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Biology

सूखे रक्त धब्बे-तैयारी और Immunoassays में और आणविक तकनीकों में उपयोग के लिए प्रसंस्करण

Published: March 13, 2015 doi: 10.3791/52619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Virology, National Reference Centre for Hepatitis C, Essen University Hospital, University of Duisburg-Essen

Summary

तैयारी और उनके अंतिम विश्लेषण के लिए सूखे रक्त धब्बे (डीबीएस) के प्रसंस्करण अभी भी खराब सबसे नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मानकीकृत कर रहे हैं । इस कमी को दूर करने के लिए, एक व्यापक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का सुझाव दिया है और बाद में वायरल संक्रमण के मार्कर का पता लगाने के लिए अपनी प्रभावशीलता के संबंध में मूल्यांकन किया है ।

Abstract

एक कागज कार्ड पर रक्त इकट्ठा करने और बाद में निदान प्रयोजनों के लिए सूखे रक्त धब्बे (डीबीएस) का उपयोग करने का विचार एक सदी पहले की उत्पत्ति । तब से, दशकों के लिए डीबीएस परीक्षण मुख्य रूप से संसाधन में विशेष रूप से संक्रामक रोगों के निदान पर ध्यान केंद्रित-सीमित सेटिंग्स या विरासत में मिला चयापचय विकारों के लिए नवजात शिशुओं की व्यवस्थित स्क्रीनिंग और केवल हाल ही में एक किस्म है रह गया है नए और नवीन डीबीएस के आवेदन उभरने शुरू हो गए । कई वर्षों के लिए, पूर्व विश्लेषणात्मक चर ही अनुपयुक्त डीबीएस परीक्षण के क्षेत्र में माना जाता है और आज भी थे, नवजात स्क्रीनिंग के अपवाद के साथ, पूरे पूर्व विश्लेषणात्मक चरण है, जो तैयारी और डीबीएस के प्रसंस्करण के लिए उनके शामिल अंतिम विश्लेषण मानकीकृत नहीं किया गया है । इस पृष्ठभूमि को देखते हुए, एक व्यापक कदम दर कदम प्रोटोकॉल, जो अल आवश्यक चरणों को शामिल किया गया है, प्रस्तावित है, यानी, रक्त का संग्रह; खून के धब्बे तैयार करना; खून के धब्बे सुखाने; डीबीएस का भण्डारण और परिवहन; डीबीएस का रेफरेंस, और अंत में डीबीएस eluates का विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पहले हेपेटाइटिस बी वायरस, हेपेटाइटिस सी वायरस के मार्कर का पता लगाने के लिए १,७६२ युग्मित सीरम/डीबीएस जोड़े के साथ मूल्यांकन किया गया था, और एक स्वचालित विश्लेषणात्मक मंच पर मानव इम्यूनो वायरस संक्रमण । एक दूसरे चरण में, प्रोटोकॉल एक पायलट अध्ययन है, जो बर्लिन और एस्सेन के जर्मन शहरों में सक्रिय दवा उपयोगकर्ताओं पर आयोजित किया गया था के दौरान उपयोग किया गया था ।

Introduction

एक कागज फाइबर से बने कार्ड पर एकत्र रक्त का उपयोग करने का विचार िवार क्रिश्चियन बैंग (१८६९-१९१८), आधुनिक नैदानिक microanalysis के पिता के लिए जिंमेदार है1, 2। १९१३ में, बैंग सूखे रक्त के धब्बे (डीबीएस) के eluates से ग्लूकोज निर्धारित3 और, बाद में, यह भी नाइट्रोजन माप इस फिल्टर कागज तकनीक2के साथ Kjeldahl विधि का उपयोग कर प्रदर्शन किया । इसके बाद, कई जांचकर्ताओं सीरम परीक्षण के लिए डीबीएस के उपयोग पर सूचना दी उपदंश के निदान के लिए2। के रूप में १९२४ में जल्दी के रूप में, फेरीवाला डीबीएस परीक्षण के लाभ संक्षेप में जब वह विशेष रूप से चार मदों, जो आज भी मांय है पर जोर दिया: (1) पारंपरिक venipuncture की तुलना में, कम रक्त की मात्रा की आवश्यकता है और इस तथ्य बाल चिकित्सा में सबसे महत्वपूर्ण था निदान; (2) रक्त संग्रह सरल, गैर इनवेसिव, और सस्ती है; (३) जीवाणु संदूषण या hemolysis का जोखिम न्यूनतम होता है; और (4) डीबीएस analytes2, 4की लगभग कोई गिरावट के साथ लंबी अवधि के लिए संरक्षित किया जा सकता है । उपदंश के लिए परीक्षण में इसके उपयोग के अलावा, डीबीएस तकनीक के आगे जल्दी आवेदन शामिल हैं, जैसे, खसरा के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने, कण्ठमाला, पोलियो, parainfluenza वायरस, और श्वसन syncytial वायरस (RSV) में १९५३2, मल में शिगेला की पहचान फिल्टर पेपर पर सूख गई और इंडोनेशिया से नियमित रूप से मेल द्वारा भेज दिया नीदरलैंड में Leiden के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Schistosoma के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए डीबीएस में स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में ले लिया और अधिक से अधिक तीन महीने बाद विश्लेषण किया5 . १९६३ में, बैंग के मूल संचार2, 6के बाद ५० साल, Guthrie अंत में डीबीएस से धमनियों के निदान के लिए अपनी प्रसिद्ध विधि प्रकाशित नवजात शिशुओं7, 8से एक एड़ी चुभन द्वारा प्राप्त की ।

हालांकि उस समय के बाद से, डीबीएस इकट्ठा, भंडारण, परिवहन, और मानव शरीर के तरल पदार्थ की एक किस्म का विश्लेषण के लिए एक सामांय रूप से लागू विधि के रूप में माना गया5, निदान में उनके उपयोग अभी भी मुख्य रूप से के निदान पर ध्यान केंद्रित रह गया विशेष रूप से संसाधन सीमित सेटिंग्स में संक्रमण और दशकों के लिए विरासत में मिला चयापचय विकारों के लिए नवजात शिशुओं की व्यवस्थित स्क्रीनिंग9, 10. २००५ के बाद से, तथापि, नए और अभिनव डीबीएस आवेदनों की एक किस्म के लिए उभरने शुरू कर दिया है । इस बारे में ५० से डीबीएस पर संबंधित वैज्ञानिक प्रकाशनों की संख्या में लगभग घातीय वृद्धि के परिणामस्वरूप वर्तमान में लगभग ४५० सालाना । उभरते अनुप्रयोगों के अलावा toxico-और pharmacokinetic अध्ययन, चयापचय की रूपरेखा, चिकित्सकीय दवा की निगरानी, फोरेंसिक विषविज्ञान, या पर्यावरण संदूषण नियंत्रण10, 11के रूप में इस तरह के विविध क्षेत्रों रहे हैं ।

