル 1 個に、1 人の患者からすべてパンチ乾燥血液スポットを転送します。
- 0.05% Tween 20 と 0.08% アジ化ナトリウム (図 1) を含むリン酸緩衝生理食塩水と井戸を埋めます。乾燥血液スポットの波の後の分析に使用される試金の最小限のそれぞれの条件に追加されたバッファーのボリュームを調整します。
- 分子解析を実行するために乾燥血液スポット波の 2 番目のシリーズを取得するこれらの手順を繰り返します。
- 研究室のシェーカーで細胞培養プレートを入れて、軽く 4 時間以上溶出パンチ乾燥血液スポットを聞かせてまたは、好ましくは、O/N (図 1 H)。
- 次の日、スポットは、血液からほぼ無料と溶血清 (図 1I) を形成しています。マイクロ遠心チューブ用にこれらの波を転送します。その後、それらの対象 10,500 × g (図 1 j) 溶出 (図 1 K) の間に形作った破片から培養上清を無料で 2 分間遠心分離します。
6. 波の解析
- 遠心の波は、対象の解析に使用する準備が整いました。B 型肝炎ウイルス、C 型肝炎ウイルス、市販のキットを使用して HIV 感染のマーカーの波を調査し、各メーカーの指示に注意深く続く (図 1 L)。
図 1.イムノアッセイと分子技術を使用する準備と乾燥濾紙血の処理をこの通信でプロトコルのグラフィカルな概要を提案します。全体静脈血と毛細血管血ランセット (A) によって穿刺または皮膚の穿刺によって得られた乾燥血液スポット分析のための試料として役立つかもしれない。血液のグレード 903 フィルター カード (B、 C) の円に転送後、サンプル乾燥されるべき好ましく O/N バイオハザード安全キャビネット フォーム赤の任意分散せず均等に茶色のスポットの周囲温エリア (D)。ときの乾燥血液スポットが完了し、ストレージは、必要に応じてフィルター カードは 1-2 乾燥袋 (E) を含むガス不透過性ジッパー袋に包装できます。DBS のさらなる研究所処理シェーカー (H で 4 時間または、好ましくは、O/N の最小値のため PBS ベースのバッファーでパンチの溶出 (F, G) は、円の中心から 6 mm 単回使用デバイスによってパンチの世代を構成します。)、波 (私)、および最終的に研究室カップ (J) 無料の溶出過程 (K) に起源を持つ可能性があります任意の残骸、DBS 溶出液の遠心分離の回復。その後、DBS 溶出はそれぞれ HBV、HCV、HIV 感染症の血清学的マーカーを検出するために完全に自動化されたプラットフォーム (L) によって行われた分析の準備ができています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Representative Results
準備のプロトコルの有効性を提案し、DBS の処理は最初に HBV、HCV、HIV の感染のマーカーの 1,762 結合血清/DBS のペアを分析することによって評価されます。17しますこのため、DBS 100 μ l 全体静脈血 (cf. ポイント 2.1.1-上記のプロトコルの 2.1.6) から調製し, 1,000 μ l の PBS をベースで溶出したバッファー、それぞれ、(cf. 点上記のプロトコルの 5.1-5.5) 処理を完了するには。2 つの別個の操作ですべての 7 つのパラメーター。すべての単一の試料の溶出条件の慎重に最適化せずこのようなアプローチが今後フィールド調査"薬と慢性の間に比較的短い時間でかなり高いサンプル スループットが期待されていたために避けられないよう伝染病」(「DRUCK 研究」).
