Summary
준비 하 고 그들의 최종 분석에 대 한 건조 혈액 명소 (DBS)의 처리는 여전히 저조한 대부분 진단 응용 프로그램에 대 한 표준화 됩니다. 이 단점을 극복 하기 위해 포괄적인 단계별 프로토콜은 제안 하 고 이후 바이러스 성 감염의 마커를 탐지 하기 위한 그것의 효과 관한 평가.
Abstract
종이 카드에 혈액을 수집 하 고 이후에 전 세기를 유래 하는 진단 목적을 위해 건조 혈액 명소 (DBS)를 사용 하 여 아이디어. 그 이후, DBS 테스트 주로 남아 있다 십 년간에 대 한 리소스 제한 설정에서 특히 전염 성 질환의 진단에 초점을 또는 상속 된 대사 장애에 대 한 신생아의 심사 체계적이 고 유일한 최근 다양 한 새롭고 혁신적인 DBS 응용 프로그램을 시작 합니다. 많은 년에 대 한 사전 분석 변수만 부적절 하 게 여겨졌다 DBS 테스트의 오늘 조차, 신생아 검사, 준비 구성 전체 사전 분석 단계 및 처리를 위한 DBS를 제외한 분야에서 그들의 최종 분석 하지 표준화 되었습니다. 이 배경을 감안할 때, 커버 알 필수 단계, 포괄적인 단계별 프로토콜 제안, 즉, 컬렉션의 혈액; 핏 자국;의 준비 핏 자국;의 건조 저장과 수송의 DBS; DBS, 그리고 마지막으로 DBS 있다의 분석의 차입. 이 프로토콜의 효율성 먼저 B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 및 자동화 된 분석 플랫폼에 인간 면역 결핍 바이러스 감염의 마커 검출을 위한 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍으로 평가 되었습니다. 두 번째 단계에서 프로토콜 파일럿 연구, 베를린, 에센의 독일 도시에서 활성 마약 사용자에 실시 되었다 동안 이용 되었다.
Introduction
셀 루 로스로 만든 종이 카드에 수집 된 혈액을 사용 하는 아이디어는이 기독교 방 (1869-1918 년), 현대 임상 microanalysis1, 2의아버지 관찰 작용. 1913 년에 쾅 있다 건조 혈액 명소 (DBS)3 의 하 고, 나중에, 또한 질소 측정 킬달 메서드를 사용 하 여이 필터 종이 기술2에서 포도 당 결정. 그 후, 여러 조사를 매 독2진단 혈 청 학적인 테스트 위한 DBS의 사용에 보고. 마찬가지로 일찍 1924 년에서 채 프 먼 DBS 테스트의 장점을 요약 때 그가 특히 강조는 여전히 유효한 오늘 4 개 항목: (1) 기존에 비해 venipuncture, 적은 혈액 볼륨 필수 이며이 사실을 소아에서 가장 중요 한 진단; (2) 혈은 간단, 비 침략 적, 하 고 저렴 한; (3) 세균 오염 또는 용 혈이 최소한의; 그리고 (4) DBS analytes2, 4의 거의 아무 저하와 오랜 기간 동안 보존 될 수 있습니다. 매 독에 대 한 테스트에 사용, 게다가 DBS 기술의 더 이른 응용 프로그램, 예를 들면, 홍 역, 유행 성 이하선염, 소아마비, 파라 인플루엔자 바이러스, 그리고 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 항 체의 검출에에서 포함 19532, 배설물에서 이질균의 식별 필터 종이에 건조와 DBS 발병 지역에서 촬영 하 고 3 개월 후 분석5에서에서 Schistosoma에 항 체의 검출으로 서 네덜란드 라이덴 인도네시아에서 일반 우편으로 배송 . 1963 년, 50 년 후 빵의 원래 통신2, 6, 오클라호마 마침내 출판 신생아7, 8에서발뒤꿈치 미친 놈 여 DBS에서 페닐케톤뇨증의 진단에 대 한 그의 유명한 방법.
그 시간 이후부터 DBS는 수집에 대 한 일반적으로 적용 가능한 방법으로 간주 되었다, 저장, 수송, 및 다양 한 인간의 체액5, 분석 진단에 그들의 사용 아직도 남아의 진단에 주로 초점을 맞춘 리소스 제한 설정 및 수십 년9, 10에 대 한 상속 된 대사 장애에 대 한 신생아의 체계적인 검사에 특히 감염. 그러나 2005 년부터,, 새로운 혁신적인 DBS 응용 프로그램의 다양 한 등장 하기 시작 했다. 이 결과 현재에서 매년 거의 450 약 50에서 DBS에 각각 과학적인 간행물의 수에 거의 기 하 급수적 증가. 신흥 응용 프로그램 toxico-그리고 pharmacokinetic 연구, 대사 프로 파일링, 치료 약물 모니터링, 법의학 독성, 또는 환경 오염 제어10, 11등 다양 한 분야 이다.
DBS 테스트, 따라서, 했다 임상 실험실 진단을 통해 개선 3 월 동안 과거 100 년2. 그러나 임상 화학12에서,이 3 월 중 사전 분석 변수 하지 적절 하 게 고려 되었다 몇 년 동안. 사실, 심지어 오늘날, CDC의 필터 종이 평가 프로젝트13 또는14, 사전 분석 단계를 차단 하는 신생아의 프레임 워크에서 필터 종이에 혈액 컬렉션에 대 한 국가 표준의 정립 등 저명한 활동 후 여전히 크게 과소 평가는 DBS 테스트는 적용5, 10, 다른 분야의 대부분 에입니다.