डीबीएस परीक्षण है, इस प्रकार, पिछले १०० साल के दौरान नैदानिक प्रयोगशाला निदान के माध्यम से एक विजयी मार्च किया2। नैदानिक रसायन विज्ञान में12के रूप में, तथापि, इस मार्च के दौरान पूर्व विश्लेषणात्मक चर पर्याप्त रूप से कई वर्षों के लिए विचार नहीं किया गया । दरअसल, आज भी सीडीसी के फिल्टर कागज मूल्यांकन परियोजना13 या नवजात स्क्रीनिंग14, पूर्व विश्लेषणात्मक चरण के ढांचे में फिल्टर कागज पर रक्त संग्रह के लिए एक राष्ट्रीय मानक के निर्माण के रूप में ऐसी प्रख्यात गतिविधियों के बाद अभी भी काफी हद तक अंय क्षेत्रों, जिसमें डीबीएस परीक्षण लागू किया जाता है के अधिकांश में मूल्यांकन किया है5, 10।

इस पृष्ठभूमि को देखते हुए, immunoassays में उपयोग के लिए एक व्यापक कदम दर कदम प्रोटोकॉल14 -16 और आणविक तकनीकों में, जो आवश्यक कदम के सभी शामिल हैं, की तैयारी और निंनलिखित संचार में डीबीएस प्रसंस्करण के लिए सुझाव दिया है: (1) रक्त का संग्रह; (२) रक्त के धब्बे तैयार करना; (३) रक्त के धब्बे सूख जाना; (4) भण्डारण और पिरवहन; (5) डीबीएस का रेफरेंस; और अंत में (6) डीबीएस eluates का विश्लेषण । प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पहले हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) सतह प्रतिजन (HBsAg), एंटीबॉडी एचबीवी कोर प्रतिजन (एंटी HBc), एंटीबॉडी एचबीवी सतह प्रतिजन (विरोधी एचबीएस), एचबीवी डीएनए, एंटीबॉडी के लिए का पता लगाने के लिए युग्मित सीरम/ हेपेटाइटिस सी वायरस (HCV) (anti-HCV), HCV आरएनए, और मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) 1-p24-प्रतिजन/विरोधी एचआईवी 1/2 या तो एक पूरी तरह से स्वचालित मंच या संवेदनशील गुणात्मक न्यूक्लिक एसिड परीक्षण का उपयोग कर । 17. एक दूसरे चरण में, प्रोटोकॉल पायलट अध्ययन में उपयोग किया गया था "दवाओं और जीर्ण संक्रामक रोगों" ("DRUCK अध्ययन") जो रॉबर्ट कोच द्वारा आयोजित किया गया था-निकट सहयोग में राष्ट्रीय संदर्भ केंद्र हेपेटाइटिस सी के लिए सक्रिय पर संस्थान बर्लिन और एस्सेन के जर्मन शहरों में दवा उपयोगकर्ताओं को18.

Protocol

चूंकि प्रोटोकॉल चिकित्सा निदान में उपयोग के लिए बनाया गया है, इसके आवेदन19हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों का पालन करना होगा । इस संचार में प्रस्तुत परिणामों के पहले भाग के लिए, दोनों रोगियों और एक आचार समिति द्वारा अनुमोदन द्वारा एक अलग समझौते के लिए दो कारणों के लिए औषधालय लग रहा था: (1) "प्रवेश पर" एस्सेन विश्वविद्यालय अस्पताल के लिए, "हर रोगी प्रदान करता है सभी आवश्यक जैव रासायनिक, जीवाणु, और virological जांच करने के लिए लिखित सहमति. " 17 (2) "डीबीएस परीक्षण के मूल्यांकन भर में इस्तेमाल सभी नमूनों को नियमित नैदानिक निदान की प्रक्रिया में वायरोलॉजी के संस्थान के लिए भेजा गया. इस प्रकार, नमूनों में से कोई भी विशेष रूप से अध्ययन के प्रयोजन के लिए एकत्र किया गया था, नहीं एक भी अतिरिक्त venipuncture प्रदर्शन किया गया था और सामग्री में से कोई भी सामान्य के पाठ्यक्रम में चिकित्सकों द्वारा आवश्यक उन लोगों के अलावा अन्य पैरामीटर के लिए परीक्षण किया गया था नैदानिक काम-अप. " 17 अध्ययन "दवाओं और जीर्ण संक्रामक रोगों" (DRUCK अध्ययन ")18, जिसमें डीबीएस परीक्षण अंत में बर्लिन और एस्सेन के जर्मन शहरों में इस्तेमाल किया गया था जो लोगों को सक्रिय रूप से दवाओं इंजेक्षन का मूल्यांकन करने के लिए, संघीय आयुक्त द्वारा डेटा के लिए अनुमोदित किया गया था संरक्षण और सूचना की स्वतंत्रता (बर्लिन, जर्मनी) और साथ ही चिकित्सा विश्वविद्यालय Charité की नैतिकता समिति द्वारा, (बर्लिन, जर्मनी).

1. रक्त का संग्रह

  1. Venipuncture14, 15, 20, 21
    1. प्रयोज्य लेटेक्स रबर के दस्ताने पर रखो, और इरादा पंचर साइट के क्षेत्र को साफ (अधिमानतः antecubital खात में औसत cubital नस) एक उपयुक्त विसंक्रमित के साथ, उदा, ७०% isopropyl शराब ।
    2. नसों को विtourniquet करने के लिए ख्यात पंचर साइट के ऊपर एक 4-6 इंच का आवेदन करें । रोगी की नस में सुई गाइड और, एक बार यह जगह में है, धीरे से जुड़े रक्त ट्यूब, जो एक थक्कारोधी के रूप में EDTA शामिल भरें ।
    3. जैसे ही venipuncture पूरा होता है, tourniquet को रिलीज कर सुई वापस ले लेती है । फिर, पंचर साइट पर एक सूखी धुंध पैड प्रेस, जो बाद में एक पट्टी द्वारा जगह में आयोजित किया जा सकता है ।
  2. त्वचा पंचर (चित्र 1a)13-15, 20, 22 , 23
    1. प्रयोज्य लेटेक्स रबर दस्ताने की एक जोड़ी पर रखो ।
    2. त्वचा पंचर होने से पहले रोगी को अपने हाथों को गर्म करना चाहिए । उंगली पंचर साइट की ओर रक्त के प्रवाह को समृद्ध anterogradely मालिश है ।
    3. गैर की तीसरी या चौथी उंगली के टिप के बाहर व्यूह के पाल्मर पक्ष की त्वचा को साफ एक उपयुक्त संक्रमित के साथ हाथ लेखन, उदा, ७०% isopropyl शराब । एक सिंगल फीमेल सेफ्टी नुकीला से स्किन को पंक्चर कर रहे हैं । उंगली ऐसी स्थिति है कि गुरुत्वाकर्षण उंगलियों पर रक्त के संग्रह की सुविधा में आयोजित किया जाना चाहिए ।
    4. जब त्वचा पंचर द्वारा केशिका रक्त का संग्रह पूरा हो गया है, उंगली टिप पर एक पट्टी जगह है ।