すべての測定 DBS 解析の過程で、製造元が推奨する付着しますが、溶血の影響や希釈の結果のいずれかを補正するために HBsAg そして反 HBs の決定に関修正されなければならなかった。0.05 IU/ml のカットオフ値を持つ HBsAg テスト 14.7% (52 のうち 354) 偽陽性の率に DBS 波鉛の比較すると、血清のサンプル (図 2 a)。受信機のオペレーティング特性 (ROC) 解析25、26データの表示を 0.15 IU/ml のしきい値の増加が HBsAg 陰性 (0.986 [感度]、0.000 [1-特異度] から HBsAg 陽性の理想的な分離になること図 2 b)。その一方で、10 IU/l HBs の定量化のためのカットオフ率 14.2% (47 のうち 331) の偽陰性の測定された抗体は (図 2) を記録しました。したがって、次の ROC 分析を再度、このカットオフに 1.5 IU/l に値 (0.917 [感度], 0.007 [1-特異度]図 2 D) の最適な差別を達成するために低下しました。
図 2 。HBsAg と HBs DBS 波 (17 日から変更) でテストします。(A) 0.15 IU/ml に 0.05 IU/ml から HBsAg 定量化のためのカットオフ値の ROC 誘導増加 (B) 偽陽性の率が 14.7% を 0% 引き下げ。同様に、HBs の濃度の ROC 解析は完全に最初すべて決定の 14.2% を占めた false ネガを排除 1.5 IU/l (D) 10 IU/l (C) からそれぞれ閾値の減少を提案しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 117は、結合血清/DBS 分析の結果をまとめたものです。DBS 7 検体のいずれかのテストの過程で記録された非特異性はないです。
DBS 波 HBsAg、すなわち HBV による急性および慢性感染症の血清学的キー パラメーターの存在を調べた 98.6% の分析感度が決定されました。HBsAg 2 つ誤って負の血清中濃度は 749 IU/ml, 6 IU/ml であった.抗 HBc 抗体の検出された正常に 204 のうち 176 (i. e 86.3%)DBS の波。20-2 共同 HIV 感染者から発生した測定によって認められた 28 検体から。したがって、HIV 陽性の人は、計算から除外された、97.1% の感度が溶出乾燥全体静脈血液から抗 HBc 抗体を取得するため実現しました。似たような観測 HBs 抗体定量本当の開催。1.5 IU/l に試験のカットオフ値の調整後も 9 矛盾血清 DBS 結果が発生しました。共同 HIV に感染していない患者であった乾燥血液のタンパク質を溶出後検出を実現する低すぎる 11-26 IU/l の血清 HBs は見つけられました。
抗 HCV 抗体は、急性または慢性または解決のいずれかの感染を示しています。4 (i. e. 2.2%) 誤って陰性抗 HCV 結果 DBS 波から求めたし、さらに血清学的及び分子分析は明らかにそれぞれの血清が患者、その感染症はなってきていたから撮影された非常におそらく実証解決。
完全に自動化されたシステムと DBS 波に抗 HIV 抗体の検出は、100% の分析感度が得られた完全に滑らかなプロセスだった。
「100 検体に全血波から平均の HBV DNA の集中を行った (DNA 濃度を意味する: 1,573,898 IU/ml、範囲: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) し 93.0% の値が得られました。したがって、409、3,643 IU/ml の低血中 HBV DNA 濃度の 7 つのサンプル テスト DBS によって見つけられなかった。HCV RNA 陽性を証明した 100 の血清 (HCV RNA 濃度を意味する: 1,415,944 IU/ml, 範囲: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml)、対応する全血因数が利用可能であった。比較検討は 100 %dbs 波から c 型肝炎ウイルス RNA 定量分析感度の結果」。17
研究「薬と慢性伝染病」、だったパイロット フェーズの緊密な連携とロバート ・ コッホ-研究所 (ベルリン、ドイツ) で使われた準備、フィールド条件の下で DBS の処理と輪郭を描かれたプロトコルをテストするにはベルリンとエッセンの18のドイツ都市でアクティブな麻薬常用者に実施。セクション 2.2.1-上記のプロトコルの 2.2.3 で詳しく説明したようにすべて 534 の参加者を登録 (433 人および女性 101 人) がキャピラリー採血を施行し、DBS だったら、再度、PBS ベースのバッファーの 1,000 μ l の追加によって溶離される.