이 배경을 감안할 때, 포괄적인 단계별 프로토콜14-16 에서 사용 immunoassays 분자 기술에 커버의 모든 필수 단계, 준비 하 고 다음과 같은 통신에서 DBS를 처리에 대 한 제안: (1) 컬렉션의 혈액; (핏 자국;의 준비 2) (3) 건조 혈액 명소; (4) 저장과 수송; (DBS;의 차입 5) 그리고 마지막으로 (6) 분석의 DBS 있다. 프로토콜의 효과 처음 평가 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍 B 형 간염 바이러스 (HBV) 표면 항 원 (HBsAg), HBV 코어 항 원 (Anti-hbc), HBV 표면 항 원 (HBs 안티), HBV DNA에 항 체에 항 체 검출을 위한 항 체 C 형 간염 바이러스 (HCV) (안티-HCV)에 HCV RNA, 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 1-p24-항 원/항-HIV 1/2는 완전 자동화 된 플랫폼 또는 민감한 질적 핵 산을 사용 하 여 테스트 합니다. 17. 두 번째 단계에서 프로토콜 파일럿 연구 "약물 및 만성 전염병" ("DRUCK 연구") 활성에 의해 로버트 코흐-연구소의 긴밀 한 협력에 국가 참조 센터 C 형 간염에 대 한 실시 되었다에서 이용 되었다 베를린, 에센18의 독일 도시에서 마약 사용자.
Protocol
프로토콜은 의료 진단에 사용 하기 위해 설계 되었습니다, 이후 응용 프로그램 헬싱키 선언19의 원칙을 준수 해야 합니다. 이 통신에 제시 하는 결과의 첫 번째 부분에 대 한 두 환자에 의해 별도 계약 및 윤리 위원회에 의해 승인 될 듯 불가결 두 가지 이유: (1) "입학" 에센 대학 병원, "모든 환자 제공 시 서 면된 동의 모든 필요한 생화학, 세균, 및 virological 조사. " 17 (2) "DBS 테스트의 평가에서 사용 되는 모든 샘플에 보내진 일상적인 임상 진단 과정에서 바이러스학 연구소. 따라서, 아무도 표본 연구 목적을 위해 특별히 수집, 하지 단일 추가 venipuncture 수행 및 자료의 정상적인 과정에서 의사에 의해 요구 된 모든 매개 변수에 대 한 테스트를 했다 진단 작업 업입니다. " 17 연구 "약물 및 만성 전염병" (DRUCK 연구 ")18, 있는 DBS 테스트 마지막으로 사용 되었다 베를린, 에센의 독일 도시에서 적극적으로 약물을 주사 하는 사람을 평가 하는 데이터에 대 한 연방 위원에 의해 승인 되었다 보호 및 자유 정보 (베를린, 독일)의 고도 의료 대학 Charité (베를린, 독일)의 윤리 위원회로.
1입니다. 혈액의 수집
- Venipuncture14, 15, 20, 21
- 일회용 라텍스 고무 장갑에 넣고 적절 한 살 균 제, 예를 들어, 70% 이소프로필 알코올 의도 펑크 사이트 (선호 메디아 cubital 정 맥 antecubital 포에서)의 영역을 청소.
- 적용 한 지 혈 대 정 맥 distend를 putative 펑크 사이트 위에 4-6 인치. 환자의 정 맥에 바늘을 안내 하 고, 일단 자리에, 부드럽게 연결 된 혈액 튜브, EDTA 항 응고 제로 포함 된 채우기.
- 최대한 빨리 venipuncture 완료 되는 지 혈 대 놓고 바늘을 철회. 그런 다음, 이후에 열릴 수 있다 장소에서 붕대에 의해 찔린 사이트에 마른 거 즈 패드를 누릅니다.
- 피부 빵 꾸 (그림 1A)13-15, 20, 22, 23,
- 일회용 라텍스 고무 장갑 한 켤레를 입었다.
- 피부 빵 꾸, 전에 환자 자신의 손을 따뜻하게 해야. 손가락 마사지 anterogradely 리치 사이트 펑크 쪽으로 혈액 흐름 이다.
- 적합 한 살 균 제, 예를 들어, 70% 이소프로필 알코올 비 쓰기 손의 세 번째 또는 네 번째 손가락의 팁 원심 phalanx의 손바닥 쪽의 피부를 청소. 단일 사용 안전 란 셋에 의해 피부를 찔린 합니다. 중력은 손가락에 혈액의 수집을 용이 하 게 같은 위치에 손가락을 개최 한다.
- 피부 펑크에 의해 모 세관 혈액의 수집 완료 되 면 손가락 끝에 붕대를 놓습니다.
2입니다. 준비의 핏 자국
- Venipuncture15 에 의해 수집 된 혈액에서 준비
- 필터 카드에 수집 된 안티 응고 (EDTA) 전체 정 맥 피를 최대한 빨리 자리. Venipuncture 후 24 시간 이상 말린된 핏 자국을 준비 하지 마십시오.