2. खून के धब्बे तैयार करना

  1. venipuncture द्वारा एकत्र रक्त से तैयारी15
    1. एकत्र विरोधी coagulated (EDTA) फिल्टर कार्ड पर पूरे शिरापरक रक्त के रूप में जितनी जल्दी हो सके हाजिर । तैयार न करें सूखे खून के धब्बे venipuncture के बाद 24 hr से अधिक ।
    2. फिल्टर कार्ड पर रोगी की पहचान के लिए आवश्यक सभी जानकारी रखो । एक कार्ड केवल एक व्यक्ति के खून के साथ देखा जाना चाहिए ।
    3. प्रयोज्य लेटेक्स रबर दस्ताने पर रखो ।
    4. धीरे से रक्त संग्रह ट्यूब 2-4 बार पलटने और बाद में ध्यान से डाट खोलो ।
    5. महाप्राण ५० µ पूरे शिरापरक रक्त की एक प्रयोज्य टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर एल । पिपेट की नोक के साथ सीधे फिल्टर कागज को छूने के बिना एक सर्कल के केंद्र के लिए रक्त हस्तांतरण । पूरी तरह से सर्कल संतृप्त करने की कोशिश करो ।
    6. कार्ड के सभी आवश्यक हलकों को भरने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  2. त्वचा पंचर द्वारा एकत्र रक्त से तैयारी (आंकड़े 1b और 1C)13-16 , 23
    1. एक धुंध पैड के साथ रक्त की पहली बूंद पोंछ क्योंकि यह अतिरिक्त ऊतक तरल पदार्थ शामिल हो सकते हैं । पंचर स्थल पर रक्त प्रवाह बढ़ाने के लिए फिर से उंगली की मालिश करें । सीधे उंगलियों के साथ सतह को छूने के बिना एक फिल्टर कार्ड के हलकों में से एक के लिए निम्नलिखित ड्रॉप स्थानांतरण । रक्त को केवल केशिका ताकतों द्वारा फिल्टर की बनावट में भिगो दें ।
    2. केशिका रक्त रूप की अगली बड़ी बूंद को उंगली-नोक पर दें और अगले सर्कल में इसे इकट्ठा करें । सभी आवश्यक हलकों भर रहे है या रक्त प्रवाह बंद हो जाता है जब तक यह प्रक्रिया जारी रखें ।
    3. निचोड़ या नहीं "दूध" उंगली जरूरत से ज्यादा अगर रक्त प्रवाह के लिए पर्याप्त फिल्टर कार्ड के सभी आवश्यक हलकों को भरने के लिए नहीं है । यदि रक्त प्रवाह बंद हो जाता है उंगली पर एक पट्टी-टिप । यदि परीक्षा के लिए अधिक रक्त की आवश्यकता हो तो दूसरी उंगली पर एक दूसरे त्वचा पंचर प्रदर्शन करें ।

3. खून के धब्बे सुखाने

  1. खून के धब्बे शुष्क करने के लिए, एक साफ कागज तौलिया पर फिल्टर कार्ड एक, एक खतरा सुरक्षा कैबिनेट में डाल दिया और उंहें शुष्क, अधिमानतः ओ/N (लेकिन कम से कम 4 बजे के लिए), आरटी में गर्मी के किसी भी बाहरी स्रोत के अभाव में । जब सुखाने की प्रक्रिया पूरी हो जाती है, तो खून के धब्बे एक समान रूप से गहरे भूरे रंग के होते हैं और कोई लाल क्षेत्र अब दिखाई नहीं देते हैं (चित्र 1)13, 15, 16।

4. भंडारण और सूखे रक्त धब्बे (डीबीएस) के परिवहन

नोट: खून के धब्बे की प्रोसेसिंग सूखने के बाद बाधित हो सकती है । फ़िल्टर कार्ड अब13-16, 23 संग्रहित किया जा सकता है ।

  1. भंडारण के लिए, एक एकल, गैस अभेद्य ज़िप बैग में फिल्टर कागज कार्ड डाल दिया, 1 से 2 जलशुष्कक पाउच युक्त करने के लिए नमी से नमूनों की रक्षा (चित्रा 1E) । वैकल्पिक रूप से, एक आर्द्रता संकेतक कार्ड जोड़ें ।
  2. -20 ° c या जितनी जल्दी हो सके कम तापमान के साथ एक फ्रीजर के लिए इस बैग हस्तांतरण । यदि फ्रीजर क्षेत्र की स्थिति के तहत उपलब्ध नहीं हैं, भंडारण पर-4 डिग्री सेल्सियस या यहां तक कि परिवेश के तापमान पर 14 दिनों के लिए संभव है ।
  3. सूखी बर्फ पर जमे हुए डीबीएस नमूनों परिवहन । फिल्टर कार्ड के लिए शुरू में परिवेश के तापमान पर रखा, एक ट्रिपल पैकेजिंग प्रणाली है, जो ज़िप बैग (ओं) के रूप में भीतरी कंटेनर (ओं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक भीतरी और एक बाहरी लिफाफा के होते है का उपयोग करें । नियमित रूप से मेल द्वारा शिपमेंट के लिए बाहरी लिफाफे पर कोई सामग्री चिह्नों की आवश्यकता होती है, लेकिन अंतरराष्ट्रीय के लिए खतरा नहीं है कि आंतरिक कंटेनर16पर चिपकाया जाना चाहिए ।
  4. यदि जलशुष्कक पैक और/या अतिरिक्त आर्द्रता संकेतक कार्ड एक गुलाबी रंग में बदल जाता है, तो आगे की प्रक्रिया से फ़िल्टर कार्ड छोड़ें ।

5. सूखे खून के रेफरेंस के धब्बे13, 15, 16, 23

  1. ग्रेड ९०३ फिल्टर कार्ड (चित्रा 1F) के प्रत्येक खून से लथपथ सर्कल से एक एकल उपयोग 6 मिमी डिवाइस के साथ एक स्थान बाहर पंच. एक रोगी से सभी छिद्रित सूखे रक्त धब्बे स्थानांतरण 12-अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से एक के लिए ।
  2. फॉस्फेट-बफर खारा के साथ अच्छी तरह से भरें ०.०५% के बीच 20 और ०.०८% सोडियम azide (चित्रा 1G) युक्त । जोड़ा बफर की मात्रा को परख के ंयूनतम संबंधित आवश्यकताओं को अनुकूलित सूखे रक्त धब्बे eluates के बाद विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया ।
  3. सूखे रक्त स्पॉट eluates की एक दूसरी श्रृंखला प्राप्त करने के लिए इन चरणों को दोहराएँ ताकि आणविक विश्लेषण करने के लिए.
  4. एक प्रयोगशाला के बरतन पर सेल संस्कृति प्लेट रखो और छिद्रित सूखे रक्त धब्बे धीरे 4 hr की एक ंयूनतम के लिए elute या, अधिमानतः, O/N (चित्रा1) ।
  5. अगले दिन, धब्बे रक्त से लगभग मुक्त कर रहे हैं और रक्तलायी supernatants (चित्रा 1I) का गठन किया है । इन eluates को microcentrifuge ट्यूबों में ट्रांसफर करें । फिर, उंहें १०,५०० x जी (चित्रा 1J) पर 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक विषय के लिए किसी भी मलबे कि रेफरेंस (चित्रा1) के दौरान गठन किया था से supernatants मुक्त ।