2 つの個人は慢性 HBV に感染するいると診断された 39 解決 b 型肝炎ウイルス感染の血清学的パターンを示した。さらに、15 人の参加者が HBs (ワクチン接種後の状態) に陽性であり、8 は反 HBc 単独での肯定的なことがわかった。参加者の間で HCV 罹患率は 57.3% (N = 193) ベルリンで 73.0% (N = 144) エッセンで。抗体陽性からサンプル 65% (N = 125)、62% (N = 89) 潜伏もあった。534 人のうち 25 抗 HIV の陽性反応。感染症の 19 歳は既に知られていたし、これらの個人の 24 人が c 型肝炎に感染。
DBS の試験で得られた結果慎重に自己報告された b 型肝炎ウイルスと c 型肝炎状態に関する研究参加者の既往のデータと比較。この比較テストの結果と組み合わせて結合血清/DBS ペア「DRUCK 研究」、の六つの大きいドイツ都市でアクティブな麻薬使用者入学の主なフェーズのテスト アルゴリズムのマイナーな修正につながった:「個人感染した HIV は HBV DNA の存在を常にテストされます。参加者が DBS 波が反 HBc または HBs の肯定的な対象を穿刺する 2 番目の協議中に間違いなく彼らの反 HBc 抗 HBs の状態を明らかにするため、最後に、すべての DBS の波は HCV rna 上映されます。"。 HCV のテストの結果に関係なく17
| パラメーター | 結合血清/DBS 波 (N) | 矛盾の結果 (N) | テストの血清および DBS 波の間の相違の理由 |
| B 型肝炎ウイルス | |||
| HBsAg | 299 | 2 | 慢性 HBV 感染症の 2 例。抗ウイルス治療を受けていた両方とそれらの 1 つだった HIV に感染。HBsAg 血清濃度: 749 IU/ml と 6 IU/ml、それぞれ。 |
| 反 HBc | 305 | 28 | 血清、20-2 患者解決 HBV 感染していた。6 人は、血清学的検索「反 HBc だけ」を示した。20-2 患者のあった HIV に感染。20 として評価された「HBV リゾルバー"から"反 HBs 陽性だけで"DBS をテストして、したがって、間違って「予防接種後の状態」として分類されました。 |
| HBs | 310 | 9 | 共同 HIV に感染していない 4 人の患者は血清 HBs 11-26 IU/l、乾燥血液スポットの溶出後抗体の検出を可能にするのには低すぎるが。 |
| HBV DNA | 150 | 7 | それぞれの血清 3,643 IU/ml 409 IU/ml に至る低血中 HBV DNA 濃度を持つ 7 人の患者から得られました。 |
| C 型肝炎ウイルス | |||
| HCV | 339 | 4 | これらの 4 つの血清は、ずっと解決の HCV 感染患者から取られていた。 |
| C 型肝炎ウイルス RNA | 150 | 0 | - |
| HIV | |||
| HIV 1 p24/抗 HIV 1/2 | 209 | 0 | - |
表 1:1,762 DBS、準備し、この通信で提案するプロトコル全体静脈血から処理から得られた結果は、参照として結合血清サンプルの調査結果と比較してください。
Discussion
DBS は、100 年2に使用されているが、驚いたことに、ないまだそれらの準備および処理について一般的なコンセンサス。日には、重要な事前分析フェーズの十分な標準化だけで達成されている新生児スクリーニング14、フィールド DBS テスト5、16、23の他のすべてのアプリケーションのさまざまな異なるプロトコルが存在するのに対し。イムノアッセイにおける、分子技術によって利用されるように準備と DBS を処理のための包括的なステップバイ ステップの命令をこの通信で紹介し、その有効性に関して評価この顕著な不均一性を克服するためにHBV、HCV、HIV 感染症のマーカーを検出します。次の議論の焦点は、提案されたプロトコルの異なるステップに主に配置されます。
