Introduction
定量核酸扩增是用于检测环境，食源性和水生病原体，以及用于临床诊断的一项重要技术。实时定量聚合酶链反应（qPCR的）可以灵敏，特异和定量检测的核酸， 例如，HIV-1的病毒载量检测，检测的细菌病原体，并筛选许多其他生物体1的金标准方法- 3。在实时定量PCR，引物扩增在周期病原体的DNA和荧光信号被产生成比例的扩增的DNA的样品，在每个循环中的量。将含有未知浓度的病原体的DNA的样品可以使用涉及标准样品的初始DNA浓度和在该荧光信号达到一定的阈值的时间（ 即，循环阈值，或（C T））的标准曲线进行定量。
4。这些平台通常提供结果更快和扩增核酸在一个较低的，单一的温度，其可以实现与更便宜，更简单的设备。 RPA，其用于护理点的应用特别有吸引力的，放大的DNA在几分钟内，需要低放大温度（37℃），并且在杂质5,6存在下保持有效。 RPA试验已经开发了用于范围广泛的应用，包括食品分析，病原体检测，癌症药物筛选，并检测生物威胁因子7 - 12。然而，使用的RPA的用于核酸定量一直局限于13,14。
在以往的工作，这是笑WN的实时定量RPA（qRPA）是可行的15。这里，更详细的协议提供了一种用于使用实时定量RPA量化使用标准曲线中，一种方法使用qPCR即类似于量化未知样品。本协议描述了如何执行在热循环的RPA反应检测HIV-1 DNA作为概念证明的，以及如何开发一个内部阳性对照（IPC），以保证系统正常运行。使用热循环仪或显微镜和数据分析使用训练数据构建的标准曲线数据收集也详细叙述。最后，该方法用于定量用标准曲线与自定义脚本未知样品被证实。此qRPA技术使具有未知浓度的样品进行定量，并具有比传统的实时定量PCR的许多优点。
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Protocol
1.程序的实时qRPA反应的热循环仪
- 创建在热循环仪软件的新协议。
- 插入预孵育步骤：39℃，1分钟。
- 添加第二个步骤：39℃，20秒，接着是板读。
- 最后，插入一个“GO TO”，重复第二步59次以上。
- 保存的协议。
- 在软件的“板块编辑器”选项卡中创建一个新的板块。选择上板孔对应于RPA反应的位置（这里，利用井A1，A4-A8，B1和B4-B8）。
注：是否指定井（ 例如，“标准”，“NTC”）的样品类型，使用自定义脚本来完成数据分析并不重要。- 对于含有HIV-1 DNA只实验，选择“HEX”荧光所有井。对于含有HIV-1 DNA和内部积极合作实验ntrol，同时选中“HEX”和“FAM”荧光所有井。存盘。
2.准备HIV-1 qRPA实验
- 组装RPA反应在含有指定移液器，移液管尖端，涡流混合器，和微型离心机，作为用于定量PCR指定的前置放大工作区。如RPA可由幅度高达10个数量扩增DNA的单拷贝（数据未示出），处理和处置含有DNA后的扩增产物在一指定的后扩增区管。
- 防止所有预扩增试剂和扩增后的产品之间的接触。之前和所有实验后喷预放大工作空间和设备，用50％的漂白剂。用纸巾擦去多余的漂白剂。
- 购买正向引物序列5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'和反向引物序列5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TT牛逼GTT TTT G-3'从商业DNA合成。购买探针序列5'-TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [胸苷BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCCç-3'从商业渠道。存储在等份所有引物和探针在4℃以在使用之前为10μM的浓度存在。
注：qRPA法放大了独特的HIV-1的序列。用于概念验证的该试验中，使用由萨顿等人 ，其中包含与靶序列16描述的质粒pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr。对于qRPA实验中，质粒被保存在4℃，在含有在含10mM Tris，0.1毫摩尔EDTA在pH 8.0的缓冲液每μl的1，10，10 2，10 3，和10 4份等分试样，和1纳克/微升的人类基因组DNA的载体（360486）。该载体DNA浓度相当于从用于HIV-1的诊断17商用血清DNA提取试剂盒获得的DNA浓度。这些HIV-1稀释液用作qRPA反应的模板，以建立一个标准曲线。
3.装配的HIV-1 qRPA标准曲线