6. Eluates का विश्लेषण

  1. केंद्रापसारक eluates अब इरादा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं । हेपेटाइटिस बी वायरस के मार्कर के लिए eluates की जांच, हेपेटाइटिस सी वायरस और एचआईवी संक्रमण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर और संबंधित निर्माताओं के निर्देशों का सावधानी से पालन करें (चित्रा 1L) ।

Figure 1
चित्र 1. तैयार करने और सूखे रक्त धब्बों के प्रसंस्करण के लिए immunoassays में और आणविक तकनीकों द्वारा इस्तेमाल किया जा करने के लिए इस संचार में प्रस्तावित प्रोटोकॉल का चित्रमय सारांश । पूरे शिरापरक रक्त और केशिका रक्त या तो venipuncture या त्वचा के पंचर द्वारा प्राप्त एक नुकीला (a) सूख रक्त स्थान विश्लेषण के लिए नमूनों के रूप में सेवा कर सकते हैं । एक ग्रेड ९०३ फिल्टर कार्ड (बी, सी) के हलकों के लिए रक्त के हस्तांतरण के बाद, नमूनों लाल रंग की किसी भी interspersion के बिना एक समान रूप से भूरा रंगों के धब्बे बनाने के लिए एक, एक खतरा सुरक्षा कैबिनेट में परिवेश के तापमान पर अधिमानतः ओ/ क्षेत्र (D) । जब रक्त धब्बे के सुखाने पूरा हो गया है और भंडारण के लिए आवश्यक है, फिल्टर कार्ड गैस में पैक किया जा सकता है-अभेद्य ज़िप बैग युक्त 1 – 2 जलशुष्कक पाउच (ई) । डीबीएस के आगे प्रयोगशाला प्रसंस्करण हलकों के केंद्र से एक 6 मिमी एकल उपयोग डिवाइस द्वारा घूंसे की पीढ़ी को शामिल (च, जी), एक पंजाब में घूंसे के रेफरेंस के आधार पर न्यूनतम 4 hr के लिए बफर या, अधिमानतः, O/N एक शेखर पर (H ), eluates की वसूली (मैं), और अंत में प्रयोगशाला के कप (जंमू) के केंद्रापसारक किसी भी मलबे कि रेफरेंस प्रक्रिया (कश्मीर) के दौरान उत्पंन हो सकता है से डीबीएस eluates मुक्त करने के लिए । इसके बाद, डीबीएस eluates विश्लेषण के लिए तैयार हैं, जो क्रमशः एचबीवी, HCV और एचआईवी संक्रमण के सीरम मार्करों का पता लगाने के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित मंच (L) द्वारा प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Representative Results

तैयारी और डीबीएस के प्रसंस्करण के लिए सुझाव दिया प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पहले एचबीवी, HCV, और एचआईवी संक्रमण के मार्करों के लिए १,७६२ युग्मित सीरम/डीबीएस जोड़े का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया गया था । 17. इस प्रयोजन के लिए, डीबीएस १०० µ l पूरे शिरापरक रक्त (cf. अंक 2.1.1-2.1.6 पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल के) से तैयार किए गए थे और १,००० µ एल के साथ eluted थे-आधारित बफर, प्रत्येक, (cf. अंक ५.१-५.५ aforementioned प्रोटोकॉल के) प्रक्रिया को पूरा करने के लिए दो पृथक प्रचालनों में सभी सातों मापदंडों के लिए । इस तरह के हर एक analyte के लिए रेफरेंस शर्तों के सावधान अनुकूलन के बिना एक दृष्टिकोण को अपरिहार्य लग रहा था क्योंकि एक जगह उच्च नमूना प्रवाह आगामी क्षेत्र के अध्ययन के दौरान एक अपेक्षाकृत कम समय में अपेक्षित था "ड्रग्स और क्रोनिक संक्रामक रोग "(" DRUCK अध्ययन ") ।

सभी माप डीबीएस विश्लेषण के पाठ्यक्रम में निर्माता की सिफारिशों का पालन किया, लेकिन hemolysis के प्रभाव या कमजोर पड़ने के परिणाम के लिए या तो क्षतिपूर्ति करने के लिए HBsAg और विरोधी एचबीएस निर्धारण के संबंध में संशोधित करना पड़ा । ०.०५ IU/एमएल के एक कट-ऑफ मूल्य के साथ, डीबीएस eluates के HBsAg परीक्षण के लिए सीरम नमूने (चित्र 2a) की तुलना में १४.७% की झूठी-धनात्मकता (३५४ से ५२) की दर का नेतृत्व करते हैं. रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता (ROC) विश्लेषण25, डेटा के 26 संकेत दिया कि ०.१५ IU/एमएल के लिए सीमा की वृद्धि HBsAg-नकारात्मक से HBsAg-सकारात्मक के एक आदर्श जुदाई में परिणाम होगा (०.९८६ [संवेदनशीलता], ०.००० [1-विशिष्टता], चित्र b) । दूसरी ओर, विरोधी एचबीएस एंटीबॉडी के ठहराव के लिए 10 IU/एल की एक कट ऑफ के साथ-साथ १४.२% (३३१ से ४७) की झूठी-ऋणात्मक माप की दर दर्ज की गई (चित्र 2c) । इसलिए, ROC विश्लेषण के बाद फिर से, इस कटौती से १.५ IU/l को कम किया गया मूल्यों का एक इष्टतम भेदभाव को प्राप्त करने के लिए (०.९१७ [संवेदनशीलता], ०.००७ [1-विशिष्टता], चित्रा 2d).