- 필터 카드에 환자의 식별에 필요한 모든 정보를 넣어. 한 개인의 혈액 만으로 하나의 카드를 발견 한다.
- 일회용 라텍스 고무 장갑에 넣어.
- 부드럽게 반전 혈액 컬렉션 튜브 2-4 시간 하 고 이후 신중 하 게 마 개를 엽니다.
- 일회용 팁을 피 펫을 사용 하 여 전체 정 맥 혈의 50 µ l 발음 필터 종이 피 펫의 끝을 직접 건드리지 않고 한 원의 중심에 혈액을 전송. 완전히 포화 원 하려고 합니다.
- 카드의 모든 필요한 서클을 채우기 위해이 절차를 반복 합니다.
- 피부에 의해 수집 된 혈액에서 준비 펑크 (그림 1B 및 1 C)13-16, 23
- 거 즈 패드와 함께 혈액의 첫 번째 드롭 다운을 닦아 초과 조직 체액을 포함할 수 있기 때문에. 펑크 사이트에서 혈액 흐름을 증가를 다시 손가락을 마사지. 손가락으로 직접 화면을 건드리지 않고 다음 드롭 필터 카드의 서클 중 하나에 전송. 혈액 모 세관 힘만에 의해 필터의 질감에 배어 있을 수 있습니다.
- 손가락 끝에서 모 세관 혈액 형성의 다음 큰 드롭 시키고 원에 수집. 모든 필요한 동그라미 가득 또는 혈 중지 될 때까지이 절차를 계속 합니다.
- 쥐 어 짜기 하지 또는 "우유" 손가락 지나치게 혈액 흐름 필터 카드의 모든 필요한 서클을 채우기 위해 충분 하지 않은 경우. 혈 중지 손가락 끝에는 붕대를 놓습니다. 더 많은 혈액 검사를 위해 필요한 경우에 다른 손가락 두 번째 피부 빵 꾸를 수행 합니다.
3. 혈액 명소의 건조
- 핏 자국 건조, 넣어 깨끗 한 종이에 카드 생물 안전 캐비닛에 수건 고 말리, 필터 선호 O/N (하지만 적어도 4 시간), 열의 어떤 외부 소스의 부재에 실시간에. 건조 과정 완료 되, 혈액의 관광 명소는 균일 하 게 어두운 갈색 색상 고 없는 빨간색 영역을 볼 수 있습니다 더 이상 (그림 1D)13, 15, 16.
4. 저장 및 건조 혈액 명소 (DBS)의 교통
참고: 혈액 명소의 처리 건조 후 중단 될 수 있습니다. 필터 카드 이제 저장된13-16, 23수 있습니다.
- 스토리지, 필터 종이 카드는 표본 습기 로부터 보호 하기 (그림 1E) 1 ~ 2 desiccant sachets을 포함 하는 단일, 가스 불 침투성 지퍼 가방에 넣어. 습도 지시자 카드는 필요에 따라 추가 합니다.
- -20 ° C의 온도 냉동 실에이 가방을 전송 또는 가능한 한 빨리 낮은. 냉동 고를 필드 조건에서 사용할 수 없는 경우, 최대 14 일 동안-4 ° C에서 또는 심지어 주위 온도에 저장은 가능 합니다.
- 드라이 아이스에 냉동된 DBS 표본 전송. 필터 카드 처음 온도에서 보관, 지퍼 되었는데 내부 컨테이너 뿐만 아니라 내부 및 외부 봉투의 구성 된 트리플 패키징 시스템을 사용 합니다. 아니 콘텐츠 표시 일반 우편 배송에 대 한 외부 봉투에 필요 하지만 국제 생물 학적 기호16기본 내부 컨테이너 부착 해야 합니다.
- 건조제 팩 및 추가 습도 지시자 카드는 핑크 색상을 변경 하는 경우 추가 처리에서 필터 카드를 제외 합니다.
5. 건조 혈액의 차입 명소13, 15, 16, 23
- 단일 사용 6 m m 장치 학년 903 필터 카드 (그림 1 층)의 혈액 젖 ㄴ 원 각에서 한 자리 펀치. 한 환자에서 12-잘 접시의 한 잘 모두 천공된 말린된 핏 자국을 전송.
- 0.05% 트윈 20와 0.08% 나트륨 아 지 드 (그림 1G)을 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분에 잘 채워. 말린된 피 반점 있다의 후속 분석을 위해 사용 하는 분석 결과의 최소한의 각 요구 사항에 추가 된 버퍼의 볼륨을 적응.
- 분자 분석을 수행 하기 위해 자리 있다 건조 혈액의 두 번째 시리즈를 얻기 위해이 단계를 반복 합니다.
- 셀 문화 접시 실험실 셰이 커에 넣고 부드럽게 4 시간 최소 elute 천공된 말린된 혈액 명소 하 게 또는, 선호, O/N (그림 1 H).
- 다음 날, 관광 명소는 혈액에서 거의 자유롭다 고 hemolytic supernatants (그림 1I) 형성. Microcentrifuge 튜브 전송이 있다. 그런 다음, 차입 (그림 1 K) 동안에 형성 했다 어떤 파편 든 지에서 supernatants를 10500 x g (그림 1J)에서 2 분 동안 원심 분리를 그들을 주제.