- 之前组装qRPA反应，如在步骤2.1.1中所述制备的预放大的工作区。放置在存储96孔冷块在4℃。
- 准备试剂12反应：
- 移动乙酸镁，补液缓冲液，和12 RPA反应粒料到预放大的工作区。
- 解冻的乙酸镁，在室温下再水化缓冲液中。
- 等分32.5微升乙酸镁（每反应2.5微升）到一个离心管中。
- 准备一个13倍母液。加入383.5微升补液缓冲液（每反应29.5微升），以一个单独的离心管中的主结构。添加41.6微升的核酸自由水（每反应3.2微升）的主结构。 VORTEX的主结构。
- 返回镁aceta德和再水化缓冲液储存于-20℃。
- 移动从冰箱到预扩增区域中的引物和探针的等分试样，从而避免过度曝光，以减少光漂白。
- 添加27.3微升各为10μM的正向和反向引物（每个反应的引物2.1微升）到主混合物。
- 加入7.8微升10μMHEX标记的HIV-1 DNA探针（每反应0.6微升）的主结构。
- 返回引物和探针存储。
- 匹配在1.2节中描述的板块布局，放置1酶颗粒中的每个最左边管和1酶颗粒在每2低层8孔PCR管带5极右管。
- 仔细增加37.5微升主混合物含有一种酶颗粒每管，采用了新的枪头每个管，轻轻地搅拌预混和球团用刀尖直到沉淀完全溶解。轻轻搅拌以防止泡沫formati，并小心地取出笔尖防止反应体积的任何损失。
- 毕竟酶颗粒已经水化与主结构，检索4℃保存96孔冷块。将PCR管带中冷块寒意的主结构。
- 而主混合物被冷却，装入热循环仪软件与协议和板在第1节中所述。
- 切成2片的透明塑料微密封粘合剂为比PCR管稍宽，并检索2扁平PCR管条盖。
- 从存储器中检索模板6等份（含有的每微升的HIV-1的质粒0，1，10 1，10 2，10 3，或10 4个拷贝）。
- 加入10微升每个模板，以指定的模板浓度管。使用新的枪头，每个管，轻轻搅动以尖端混合主结构和模板的解决方案。请务必将模板添加到正确的位置，以米ATCH第1.2节中描述的平板布局。
- 确保PCR管带适配器的离心到位。
- 分配2.5微升乙酸镁进每个管盖，将被放置在含有qRPA反应的管。
- 轻轻地放在盖子上的PCR管，使得它们没有完全密封的，并且可以被去除的顶部。乙酸镁将坚持盖和清晰可见从上面。
- 插入每个PCR管中带材用盖子到PCR管夹持器的每一侧。关闭minifuge的盖，旋乙酸镁出盖子并进入RPA反应，引发RPA反应。离心直至所有气泡被消除，并且所有的液体被收集在每个管（约10秒）的底部。
- 快速去除PCR管条，并将其返回到冷块停止qRPA反应。
- 小心取下盖子，以防止气溶胶的形成和密封每个PCR管带用切个明确的微密封膜。
- 快速步行到热循环仪并加载两个PCR管带成相匹配的板布局（井A1-B8）的位置的热循环仪。关闭热循环仪的盖子，然后单击“开始→运行”，并指定一个文件名实验。
注意：虽然在制造商建议5分钟温育后，搅拌该样品，该步骤不是必需为这个特定测定和可被省略。 - 运行完毕后，选择“设置”，“基线设置”，“没有基线减法”，以显示原始荧光数据。通过选择将数据导出到一个电子表格程序“导出”，“导出所有数据表到Excel中。”A文件增编“定量扩增结果”将创建包含原始的实时荧光数据。
4.制定一个内部阳性对照
- 选择从一个物种，是不太可能的目标样品中被发现的DNA序列。该序列需要比目标扩增子得较长，以便产生靶序列的是有利的。
注意：对于这个测定法中， 小隐孢子虫 ，肠寄生虫，被选为充当模板用于产生对IPC序列，因为这种微生物是不太可能在血液中被发现并且是可在从另一项目中的实验室。要生成IPC序列，提取和纯化C. DNA 孢子虫卵囊其他地方18所描述。 - 购买前（5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'）和反向（5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA-3'）从商业来源获得的引物。在该试验中所使用的IPC的PCR引物示于图1，并包含一个区域是互补的IPC的模板ðNA（ 例如，微小隐孢子虫 ，紫色在图1）和一个区域是互补的靶生物（ 例如，HIV-1，蓝色于图1）。
- 进行PCR使用引物和IPC模板DNA。
- 组装根据制造商的说明使用的Phusion高保真DNA聚合酶试剂盒的试剂50μl的PCR反应，但不包括聚合酶。使用2微升DNA模板的Phusion缓冲HF的。
- 添加的Phusion聚合酶到每个反应热启动在98℃，接着60秒，在98℃，随后通过15秒的40个循环后，在98℃，30秒，62℃，和30秒72℃下用在72℃最终延伸5分钟。热循环后，保持在4℃的样品。