Figure 2
चित्र 2. डीबीएस eluates में HBsAg और एंटी एचबीएस टेस्टिंग (17से संशोधित) । ०.०५ IU/एमएल (ए) से ०.१५ IU/एमएल (बी) से HBsAg ठहराव के लिए कट-ऑफ वैल्यू की ROC-निर्देशित वृद्धि से झूठे-सकारात्मक परिणामों की दर १४.७% से घटाकर 0% कर दी । इसी प्रकार, एंटी-एचबीएस सांद्रता के ROC विश्लेषण ने 10 IU/l (C) से १.५ IU/l (D) तक संबंधित थ्रेशोल्ड की कमी का सुझाव दिया, जिससे शुरू में सभी दृढ़ निश्चयों के १४.२% के हिसाब से झूठी-ऋणात्मकताओं को नष्ट कर सके । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

युग्मित सीरम/डीबीएस विश्लेषण के परिणाम तालिका 117में संक्षेप हैं । सात analytes में से किसी के लिए डीबीएस परीक्षण के दौरान कोई गैर-विशिष्टता दर्ज नहीं की गई ।

जब डीबीएस eluates HBsAg की उपस्थिति के लिए जांच की गई थी, एचबीवी, ९८.६% की एक विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता के साथ दोनों तीव्र और जीर्ण संक्रमण के सीरम कुंजी पैरामीटर निर्धारित किया गया था । दो में HBsAg सांद्रता झूठी-नकारात्मक सीरा थे ७४९ IU/एमएल और 6 IU/एमएल, क्रमशः । एंटी-HBc एंटीबॉडी सफलतापूर्वक २०४ से बाहर १७६ में पाया गया (i. e ८६.३%) डीबीएस eluates । बाईस नमूनों में से दो बाहर जो व्यक्तियों सह एचआईवी से संक्रमित से उत्पंन माप द्वारा नहीं पाया गया । इस प्रकार, अगर एचआईवी पॉजिटिव व्यक्तियों गणना से बाहर रखा गया, ९७.१% की संवेदनशीलता eluted से विरोधी HBc एंटीबॉडी वापस लाने के लिए प्राप्त किया गया था पूरे शिरापरक रक्त सूख । इसी तरह की टिप्पणियों विरोधी एचबीएस एंटीबॉडी के निर्धारण के लिए सच का आयोजन किया । १.५ IU/l को परख के कट-ऑफ मान के समायोजन के बाद भी नौ प्रतिकूल सीरम डीबीएस परिणाम हुआ. रोगियों में एचआईवी से संक्रमित नहीं सह, सीरम विरोधी एचबीएस सांद्रता of 11 – 26 IU/l पाए गए थे, जो भी सूखे रक्त के रेफरेंस के बाद पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए कम थे.

विरोधी HCV एंटीबॉडी या तो एक तीव्र या जीर्ण या हल संक्रमण का संकेत कर रहे हैं । केवल चार (२.२%) झूठा-नकारात्मक विरोधी HCV परिणाम डीबीएस eluates से निर्धारित किया गया और आगे सीरम और आणविक विश्लेषण स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि संबंधित सीरा बहुत शायद रोगियों, जिसका संक्रमण लंबे समय से किया गया था से लिया गया हल.

पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली के साथ डीबीएस eluates में विरोधी एचआईवी एंटीबॉडी का पता लगाने के एक पूरी तरह से चिकनी प्रक्रिया है जो १००% की एक विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता झुकेंगे था ।

"पूरे रक्त eluates से एचबीवी डीएनए एकाग्रता मतलब १०० नमूनों पर प्रदर्शन किया गया था (डीएनए एकाग्रता का मतलब: १,५७३,८९८ IU/एमएल, सीमा: < ३५७-> १७,८६०,००० IU/एमएल) और ९३.०% का एक मूल्य झुकेंगे । इस प्रकार, डीबीएस परीक्षण द्वारा ४०९ और ३,६४३ IU/एमएल के बीच कम सीरम एचबीवी डीएनए सांद्रता के साथ सात नमूनों का पता नहीं लगाया गया । १०० सीरा जो सिद्ध किया था HCV आरएनए सकारात्मक (मतलब HCV आरएनए एकाग्रता: १,४१५,९४४ IU/एमएल, रेंज: २,४७९-> 7, 692, 000 IU/एमएल), इसी पूरे रक्त aliquots उपलब्ध थे । तुलनात्मक जांच में डीबीएस eluates से HCV आरएनए निर्धारणों के लिए १००% की विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता हुई । 17

फील्ड शर्तों के तहत डीबीएस की तैयारी और प्रसंस्करण के लिए रेखांकित प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए, यह अध्ययन "दवाओं और जीर्ण संक्रामक रोगों" है, जो था के पायलट चरण के दौरान रॉबर्ट कोच-संस्थान (बर्लिन, जर्मनी) के साथ निकट सहयोग में इस्तेमाल किया गया था बर्लिन और एस्सेन के जर्मन शहरों में सक्रिय दवा उपयोगकर्ताओं पर आयोजित18. सभी ५३४ प्रतिभागियों नामांकित (४३३ पुरुषों और १०१ महिलाओं) से गुजरी केशिका रक्त नमूना के रूप में 2.2.1 वर्गों में विस्तार से वर्णित-पूर्ववर्ती प्रोटोकॉल की 2.2.3, और डीबीएस थे, फिर से, eluted के अतिरिक्त द्वारा १,००० पंजाब के µ एल आधारित बफर ।

दो व्यक्तियों को लंबे एचबीवी से संक्रमित होने का निदान किया गया, और ३९ एक हल एचबीवी संक्रमण के सीरम पैटर्न दिखाया । इसके अलावा, पंद्रह प्रतिभागियों विरोधी एचबीएस के लिए सकारात्मक थे (टीकाकरण के बाद स्थिति) और आठ को विरोधी अकेले HBc के लिए सकारात्मक पाया गया । प्रतिभागियों के बीच विरोधी HCV प्रसार ५७.३% (n = १९३) बर्लिन में और ७३.०% (n = १४४) एस्सेन में किया गया था । एंटीबॉडी-धनात्मक नमूनों में से ६५% (n = १२५) और ६२% (n = ८९) भी viremic थे. ५३४ व्यक्तियों में से पच्चीस विरोधी एचआईवी के लिए सकारात्मक परीक्षण किया । संक्रमण के उन्नीस पहले से ही ज्ञात थे और इन व्यक्तियों में से 24 HCV के साथ सह-संक्रमित थे ।

डीबीएस परीक्षण द्वारा प्राप्त परिणामों के अध्ययन प्रतिभागियों ' anamnestic डेटा के बारे में आत्म रिपोर्ट एचबीवी और HCV स्थिति की तुलना में ध्यान दिया गया । परीक्षण एल्गोरिथ्म के मुख्य चरण के लिए "DRUCK अध्ययन", जो छह अतिरिक्त बड़े जर्मन शहरों में सक्रिय दवा उपयोगकर्ताओं नामांकन जाएगा के मामूली संशोधनों के नेतृत्व में युग्मित सीरम/डीबीएस जोड़े के परिणाम के साथ संयोजन के रूप में इस तुलना: "व्यक्तियों एचआईवी से संक्रमित हमेशा एचबीवी डीएनए की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया जाएगा । जिन प्रतिभागियों को डीबीएस eluates विरोधी HBc या विरोधी एचबीएस के लिए सकारात्मक है एक दूसरे के परामर्श के दौरान एक venipuncture के अधीन किया जाना चाहिए ताकि निश्चित रूप से उनके विरोधी HBc/विरोधी एचबीएस स्थिति स्पष्ट करने के लिए और, अंत में, सभी डीबीएस eluates HCV आरएनए के लिए जांच की जाएगी विरोधी HCV परीक्षण के परिणामों की परवाह किए बिना. " 17