6입니다. 있다 분석
- Centrifuged 있다 의도 분석에 사용할 수 지금 있습니다. B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스 및 상용 키트를 사용 하 여 HIV 감염의 표시를 위한 있다 조사 하 고 해당 제조 업체의 지침을 따르십시오 (그림 1 L).
그림 1. 준비 및 건조 혈액 명소 immunoassays 분자 기법에 의해 사용 될에이 통신에 제안 된 프로토콜의 그래픽 요약. 전체 정 맥 혈과 모 세관 혈액 바소 (A)에 의해 venipuncture 또는 피부의 펑크에 의해 얻은 말린된 혈액 자리 분석 표본으로 봉사 할지도 모른다. 학년 903 필터 카드 (B, C)의 서클에는 혈액의 양도, 후 샘플 해야 건조 선호 O/N 생물 안전 캐비닛 빨간색의 어떤 interspersion 없이 균등 하 게 갈색 색상의 양식 명소에 주위 온도에 (D) 지역입니다. 건조 혈액 명소 완료 되 고 저장이 필요한 필터 카드 포장 될 수 있다 1-2 desiccant sachets (E)을 포함 하는 가스 불 침투성 지퍼 가방에. 통 (H에 최소 4 시간 또는, 선호, O/N의 PBS 기반 버퍼에 펀치의 차입 (F, G), 원의 중심에서 6 mm 단일 사용 장치에서 펀치의 세대를 구성 하는 DBS의 실험실 처리 ), 있다 (나), 그리고 마지막으로 실험실 컵 (J) (K) 과정에서 차입 유래 수 어떤 파편 든 지에서 DBS 있다 무료의 원심 분리의 복구. 그 후, DBS 있다 각각 HBV, HCV, HIV 감염의 혈 청 학적인 마커를 탐지 하기 위해 완전 자동화 된 플랫폼 (L)에 의해 수행 되었다 분석에 대 한 준비가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Representative Results
준비를 위해 제안 된 프로토콜의 효과 DBS의 처리 처음 HBV, HCV, HIV 감염의 마커 1762 결합 된 혈 청/DBS 쌍을 분석 하 여 평가 되었다. 17.이 목적을 위해 DBS 100 µ l 전체 정 맥 혈 (cf. 포인트 2.1.1-이전 프로토콜의 2.1.6)에서 준비 했다 및 1000 µ l의 PBS 기반으로 eluted 했다 버퍼, 각각, (참조 포인트 언급 한 프로토콜의 5.1-5.5) 프로세스를 완료 하려면 대 한 두 개의 별도 작업에서 모든 7 개의 매개 변수입니다. 모든 단일 분석에 대 한 차입 조건의 주의 최적화 없이 이러한 접근 방식은 다소 높은 샘플 처리량은 차기 현장 연구 "약물 및 만성 중 비교적 짧은 시간에 예상 때문에 피할 수 없을 듯 전염 성 질병"("DRUCK 연구").
모든 측정 DBS 분석 과정에서 제조업체의 권장 사항을 준수 하지만 HBsAg 및 안티-HBs 결정 중 혈의 효과 또는 희석의 결과 대 한 보상에 관하여 수정 했다. 0.05 IU/ml의 컷오프 값 (그림 2A) 샘플링 HBsAg의 테스트 DBS 있다 리드 14.7% (52 명 중 354)의 거짓 반응의 속도에 비교 될 때 혈 청에. 수신기 작동 특성 (ROC) 분석25, 26 의 데이터 표시 0.15 IU/ml을 임계값의 증가 HBsAg-원판 (0.986 [감도], [1-특이성], 0.000에서에서 HBsAg 양성의 이상적인 분리 될 그림 2B)입니다. 다른 한편으로, 안티-HBs의 정량화에 대 한 10 IU/l의 차단 항 체의 14.2% (47 명 중 331) false 네거티브 측정 율은 기록 (그림 2C). 따라서, ROC 분석 다시, 다음이 컷오프가 낮아졌다 1.5 IU/l 값 (0.917 [감도], 0.007 [1-특이성], 그림 2D)의 최적의 차별 달성 하기.
그림 2. HBsAg 및 안티-HBs DBS 있다 (에서17수정)에서 테스트. ROC 기반 증가 HBsAg 정량화 0.05 IU/ml에서 (A)을 0.15 IU/ml의 컷오프 값의 (B) 감소 거짓 양성 결과의 비율 14.7%에서 0%로. 마찬가지로, 안티-HBs 농도의 ROC 분석은 해당 임계값 10 IU/l (C)에서 1.5 IU/l (D), false-원판, 처음 모든 결정의 14.2%를 차지 하 고 그로 인하여 완전 하 게 제거의 감소를 제안 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
결합 된 혈 청/DBS 분석의 결과 표 117에 요약 되어 있습니다. 아니 비 특이성 DBS 7 analytes에 대 한 테스트 동안 기록 되었다.