DBS 試験多くの異なるフィルター紙の歴史の中でカードは使用される2をされているが、今日だけ 2 つの商業源は血液コレクション5、16クラス II 医療機器として FDA の承認します。これらのフィルターのカード システムは均一なそれらのいずれかの上に作製した毛細血管の血液から得られた分析結果は、4-528以上によって違いはありませんので、非常によく似た吸収特性があります。当然、Masciotra と同僚29 したがって HIV 1 RNA を検出の異なるソースからの血のコレクション カードからの溶出後質的分析と同様します。これらのデータを与えられた、それ事実上除外できます、HBV、HCV のマーカーの血清/DBS のペアを結合をテストするときに観察された不一致のいずれか単独でフィルター カードの選択によって引き起こされた HIV 感染症17 。ただし、検体の定量の正確さが必要不可欠である、ソース-ソース バリエーションはもはや無視できるより高度な技術、例えば特定の30または準備の方法としての DBS (PDB) の穿孔乾燥血清スポット (DSS)31は10をテスト従来の DBS の代わりに適用する必要があります。
テスト DB の血の少量のみが使用されるので (毛細管血の 1 滴は約 50 μ l ので構成されています)5、16、サンプル容積の変化は、重要な、確かに、血清学的結果の間の相違の少なくともいくつか参加者の自己申告の「DRUCK 研究」の操縦中に記録された b 型肝炎ウイルスと c 型肝炎のステータスがこの変数に起因します。サンプル ボリュームの「ゆらぎ」を最小限に抑えるための単一の最も重要な要因は間違いなく技術者22の注意および継続的なトレーニングによって達成することができますのみキャピラリー採血の正しいテクニックです。さらに、品質管理の指標としてプロシージャを特定し、その後不十分なまたは無効な16として考慮されなければならない DBS 標本を除くのために既に DBS の使用すべての所に開始べきであるが。
HIV32のコンテキストで主に研究を行い、高湿度、検体の劣化につながる可能性がありますが、これまで合意に達しているない DBS が乾燥する必要がありますどのくらいの質問について、新生児スクリーニング33が示されています。.O/N を提案するこの通信では、その後 b 型肝炎や c 型肝炎用にすべて関連出版物32、34データ DBS のストレージ上の大半で使用されていた条件を採用の間隔を少なくとも 4 時間または好ましくテスト競合しています。1981 年、ヴィラや同僚35、現代的な分析手法を適用した報告 RT で影響はないことの b 型肝炎ウイルスの解析結果 180 日間の全体の観察期間中に抗体があった場合 > 1/1,000、しかしその DBS血清中の抗体だった 1/100 のみ 15 日後境界線正または負の値になった。4 ° C または-20 ° C で保存では、大幅な改善されませんでした。対照的に、30 年後36テストを HBV 陽性のサンプルの複製を調査し、筆者こと、反 HBc も HBs 抗体 HBsAg 同じ条件になったに対し常温では、183 日間安定であった63 日後に既に偽陰性。DBS 波からの HBV DNA の検出、に関してウイルス核酸の濃度37 37 ° C で少なくとも 7 日間安定していたまたは""3 週間常温保管に耐性があることが判明した38。イムノアッセイ39 -20 ° C、2-8 ° C、および 20-25 ° C にそれぞれ格納されている DBS 試料を用いた 117 日の期間の正確な結果を提供する 2 つの市販第三世代を使用して抗 HCV 抗体のためのテスト。-20 ° C で保存はしかし、光学密度の低い変化につながった。第 4 世代の HCV を適用する elisa 法、すなわちMonolisa c 型肝炎-Ag-Ab-超、DBS、Larratらのテストのコンテキストで40 DBS 室温 3 日間以上保管後の解析的特異性の急激な減少を観察その一方で、正確なテスト結果は、さまざまな条件 (-20 ° C、2-8 ° C、22 ~ 26 ° C) の下で 60 日間の Brandao と同僚41により作製したサンプルを利用した同じキットが得られました。様々 な貯蔵条件下で DBS で HCV RNA 濃度の減少観測範囲 1 年42 RT でない重要な変更から周囲温度43で 4 週間後 10 倍に変更です。それ HBV、HCV 抗原、核酸、アカウントに抗体の安定性ではなく競合しているデータを取得、DBS 用に標本を保存するために以前に定義した、合意形成する提案を撤回する合理的なように見えたHIV 検査15, 30: 短期蒸着 (最大 2 週間まで) の抗原、ウイルスの核酸、抗体とみなされる常温では、安定した長期間にわたって最適なストレージは、冷凍条件に対し。