पैरामीटर युग्मित सीरा/डीबीएस eluates (एन) प्रतिकूल परिणाम (N) परीक्षण सीरम और डीबीएस eluates के बीच विसंगतियों के कारण
एचबीवी
hbsag २९९ 2 जीर्ण एचबीवी संक्रमण के साथ दो रोगियों । दोनों एंटीवायरल उपचार के तहत थे और उनमें से एक एचआईवी से संक्रमित सह था । सीरम में HBsAg सांद्रता: ७४९ IU/एमएल और 6 IU/एमएल, क्रमशः ।
एंटी HBc ३०५ 28 सीरम में बीस-दो मरीजों का हल एचबीवी संक्रमण था । छह व्यक्तियों "विरोधी HBc अकेले" खोज सीरम दिखाया । मरीजों में से बाईस एचआईवी से संक्रमित सह रहे थे । "एचबीवी रिज़ॉल्वर" से, बीस के रूप में मूल्यांकन किया गया "विरोधी एचबीएस सकारात्मक अकेले" डीबीएस परीक्षण द्वारा और, इस प्रकार, झूठा "के रूप में टीकाकरण के बाद हालत" वर्गीकृत किया गया ।
एंटी एचबीएस ३१० 9 एचआईवी से संक्रमित नहीं सह चार रोगियों सीरम विरोधी एचबीएस सांद्रता के 11 ‑ 26 IU/l, जो भी सूखे रक्त स्थानों के रेफरेंस के बाद एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए कम थे.
एचबीवी डीएनए १५० 7 संबंधित सीरा सात रोगियों से प्राप्त किया गया था कम सीरम एचबीवी डीएनए सांद्रता से लेकर ४०९ IU/एमएल से ३,६४३ IU/
hcv
एंटी HCV ३३९ 4 इन चार सीरा रोगियों से लिया गया था, लंबे समय से हल HCV संक्रमण के साथ ।
HCV आरएनए १५० 0 –
एचआईवी
hiv 1-p24/एंटी-एचआईवी 1/2 २०९ 0 –

तालिका 1: १,७६२ डीबीएस से प्राप्त परिणाम, जो तैयार किया गया और इस संचार में प्रस्तावित प्रोटोकॉल के बाद पूरे शिरापरक रक्त से संसाधित किया गया, एक संदर्भ के रूप में युग्मित सीरम नमूनों में निष्कर्षों की तुलना में.

Discussion

डीबीएस १०० साल के लिए इस्तेमाल किया गया है2 लेकिन, आश्चर्य की बात है, वहां अभी भी अपनी तैयारी और प्रसंस्करण के बारे में कोई आम सहमति है । तारीख करने के लिए, इस महत्वपूर्ण पूर्व विश्लेषणात्मक चरण के एक पर्याप्त मानकीकरण केवल नवजात स्क्रीनिंग के क्षेत्र में प्राप्त किया गया है14, जबकि विभिन्न प्रोटोकॉल की एक किस्म डीबीएस परीक्षण के अन्य सभी अनुप्रयोगों के लिए मौजूद है5, 16, 23. इस उल्लेखनीय विविधता को दूर करने के लिए, एक व्यापक कदम दर कदम अनुदेश तैयार करने और डीबीएस प्रसंस्करण के लिए immunoassays में उपयोग किया जा करने के लिए और आणविक तकनीकों द्वारा इस संचार में प्रस्तुत किया जाता है और इसकी प्रभावशीलता के संबंध में मूल्यांकन एचबीवी, HCV और एचआईवी संक्रमण के मार्कर का पता लगाने के लिए । निंनलिखित चर्चा का ध्यान मुख्य रूप से सुझाए गए प्रोटोकॉल के विभिंन चरणों पर रखा गया है ।

डीबीएस परीक्षण के इतिहास में कई अलग फिल्टर कागज कार्ड का इस्तेमाल किया गया है2 लेकिन आज केवल दो वाणिज्यिक स्रोतों रक्त संग्रह के लिए कक्षा द्वितीय चिकित्सा उपकरणों के रूप में एफडीए द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं5, 16. ये फ़िल्टर कार्ड सिस्टम अत्यधिक समान है और बहुत समान अवशोषण विशेषताओं है ताकि उनमें से किसी पर भी तैयार किए गए केशिका रक्त से प्राप्त विश्लेषणात्मक परिणाम 4% से अधिक-5%28से अलग न हों । आश्चर्य नहीं, Masciotra और सह कार्यकर्ता29 इसलिए विभिंन स्रोतों से रक्त संग्रह कार्ड से रेफरेंस के बाद एक गुणात्मक परख के साथ एचआईवी-1 आरएनए समान रूप से अच्छी तरह से पता लगाया । इन आंकड़ों को देखते हुए, यह वस्तुतः बाहर रखा जा सकता है कि विसंगति के किसी भी देखा जब परीक्षण युग्मित सीरम/एचबीवी, HCV और एचआईवी संक्रमण के मार्करों के लिए डीबीएस जोड़े17 अकेले फिल्टर कार्ड के चुनाव के कारण था । हालांकि, जब एक analyte की सटीक ठहराव अपरिहार्य है, स्रोत से स्रोत भिंनता अब नगण्य और अधिक परिष्कृत तकनीक, जैसे, छिद्रित डीबीएस (PDBS) microsampling30 या तैयारी के लिए एक विधि के रूप में हो सकता है सूखे सीरम धब्बे (DSS) के31 के बजाय पारंपरिक डीबीएस परीक्षण10के लिए लागू किया जा सकता है ।

रक्त की केवल छोटी मात्रा के बाद से डीबीएस परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है (केशिका रक्त की एक बूंद लगभग ५० µ l के होते हैं)5, 16, नमूना मात्रा में भिन्नता महत्वपूर्ण हैं और, बेशक, सीरम परिणामों के बीच विसंगतियों में से कुछ और भागीदार स्वयं रिपोर्ट एचबीवी और HCV "DRUCK अध्ययन" के संचालन के दौरान दर्ज की स्थिति इस चर के कारण हैं । नमूना मात्रा के "उतार-चढ़ाव" को न्यूनतम करने के लिए एकल सबसे महत्वपूर्ण कारक निस्संदेह केशिका रक्त संग्रह की एक सही तकनीक है, जो केवल तकनीकी कर्मियों को सावधान और चल रहे प्रशिक्षण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है22. इसके अलावा, गुणवत्ता नियंत्रण के एक उपाय के रूप में, डीबीएस के साथ काम कर रहे सभी प्रयोगशालाओं पहले से ही की पहचान करने और बाद में डीबीएस नमूनों कि असंतोषजनक या अमान्य के रूप में माना जाता है को छोड़कर के लिए प्रक्रियाओं शुरू कर दिया जाना चाहिए16.