DBS 있다 HBsAg, i. e. HBV, 급성 및 만성 감염의 혈 청 학적인 키 매개 변수의 존재에 대 한 조사 되었다 98.6%의 분석 감도 결정 했다. 2 거짓 부정 세라에 HBsAg 농도 되었고 749 IU/ml 6 IU/ml, 각각. 안티-HBc 항 체 성공적으로 204 중 176 (i. e 86.3%)에서 발견 되었습니다. DBS 있다입니다. 개인 공동 hiv 감염에서 유래 하는 측정에 의해 탐지 되지 했다 28 표본에서 스 물 둘. 따라서, HIV 양성 개인은 계산에서 제외 된, 97.1%의 감도 eluted 말린된 전체 정 맥 혈에서 안티-HBc 항 체를 검색에 대 한 달성 되었다. 유사한 관측 안티-HBs 항 체의 결정에 대 한 진정한 개최. 1.5 IU/l 분석 결과의 컷오프 값의 조정, 후에 9 어긋나는 세럼 DBS 결과 발생 했습니다. 공동 hiv 감염 환자는 너무 낮게 건조 혈액의 차입 후 검색 허용 했다 11-26 IU/l의 혈 청 안티-HBs 농도 발견 했다.
안티-HCV 항 체는 급성 또는 만성 또는 해결 감염을 나타내는 있습니다. DBS 있다에서 4 (i. e. 2.2%) 틀리게 네거티브 안티-HCV 결과 결정 및 serological 및 분자 분석 명확 하 게 입증 각각 세라 그 감염 했다 오래 된 환자에서 찍은 아주 아마 해결.
DBS 있다 완전 자동화 된 시스템에 반대로 HIV 항 체의 검출은 100%의 분석 감도 굴복 완전히 부드러운 과정 이었다.
"전 혈 있다에서 평균 HBV DNA 농도 100 표본에 수행 되었다 (DNA 농도 의미: 1,573,898 IU/ml, 범위: < 357-> 17,860,000 IU/ml) 93.0%의 값을 생성 하 고. 따라서, 낮은 혈 청 HBV DNA 농도 409 3,643 IU/ml 사이 7 샘플 테스트 DB 검색 되지 했다. HCV RNA 긍정적인 것을 입증 했다 100 세라의 (HCV RNA 농도 의미: 1,415,944 IU/ml, 범위: 2,479-> 7,692,000 IU/ml), 해당 전체 혈액 aliquots를 사용할 수 없었습니다. 비교 조사 결과 DBS 있다에서 HCV RNA 결정에 대 한 100%의 분석 감도. " 17
준비 하 고 필드 조건에서 DBS 처리 개요 프로토콜을 테스트 하기 위해 긴밀 한 협력으로는 로버트 코흐 연구소 (베를린, 독일) 연구 "약물 및 만성 전염병"는의 시험 단계 동안에 사용 되었다 베를린, 에센18의 독일 도시에서 활성 마약 사용자에 실시. 섹션 2.2.1-2.2.3 이전 프로토콜의 세부 사항에 설명 된 대로 모든 534 참가자 등록 (433 남녀 101) 모 세관 혈액 샘플링을 받았다 그리고 DBS, 다시, eluted PBS 기반 버퍼의 1000 µ l의 추가 의하여.
두 개인 만성 HBV로 감염 된 것으로 진단 된 39 해결된 HBV 감염의 혈 청 학적인 패턴을 보여주었다. 또한, 15 참가자 안티-HBs (예방 접종 후 상태)에 대 한 긍정적인 이었고 8 Anti-hbc 혼자에 대 한 긍정적인 것을 발견 했다. 참가자 중 안티-HCV 보급은 57.3% (N = 193) 베를린, 73.0% (N = 144) 에센에서. 항 체 양성에서 샘플링 65% (N = 125) 및 62% (N = 89) viremic도 했다. 534 개인에서 25 항 HIV에 대 한 긍정적인 테스트합니다. 감염의 19는 이미 알려져 있었다 고 이러한 개인의 24 공동 HCV 감염 했다.
DBS 테스트 결과 연구 참여자의 상태와 관련 된 자기 보고 HBV 및 HCV 이루게 데이터 신중 하 게 비교 되었다. 테스트의 결과와 함께에서이 비교 혈 청/DBS 쌍 "DRUCK 연구", 6 개의 추가적인 큰 독일 도시에서 활성 마약 사용자를 등록 하는 주요 단계에 대 한 테스트 알고리즘의 작은 수정에 led를 결합: "개인 감염 된 HIV HBV DNA의 존재에 대 한 항상 시험 될 것 이다. 참가자의 DBS 있다는 긍정적인 Anti-hbc 또는 안티-HBs 복종 되어야 한다는 venipuncture에 두 번째 상담 동안 확실히 그들의 안티-HBc/안티-HBs 상태를 명확히 하기 위해, 모든 DBS 있다 HCV RNA에 대 한 검사 하는 것입니다 마지막으로, 안티-HCV 테스트의 결과."에 17
| 매개 변수 | 결합 된 세라/DBS 있다 (N) | 어긋나는 결과 (N) | 혈 청 및 DBS 있다 테스트 사이의 불일치에 대 한 이유 |
| HBV | |||
| HBsAg | 299 | 2 | 2 만성 HBV 감염을 가진 환자입니다. 둘 다 항 바이러스 치료 받고 있었고 그들 중 하나 이었다 공동 hiv 감염. 혈 청에 있는 항 원 농도: 749 IU/ml 및 6 IU/ml, 각각. |
| Anti-hbc | 305 | 28 | 혈 청, 20-2 환자는 해결된 HBV 감염을 했다. 6 개인 serological 찾는 "안티-HBc 혼자" 보였다. 환자의 20-2 공동 hiv 감염 했다. "HBV 확인자"에서 20으로 평가 했다 "안티-HBs 긍정적인 혼자" DBS 테스트 및, 따라서, 거짓 "예방 접종 후 조건"으로 분류 되었다. |
| 안티-HBs | 310 | 9 | 4 환자 에이즈 감염 공동 했다 세럼 안티-HBs 농도 11-26 IU/l, 너무 낮은 건조 혈액 명소의 차입 후 항 체 검출에 대 한 수 있도록 했다. |
| HBV DNA | 150 | 7 | 각각 세라 3,643 IU/ml까지 409 IU/ml에서 낮은 혈 청 HBV DNA 농도와 7 명의 환자에서 얻은 되었습니다 했다. |
| HCV | |||
| 안티-HCV | 339 | 4 | 이러한 4 세라 해결된 HCV 감염 이후 긴 환자에서 촬영 됐다. |
| HCV RNA | 150 | 0 | - |
| 에이즈 | |||
| HIV 1-p24/반대로 HIV 1/2 | 209 | 0 | - |
표 1: 이 준비 되었고 전체 정 맥 혈 다음이이 통신에 제안 된 프로토콜에서 처리, 1762 DBS에서 얻은 결과 참조로 결합 된 혈 청 샘플의 결과에 비해.