原則として溶出プロトコルを設計するとき 3 つのパラメーターは考慮すべき: (1) 溶出バッファー;(2) の期間および溶出; 温度(3) と溶出量23。すべての関連した出版物の大半溶出 DBS、ためリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に使用されたほとんどの著者追加タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) またはトゥイーン 20、界面活性剤、安定化によるアッセイ信号を改善するために、タンパク質、ソリューション、および同時にブロック非特異的結合サイト23に入ると。DBS のテストのコンテキストで異なる溶出バッファーを直接比較、のみいくつかのレポートがあります。ヴィラーら36、例えば、記録された PBS/BSA が使用されるすべてのバッファーのほぼ同等の溶出容量 0.5% が非特異的反応性の最も低いレベルで起因しました。非常に似たような観測は、Croom や同僚44によって作られたDBS から抗 HCV 抗体の溶出に関する遺伝システム rLAV EIA の検体希釈液を適用する場合。サンプル劣化のリスクが DBS (上記参照) の準備の後の最初の時間で極めて低いのでスポット常温 O/N をインキュベートして穏やかなエンド オーバー エンドの混合による溶出過程をサポートする決定されました。この方法の利点は片パンチ前日直接転送できる定期的な診断に早く次の朝23.溶出バッファーのボリュームは、希釈倍率を可能な限り低く保つために以降の解析に使用される試金の最小限のそれぞれの条件に適応する必要があります。しかし、慎重にすべての単一の試料の溶離条件の最適化できませんでした前の評価の高いサンプル スループット「DRUCK 研究」17時に比較的短時間で保証される必要があったので。したがって、むしろ好ましくない 1,000 μ l の PBS ベースのバッファーの量は、2 つの別の操作のすべてのパラメーターの全体の溶出過程を完了するために使用されました。
このアプローチの 1 つ「低抗体濃度; ため、HIV に感染して人々 の反 HBc 抗 HBs システムで完全に失敗する 1 つの手... それは HBV DNA に関して最適な感度を持つ分子生物的プロシージャを必要し、HCV RNA テストです」。17一方で高い溶出は、一切評価を通して使用されるキットによる抗 HIV ・ HCV、HBsAg 定量に不利なことが分かった。「HBsAg 98.6 %500 μ l または 600 μ、250 μ l、100 μ l のはるかに小さい溶出量を一部使用していた過去の研究と同様に同様に高度の感度で成功した全血波から正物質の検出」17、36, 45, 46。抗 HCV 抗体は既存の結果に対応したため、179 の血清/DBS ペアの調査で決定 97.8% の感度のレポート24、44、47、48、49、5 ~ 10 倍で低かった溶出容量と作業をしていた。「さらに、HCV 検出のためのプロトコルがあった適切に最適化されて. 独自のカットオフ ポイントを定める」17、24、48、49 「または 20 μ から 100 μ l のサンプル ボリュームを増やすことで」。17、 49最後に、解析的特異性と感度 (100% それぞれ) 抗 HIV の検出のために確立された同等または DBS50、51のテストに適した他イムノアッセイのパフォーマンス特性に優れた"または、段階的な手順をいくつかの抗 HIV テストの併用」17、 52。「彼らは、確かに、また突破開発したと DBS 波 (Q 防ぐ HIV 1 + 2 の DBS キット) で抗 HIV 抗体の検出用に最適化された特別なアッセイの実績」17, 53
一緒に取られて、この通信で示される包括的なステップバイ ステップのプロトコルは準備と DBS を処理可能で使いやすいツールであることを証明したし、診断ウイルスで確実にしたがって、使用することができます。それオートメーション54を使用してアプローチを可能にしその優れた性能特性により DBS 研究室でテストのグローバル フィールドで将来の一般に認められた合意プロトコルの基礎石の一種として機能する可能性があります。医学。
Disclosures
過去には、RSR はアボット診断から講義および彼の科学的な仕事のための財政支援を提供する謝礼金を受け取った。NG と OM は、利害の対立があるないことを宣言します。
Acknowledgments