एचआईवी३२ और नवजात स्क्रीनिंग३३ के संदर्भ में मुख्य रूप से किए गए अध्ययनों से पता चला है कि उच्च आर्द्रता analytes की गिरावट का कारण बन सकता है, लेकिन अब तक कोई आम सहमति कब तक डीबीएस हवा होना चाहिए के सवाल के बारे में पहुंच गया है सूख . इस संचार, जो इसलिए कि सभी प्रासंगिक प्रकाशनों३२, डीबीएस के भंडारण पर ३४ डेटा के विशाल बहुमत में उपयोग किया गया बाद में एचबीवी और HCV परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अपनाया गया है, जो इस संवाद में प्रस्तावित है, जो एक अंतराल के ंयूनतम 4 घंटा या अधिमानतः ओ/ परस्पर विरोधी हैं. १९८१ में, Villa और सह कार्यकर्ता३५, जो समकालीन विश्लेषणात्मक तकनीक लागू की सूचना दी है कि आरटी पर भंडारण १८० दिन की पूरी प्रेक्षण अवधि के दौरान एचबीवी विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित नहीं किया अगर एंटीबॉडी titers थे > 1/ बन गया सीमा रेखा-सकारात्मक या नकारात्मक भी 15 दिनों के बाद जब सीरम में titers केवल 1/100 थे । -20 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण एक पर्याप्त सुधार में परिणाम नहीं था । इसके विपरीत, एक अध्ययन के तीस साल बाद३६ का परीक्षण किया एक एचबीवी-सकारात्मक नमूना की प्रतिकृति, और लेखकों ने पाया कि विरोधी HBc के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विरोधी एचबीएस एंटीबॉडी आरटी पर १८३ दिनों के लिए स्थिर थे, जबकि HBsAg एक ही परिस्थितियों में बन गया झूठी-नकारात्मक ६३ दिनों के बाद पहले से ही । डीबीएस eluates से एचबीवी डीएनए का पता लगाने के संबंध में, वायरल न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता ३७ ° c३७ पर कम से कम सात दिनों के लिए स्थिर था या करने के लिए तीन सप्ताह के लिए आरटी पर भंडारण के लिए "प्रतिरोधी" साबित३८। एंटी-HCV एंटीबॉडी के लिए परीक्षण दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तीसरी पीढ़ी के immunoassays३९ का उपयोग कर ११७ दिनों की अवधि के लिए सटीक परिणाम प्रदान किया डीबीएस नमूनों का उपयोग कर-20 डिग्री सेल्सियस, 2-8 डिग्री सेल्सियस, और 20-25 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः । पर भंडारण-20 ° c, हालांकि, ऑप्टिकल घनत्व की सबसे कम भिन्नता के परिणामस्वरूप. डीबीएस परीक्षण, Larrat एट अल के संदर्भ में एक चौथी पीढ़ी के विरोधी HCV एलिसा, यानी, Monolisa HCV-एजी-एबी-अल्ट्रा लागू । ४० से अधिक तीन दिनों के लिए आर टी में डीबीएस नमूनों के भंडारण के बाद विश्लेषणात्मक विशिष्टता में तेजी से कमी मनाया । दूसरी ओर, सटीक परीक्षण के परिणाम एक ही किट के साथ प्राप्त किए गए नमूनों का उपयोग ६० विभिन्न स्थितियों (-20 डिग्री सेल्सियस, 2-8 डिग्री सेल्सियस, और 22-26 डिग्री सेल्सियस) के तहत Brandao और सह-कार्यकर्ता४१द्वारा जमा किया । विभिंन भंडारण की स्थिति के तहत डीबीएस में HCV आरएनए सांद्रता की गिरावट पर टिप्पणियों के लिए एक वर्ष के लिए आरटी में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन से एक गुना परिवर्तन करने के लिए चार सप्ताह के बाद परिवेश के तापमान४३पर४२ । एचबीवी और HCV एंटीजन, न्यूक्लिक एसिड और एंटीबॉडी के खाते में स्थिरता पर इस बल्कि परस्पर विरोधी डेटा लेने, यह एक आम सहमति है, जो डीबीएस नमूनों के भंडारण के लिए पहले से परिभाषित किया गया था करने के लिए प्रस्तावित प्रोटोकॉल में वापस लेने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए उचित लग रहा था एचआईवी परीक्षण15, 30: अल्पकालिक जमाव के लिए (दो सप्ताह तक) एंटीजन, वायरल न्यूक्लिक एसिड, और एंटीबॉडी आरटी पर स्थिर के रूप में माना जाता है, जबकि लंबी अवधि के लिए इष्टतम भंडारण जमे हुए स्थितियों पर है ।

एक नियम के रूप में, जब एक रेफरेंस प्रोटोकॉल डिजाइनिंग तीन मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए: (1) रेफरेंस बफर; (2) रेफरेंस की अवधि और तापमान; और (३) रेफरेंस वॉल्यूम२३. सभी प्रासंगिक प्रकाशनों फॉस्फेट के विशाल बहुमत में (पंजाब) eluting डीबीएस के लिए इस्तेमाल किया गया था, और ज्यादातर लेखकों एक प्रोटीन जोड़ा, जैसे, गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) या 20 के बीच, एक surfactant, क्रम में स्थिर द्वारा परख संकेत में सुधार करने के लिए प्रोटीन, के रूप में वे समाधान में जाना है, और एक साथ गैर विशिष्ट बंधन साइटों को अवरुद्ध23। केवल कुछ रिपोर्टों, जो सीधे डीबीएस परीक्षण के संदर्भ में अलग रेफरेंस बफर की तुलना, उपलब्ध हैं । Villar एट अल. ३६, उदा., सभी उपयोग किए गए बफ़र्स के लिए लगभग समकक्ष रेफरेंस क्षमता दर्ज की गई, लेकिन पंजाब/BSA ०.५% गैर-विशिष्ट जेट के निम्नतम स्तर के परिणामस्वरूप । एक बहुत ही अवलोकन Croom और सह कार्यकर्ताओं द्वारा किया गया था४४ जब आनुवंशिकी प्रणाली का नमूना मंदक के लिए rLAV ईआईए डीबीएस से एंटी HCV एंटीबॉडी के रेफरेंस के लिए आवेदन । के बाद से नमूना गिरावट का खतरा डीबीएस की तैयारी के बाद पहले घंटे में बेहद कम है (ऊपर देखें), यह स्पॉट O/N गर्मी परिवेश के तापमान पर करने का फैसला किया गया था और के लिए कोमल अंत से अधिक अंत मिश्रण द्वारा रेफरेंस प्रक्रिया का समर्थन । इस दृष्टिकोण लाभ है कि पिछले दिन बाहर छिद्रित नमूनों सीधे नियमित निदान करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है जल्दी अगली सुबह23। रेफरेंस बफर की मात्रा को बाद में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया परख के ंयूनतम संबंधित आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि कमजोर पड़ने का कारक रखने के रूप में संभव के रूप में कम । हालांकि, हर एक analyte के लिए रेफरेंस शर्तों का एक सावधानीपूर्वक अनुकूलन पूर्ववर्ती मूल्यांकन में संभव नहीं था क्योंकि एक उच्च नमूना प्रवाह "DRUCK अध्ययन"17के दौरान एक अपेक्षाकृत कम समय में गारंटी होना चाहिए था । नतीजतन, पंजाब के १,००० µ एल के बजाय प्रतिकूल मात्रा बफर आधारित दो अलग अभियान में सभी मापदंडों के लिए पूरे रेफरेंस प्रक्रिया को पूरा करने के क्रम में इस्तेमाल किया गया था ।