Discussion
DBS 100 년2 에 대 한 사용 되었습니다 하지만, 놀랍게도, 아직 그들의 준비 및 처리에 대 한 일반적인 합의 없다입니다. 날짜 하려면,이 중요 한 사전 분석 단계의 충분 한 표준화만 달성 하고있다 신생아 검사14의 분야에서 다양 한 다른 프로토콜 DBS 테스트5, 16, 23의 다른 모든 응용 프로그램에 대 한 존재 하는 반면. 이 놀라운이 극복 하기 위해 immunoassays과 분자 기술로 활용 될 준비 하 고 DBS를 처리에 대 한 포괄적인 단계별로 지침이이 통신에 및 그 효과 관한 평가 HBV, HCV, HIV 감염의 마커를 감지에 대 한 합니다. 다음 논의의 초점은 주로 제안 된 프로토콜의 여러 단계에 배치 됩니다.
많은 다른 지를 테스트 하는 DBS의 역사에서 카드 사용된2 왔지만 오늘만 두 상용 소스 장치로 클래스 II 의료 혈액 컬렉션5, 16에 대 한 FDA에 의해 승인 됩니다. 이러한 필터 카드 시스템 매우 균일 하 고 그들 중에 준비 하는 모 세관 혈액에서 얻은 분석 결과 4%-528이상으로 차이가 없습니다 있도록 매우 유사한 흡수 특성을가지고. 아니나 다를까, Masciotra와 동료29 따라서 hiv-1 RNA를 발견 다른 소스에서 혈액 컬렉션 카드에서 차입 후 질적 분석 결과와 동등 하 게 잘. 이러한 데이터를 감안할 때, 그것은 제외할 수 있습니다 거의 테스트 때 관찰 하는 불일치의 HBV, HCV의 표식에 대 한 혈 청/DBS 쌍을 결합 하 고 HIV 감염17 혼자 필터 카드의 선택에 의해 발생 했다. 그러나, 정확한 정량화 된 분석의 불가결 이면 소스-소스 변형 더 이상 무시할 수 없습니다 및 더 정교한 기술, 예를 들어, microsampling30 또는 준비 하기 위한 방법으로 DBS (PDB) 천공 건조 혈 청 관광 명소의 (DSS)31 기존의 DBS10테스트 대신 적용할 할 수 있습니다.
DBS 테스트에 사용 되는 작은 양의 피 때문 (모 세관 혈액 한 방울 이루어져 약 50 µ l)5, 16, 샘플 볼륨 변화는 중요 한, 그리고 명백 하 게, 적어도 일부의 혈 청 학적인 결과 사이의 불일치 그리고 참가자의 자기 보고 "DRUCK 연구"의 조종 하는 동안 기록 하는 HBV 및 HCV 상태가 변수에 기인. 샘플 볼륨의 "변동"을 최소화 하기 위한 하나의 가장 중요 한 요인은 의심할 여 지 없이 기술 인력22의 신중 하 고 지속적인 훈련에 의해 달성 될 수 있는 모 세관 혈액 컬렉션의 올바른 기술입니다. 또한, 품질 관리의 수단으로 모든 실험실 작업 DBS는 이미 시작 합니다 식별 하 고 그 후 불만족 또는 유효 하지 않은16으로 간주 될 수 있는 DBS 표본 제외에 대 한 절차.