この通信は、ウイルス学のジャーナル17 BioMed の本部として、クリエイティブ ・ コモンズ表示ライセンス (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) の条件の下でオープン アクセス モードでの以前公開されて結果に基づいて、ライセンシーです。著者より感謝するパイロット研究のフレームワークで実りある協力「薬と慢性伝染病」("DRUCK 研究") 米マーカス、・ w ・ Cai、w. チャン ・ r ・ ジマーマン ロバート ・ コッホ-所 (ベルリン、ドイツ) からと、修正するため図 1同様 d. f. Whybrew 博士 (ドイツ、ゲッティンゲン) として組み立て、撮影は、S. Moyrer に感謝して、原稿。また j. アッカーマン、E. Bayrambasi、米国 Büttner、s. Dziubek、I. Jakobsche、B. Krellenberg、H. クローン、P. Kusimski、A. メトカルフ、j. Piejek、s. ザールに巧みな技術支援に感謝の意を表する M. Schröter と k. ザイデル。この研究はドイツ国民の資料センターに保健省の助成により c 型肝炎の部分で支えられました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex rubber gloves | Hartmann | #4049500041515 | |
| 70% isopropyl alcohol | Bode Chemie | #9768050 | |
| Mulifly safety cannula | Sarstedt | #85.1638 | |
| EDTA blood collection tube | Sarstedt | #02.1066.001 | |
| Adhesive bandage | Hartmann | #2994163 | |
| Dry gauze pad | Hartmann | #143213 | |
| Singel-use safety lancet | Owen Mumford | #3802421 | |
| Filter paper card | Whatman/sigmaaldrich | #10534612 | Filter paper card Grade 903 |
| Disposable pipette tips | Starlab | #S1126-7810, #S1120-8810 | |
| Zipper bag | Flexico | #20219 | |
| Mini desiccant bag | Tropack | #- | |
| Disposable Punch | pfmmedical | #48601 | 6.0 mm Disposable Biopsy Punch |
| Disposable Forceps | Servoprax | #H7301 | |
| 12 Well Cell Culture Plate | Greiner | #665180 | |
| PBS Buffer | Gibco | #14190-136 | |
| Tween 20 | Applichem | #A1389.0500 | |
| Sodium Azide | Merck | #66880250 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | #30120086 | |
| ARCHITECT HBsAg (Quantitative) | Abbott | #6C3642 | |
| ARCHITECT anti-HBc II | Abbott | #8L4425 | |
| ARCHITECT anti-HBs | Abbott | #7C1825 | |
| ARCHITECT anti-HCV | Abbott | #6C3725 | |
| ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo | Abbott | #4J2727 | |
| MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit | Roche | #6374891001 | |
| artus HBV LC PCR Kit | Qiagen | #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests) | |
| VERSANT HCV TMA Assay IVD | Siemens Healthcare | #2554311 |
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