इस दृष्टिकोण एक हाथ में विफल रहता है "पूरी तरह से विरोधी में HBc/विरोधी कम एंटीबॉडी सांद्रता के कारण एचआईवी से संक्रमित व्यक्तियों के लिए एचबीएस प्रणाली; और यह एचबीवी डीएनए और HCV आरएनए परीक्षणों के संबंध में इष्टतम विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता के साथ आणविक जैविक प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । 17 दूसरी ओर, उच्च रेफरेंस की मात्रा में HBsAg, विरोधी HCV के निर्धारण के लिए कोई रास्ता नहीं है, और मूल्यांकन भर में इस्तेमाल किट द्वारा एचआईवी विरोधी साबित कर दिया । "पूरे रक्त eluates से HBsAg सकारात्मक सामग्री का पता लगाने के पिछले अध्ययन है, जो भाग में था के रूप में एक इसी उच्च डिग्री के लिए ९८.६% की संवेदनशीलता के साथ सफल रहा १०० µ एल, २५० µ एल, या ६०० µ एल, या ५०० µ एल के एक बहुत छोटे रेफरेंस मात्रा का इस्तेमाल किया l"17 ,३६, ४५, ४६. विरोधी HCV एंटीबॉडी के लिए १७९ सीरम/डीबीएस जोड़े की जांच में निर्धारित ९७.८% की संवेदनशीलता पहले से ही मौजूदा रिपोर्टों के परिणाम से मेल खाती है24, ४४, ४७, ४८, ४९, जो एक रेफरेंस मात्रा है कि 5 से 10 के एक कारक द्वारा कम था के साथ काम किया था । "इसके अलावा, विरोधी HCV का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल उचित अनुकूलित किया गया था... अपने स्वयं के कट-ऑफ अंक निर्धारित"17, 24, ४८, ४९ "या 20 µ l से नमूना मात्रा में वृद्धि से १०० µ एल." 17, ४९ अंत में, विश्लेषणात्मक विशिष्टता और संवेदनशीलता (१००% प्रत्येक) विरोधी के लिए स्थापित एचआईवी का पता लगाने के बराबर या अंय immunoassays के प्रदर्शन विशेषताओं के लिए बेहतर थे विशेष रूप से डीबीएस परीक्षण के लिए अनुकूलित५०, ५१ "या एक stepwise कई विरोधी के संयुक्त उपयोग के साथ प्रक्रिया-एचआईवी परीक्षण "17,५२। "वे, वास्तव में, यह भी एक परख की है कि विशेष रूप से विकसित किया गया था और विरोधी डीबीएस eluates में एचआईवी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अनुकूलित के प्रदर्शन के रिकॉर्ड से अधिक (क्यू-एचआईवी 1 + 2 डीबीएस किट को रोकने)." 17, ५३  

एक साथ ले लिया, व्यापक कदम दर कदम इस संचार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तैयारी और डीबीएस प्रसंस्करण और कर सकते हैं, इस प्रकार, नैदानिक वायरोलॉजी में मज़बूती से इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक व्यवहार्य और उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण हो साबित कर दिया । यह स्वचालन ५४ का उपयोग और अपने उत्कृष्ट प्रदर्शन विशेषताओं के कारण दृष्टिकोण की अनुमति देता है नींव का एक प्रकार के रूप में सेवा की क्षमता है एक भविष्य के लिए आम तौर पर आम सहमति प्रोटोकॉल प्रयोगशाला में डीबीएस परीक्षण के वैश्विक क्षेत्र में स्वीकार किए जाते है दवा.

Disclosures

पूर्व में RSR को एबॉट डायग्नोस्टिक्स से अपने वैज्ञानिक कार्य के लिए व्याख्यान और वित्तीय सहायता वितरित करने के लिए मानदेय मिला था । एनजी और ओम की घोषणा है कि वे कोई विरोधी हितों की है ।

Acknowledgments

इस संचार के परिणामों के आधार पर पहले वायरोलॉजी जर्नल17 में ओपन एक्सेस मोड में क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) के रूप में BioMed केंद्रीय के साथ एक के रूप में प्रकाशित लाइसेंसधारी. लेखक कृतज्ञता अध्ययन "दवाओं और जीर्ण संक्रामक रोगों" ("DRUCK अध्ययन") यू. के. मार्कस, डब्ल्यू कै, डब्ल्यू जांग, और आर Zimmermann के साथ रॉबर्ट कोच-संस्थान (बर्लिन, जर्मनी) के साथ विमान का संचालन करने के ढांचे में उपयोगी सहयोग स्वीकार करते है और चित्रा 1 में इकट्ठे के रूप में अच्छी तरह से डी. एफ Whybrew, पीएच, (गौटिंगेन, जर्मनी) के लिए पांडुलिपि को सही करने के लिए तस्वीरें लेने के लिए एस Moyrer के लिए आभारी हैं । वे भी जे को कुशल तकनीकी सहायता के लिए अपनी प्रशंसा व्यक्त करते हैं । Ackermann, ई. Bayrambasi, यू. Büttner, एस. Dziubek, आई. Jakobsche, बी. Krellenberg, एच. Krohn, पी. Kusimski, ए. Metcalf, जे. Piejek, एस. साेऽ, एम. Schröter और के. Seidel. इस अध्ययन के हिस्से में स्वास्थ्य के जर्मन मंत्रालय के एक अनुदान द्वारा समर्थित था हेपेटाइटिस सी के लिए राष्ट्रीय संदर्भ केंद्र ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Latex rubber gloves Hartmann #4049500041515
70% isopropyl alcohol Bode Chemie #9768050
Mulifly safety cannula Sarstedt #85.1638
EDTA blood collection tube Sarstedt #02.1066.001
Adhesive bandage Hartmann #2994163
Dry gauze pad Hartmann #143213
Singel-use safety lancet Owen Mumford #3802421
Filter paper card Whatman/sigmaaldrich #10534612 Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips Starlab #S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag Flexico #20219
Mini desiccant bag Tropack #-
Disposable Punch pfmmedical #48601 6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps Servoprax #H7301
12 Well Cell Culture Plate Greiner #665180
PBS Buffer Gibco #14190-136
Tween 20 Applichem #A1389.0500
Sodium Azide Merck #66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf #30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative) Abbott #6C3642
ARCHITECT anti-HBc II Abbott #8L4425
ARCHITECT anti-HBs Abbott #7C1825
ARCHITECT anti-HCV Abbott #6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Abbott #4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit Roche #6374891001
artus HBV LC PCR Kit Qiagen #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD Siemens Healthcare #2554311

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References

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Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques. J. Vis. Exp. (97), e52619, doi:10.3791/52619 (2015).

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