주로 HIV32 의 맥락에서 연구 하 고 신생아 심사33 높은 습도, analytes의 저하로 이어질 수 있습니다 하지만 지금까지 아무런 합의 도달 했습니다 얼마나 DBS air-dried 해야한다의 질문에 대 한 . O/N이이 통신에서 HBV와 HCV에 사용할 이후에 모든 관련 간행물32, 34 데이터 DBS의 저장에의 대다수에서 사용 된 조건을 따라서 채택 제안 간격 4 시간 이상 또는 선호 테스트 상반 된다입니다. 1981 년, 빌라와 동료35, 현대 분석 기법을 적용, 보고는 RT에 스토리지 미치지 않았다 HBV 분석의 결과 180 일의 전체 관찰 기간 동안 항 체 titers 라면 > 1/1000, 하지만 그 DBS 15 일 titers 혈 청에만 1/100 후 경계선 긍정 또는 부정적인 되었다. -20 ° C 또는 4 ° C에서 저장 상당한 개선에 발생 하지 않았다. 대조적으로, 30 년 이상36 테스트 HBV 양성 샘플의 복제를 연구 하 고 저자 발견 그 Anti-hbc 뿐만 아니라 안티-HBs 항 체 했다 최대 183 일 동안에 RT, 안정적인 반면 동일한 조건 하에서 HBsAg 되었다 63 일 후에 이미 false 음수가 DBS 있다에서 HBV DNA 검출, 관련 바이러스 핵 산의 농도 37 ° C37 에 적어도 7 일 동안 안정 또는 최대 3 주까지 RT에서 저장소에 "저항" 입증38. 117 일 DBS 샘플-20 ° C, 2-8 ° C, 및 20-25 ° C에 각각 저장을 사용 하 여 기간에 대 한 정확한 결과 제공 하는 immunoassays39 두 상용 제 3 세대를 사용 하 여 안티-HCV 항 체 테스트. 하지만-20 ° C에서 저장, 광학 밀도의 낮은 변화 귀착되는. 적용 하는 4 세대 안티-HCV ELISA, 즉, Monolisa HCV-Ag-Ab-울트라, DBS 테스트, Larrat 그 외 여러분 의 맥락에서 40 데시벨 표본 실시간에 3 일 이상 저장 후 분석 특이성에 날카로운 감소를 관찰 다른 한편으로, 정확한 테스트 결과 같은 키트 샘플 Brandao 및 동료41에 의해 다양 한 조건 (-20 ° C, 2-8 ° C, 및 22-26 ° C)에서 60 일 동안 입금을 이용 하 여 얻은 했다. 다양 한 보관 조건에서 DBS에서 HCV RNA 농도의 감소에 대 한 관찰 최대 1 년42 RT에서 없음 중요 한 변경에서 온도434 주 후 10 배로 변경 범위. DBS 표본 사용할 수의 저장소에 대 한 이전 정의 합의를 제안 된 프로토콜에서 철회 합리적인 듯 HBV 및 HCV 항, 핵 산 및 계정에 항 체의 안정성에이 오히려 충돌 데이터를 복용, HIV 검사15, 30: 단기 증 착 (최대 2 주)에 대 한 항 원, 바이러스 성 핵 산 및 항 체 간주 됩니다 RT에서 안정으로 오랜 동안 보관 냉동된 조건에는.
일반적으로 세 개의 매개 변수가 고려 되어야 할 때 차입 프로토콜 설계: (1) 차입 버퍼; (2) 기간 및 차입;의 온도 (3) 차입 볼륨23. 모든 관련 간행물의 대다수에서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) DBS, 방출 사용 되었다 고 대부분 저자 추가 단백질, 예를 들면, 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 트윈 20, 계면 활성 제, 안정화 하 여 분석 결과 신호를 개선 단백질, 그들은 솔루션을 동시에 차단 비 특정 바인딩 사이트23로 서. DBS 테스트의 컨텍스트에서 다른 차입 버퍼, 직접 비교는 단지 몇 가지 보고서를 사용할 수 있습니다. 빌라 외. 36, 예를 들어, 기록 된 모든 버퍼 PBS/BSA 하지만 사용에 대 한 거의 차입 용량 0.5% 비 특정 반응성의 저급에 결과. 매우 비슷한 관찰 Croom 및 동료44 에 의해 만들어진 DBS에서 안티-HCV 항 체의 차입에 대 한 유전학 시스템 rLAV EIA의 표본 희석제를 적용할 때. 관광 명소 주위 온도에 O/N을 품 어 부드러운 끝 이상 혼합 하 여 차입 과정을 지원 하 고 샘플 저하의 위험 DBS (위 참조)의 준비 후 첫 번째 시간에서 매우 낮은 이기 때문에, 결정 되었다. 이 방법은 표본 이전 날 렸을 장점이 하루 옮겨질 수 있다 직접 일상 진단 일찍 다음 아침23. 차입 버퍼의 희석 비율을 가능한 한 낮게 유지 후속 분석을 위해 사용 하는 분석 실험의 최소한의 각 요구 사항에 적응 한다. 그러나 높은 견본 처리량 "DRUCK 연구"17동안 비교적 짧은 시간에 보장 해야 하기 때문에, 모든 단일 분석에 대 한 차입 조건의 주의 최적화 이전 평가에서 가능 하지 않았다. 따라서, 오히려 불리 한 볼륨 PBS 기반 버퍼의 1000 µ l의 두 가지 별도 작업의 모든 매개 변수에 대 한 전체 차입 과정을 완료 하기 위해 사용 되었다.
하나이 이렇게 한 손으로 "완전히 낮은 항 체 농도; 인해 HIV에 감염 하는 그 개인에 대 한 안티-HBc/안티-HBs 시스템에서 실패 ..., 그것은 분자 생물학 절차 HBV DNA에 관해서는 최적의 분석 감도 및 필요 HCV RNA 검사. " 17 다른 한편으로, 높은 차입 볼륨 어떠한 방식으로 HBsAg, 안티-HCV, 및 평가에서 사용 되는 키트에 의해 반대로 HIV에 대 한 불리 한 것으로 판명. "전체 혈액 있다에서 긍정적인 재료 100 µ l, 250 µ l, 또는 600 µ l, 500 µ l의 훨씬 작은 차입 볼륨 사용 부분에서 이전 연구에서 유사 하 게 높은 정도로 98.6%의 감도와 성공 HBsAg의 검출"17 36, 45, 46. 안티-HCV 항 체는 이미 존재의 결과에 대응에 대 한 179 혈 청/DBS 쌍의 조사에서 결정 하는 97.8%의 민감도 보고서24, 44, 47, 48, 49, 5 ~ 10 배 낮은 차입 볼륨 근무 했다. "또한, 안티-HCV 검출에 대 한 프로토콜 했다 적절 하 게 최적화 되었습니다... 자신의 잘라 포인트를 규정 하 여"17, 24, 48, 49 "또는 20 µ l에서 100 µ l의 샘플 볼륨을 증가." 17, 49 마지막으로, 분석 특이성 및 감도 (100%) 반대로 HIV 탐지에 대 한 설립 했다 같거나 다른 immunoassays DBS 테스트50, 51 에 특히 적응의 성능 특성에 우수한 "나는 단계적 몇 가지 항 HIV 테스트의 결합된 사용과 절차"17,52. "그들은, 실제로, 또한 초과 했다 특별히 개발 되었으며 DBS 있다 (Q 방지 HIV 1 + 2 DBS 키트)에서 항 HIV 항 체의 검출에 대 한 최적화 된 분석 결과의 성능 기록." 17, 53
함께 찍은,이 통신에 포괄적인 단계별 프로토콜 가능 하 고 사용자 친화적인 도구를 준비 하 고 처리 하는 DBS 입증 하 고 따라서 진단 바이러스학에 안정적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 자동화 54 를 사용 하 여 접근을 허용 한다 고 우수한 성능 특성으로 인해 종류 DBS 실험실에서 테스트의 글로벌 분야에서 미래의 일반적으로 허용된 합의 프로토콜에 대 한 초석의 역할을 의학입니다.
Disclosures
과거에는, RSR 애 보트 진단에서 강 및 그의 과학적인 일에 대 한 재정 지원을 제공 하는 사례금을 받았다. NG와 옴 들은 전혀 상반 되는 관심사를 선언 합니다.
Acknowledgments
이 통신 이전 바이러스학 저널 BioMed 중앙로 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0)의 조건에 따라 오픈 액세스 모드에서17 에 게시 하는 결과에 따라 한 정식 사용자입니다. 저자 기꺼이 인정 조종 연구의 프레임 워크에서 열매가 많이 열리는 협력 "약물 및 만성 전염병" ("DRUCK 연구") 미국 마커 스, W. Cai, W. 장와 R. 짐머에서는 로버트 코흐 연구소 (베를린, 독일)과 그림 1 뿐만 D. F. Whybrew, 박사 (괴팅겐, 독일)로 해결 하기 위한 조립 사진 복용에 대 한 S. Moyrer에 게 감사 하는 원고. 또한 제이 Ackermann, E. Bayrambasi, 미국 Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. 자아 르에 숙련 된 기술 지원에 대 한 그들의 감사를 표현 하는 그들은 M. Schröter와 K.이. 이 연구는 부분적으로 지원 국가 참조 센터 건강의 독일 교육부의 교부 금에 의해 간염 c
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex rubber gloves | Hartmann | #4049500041515 | |
| 70% isopropyl alcohol | Bode Chemie | #9768050 | |
| Mulifly safety cannula | Sarstedt | #85.1638 | |
| EDTA blood collection tube | Sarstedt | #02.1066.001 | |
| Adhesive bandage | Hartmann | #2994163 | |
| Dry gauze pad | Hartmann | #143213 | |
| Singel-use safety lancet | Owen Mumford | #3802421 | |
| Filter paper card | Whatman/sigmaaldrich | #10534612 | Filter paper card Grade 903 |
| Disposable pipette tips | Starlab | #S1126-7810, #S1120-8810 | |
| Zipper bag | Flexico | #20219 | |
| Mini desiccant bag | Tropack | #- | |
| Disposable Punch | pfmmedical | #48601 | 6.0 mm Disposable Biopsy Punch |
| Disposable Forceps | Servoprax | #H7301 | |
| 12 Well Cell Culture Plate | Greiner | #665180 | |
| PBS Buffer | Gibco | #14190-136 | |
| Tween 20 | Applichem | #A1389.0500 | |
| Sodium Azide | Merck | #66880250 | |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | #30120086 | |
| ARCHITECT HBsAg (Quantitative) | Abbott | #6C3642 | |
| ARCHITECT anti-HBc II | Abbott | #8L4425 | |
| ARCHITECT anti-HBs | Abbott | #7C1825 | |
| ARCHITECT anti-HCV | Abbott | #6C3725 | |
| ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo | Abbott | #4J2727 | |
| MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit | Roche | #6374891001 | |
| artus HBV LC PCR Kit | Qiagen | #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests) | |
| VERSANT HCV TMA Assay IVD | Siemens Healthcare | #2554311 |
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