- 分析通过凝胶电泳的样品在2％TAE琼脂糖凝胶上，然后提取和使用根据微量协议附带QIAquick凝胶提取试剂盒纯化DNA试剂盒中。
- 屏幕IPC候选人为他们的使用qRPA放大能力。
- 准备qRPA反应，如在第3节所述，使用HIV-1引物，一个FAM标记探针具体到IPC（5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [胸苷BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA甲-3'），以及总共0，10，10 2，10 3，10 4或10 5个拷贝每反应各IPC的候选，检验所有浓度一式两份的。
- 选择IPC候选人，放大最一致，并具有最低的极限的检测。
- 共扩增的HIV-1和IPC来确定的IPC DNA的最佳浓度。
- 类似于第3节，结合下面的每50微升反应：29.5微升的补液缓冲区，2.1微升正向引物[10μM]的RPA的，2.1微升RPA的反向引物[10μM]，0.6微升的HIV-1 HEX标记的探针[10μM]，10微升HIV-1的DNA的不同浓度，2.5微升乙酸镁，以及1酶沉淀。代替加入3.2微升不含核酸酶的水作为在步骤3.2.4完成，加入0.6微升的IPC FAM标记的探针[10μM]的，和2.6微升的IPC的DNA。使用IPC浓度是极限- - 的检测限（LOD）时qRPA与IPC DNA的单独（定义为最低浓度，其中荧光信号的产生的量是大于由通过与样本产生的荧光所产生的LOD执行没有目标DNA）。
- 孵育使用1.1节中描述的协议的样品。
- 如果IPC不每个样品中扩增，考虑重复实验幅度更高的IPC浓度一个数量级。 IPC DNA的HIV-1检测的最佳浓度为10000拷贝/微升。虽然样本被认为是有效的，如果有任何IPC或HIV-1 DNA扩增，理想的IPC具有检测扩增每一个反应。
5.建立来自多个实验标准曲线
- 确保数据在第3.13节描述的每个实验已出口到电子表格程序。
- 打开并运行脚本“JoVE_qRPA_standard_curve.m”。所有的输入会自动提示，在命令窗口。被启动的脚本后，用户被自动提示指定“的数据文件数”用于构建标准曲线。
- 在命令窗口中，键入要使用的文件的数量来构建标准曲线，然后按回车。
- 在命令窗口中键入的样本数和重复在每个训练文件数（按下每个条目后进入）。
注：在1.2节中描述的板布局，有6个样品不同浓度和2次重复每个样品）。 - 请在命令窗口中最低的DN用于构建标准曲线（以log10拷贝），然后按回车浓度（在1.2节中描述的板块布局，最低模板浓度为1 log10拷贝）。
- 在命令窗口中输入每个标准间的浓度差（以log10拷贝），然后按回车键（在1.2节中描述的板块布局，集中时间间隔为1 log10拷贝）。
- 提示后，请在命令窗口中的“斜率阈值”，然后按Enter。
- 在命令窗口中，键入“号（Z）的背景正阈值以上的标准偏差”，然后按回车键。典型值z范围从1至5。
- 指定使用热循环仪（'1'）中的数据是否被收集，* .TIFF显微镜图像（'2'），或* .JPG显微镜图像（'3'），通过输入数字“1”，“2”，或'3'和对ressing进入。
- 选择设置新的门槛IPC或键入分别为'Y'或'N'，出现提示时使用的阈值的默认值。
- 接下来，选择每个用于构建标准曲线的电子表格文件。
注：随后，脚本会自动导入HEX和FAM荧光数据;确定各反应是否是有效的（ 即，无论是荧光信号超过阈值，HEX或FAM通道）;确定第r 2系数的指数，线性和二阶多项式拟合;暗算“log10拷贝与循环门槛”，每用于构建标准曲线样品;并创建包含基本变量来重建标准曲线进行验证实验，而不需要用户重新输入所有输入参数的再一个电子表格文件。
6.试验验证和未知样品使用的量化标准曲线
- 使用的脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”通过使用样品与已知浓度来估计测定的精度和准确度，或用它来量化样品与未知浓度。
注：因为之前发表的报告显示，指数拟合得到最好的R平方系数18，这个脚本利用一个指数拟合的标准曲线。如果不同类型的合适的是理想的，该脚本可以被相应地修改。- 打开并运行脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”。启动脚本后，该用户将自动提示输入所有输入到命令窗口。
- 输入“1”用标准曲线与已知样品的浓度来验证试验或输入“2”量化未知样品。
- 当系统提示，要么选择一个保存的标准曲线或进入日建一个新的E资料是在命令窗口中自动搜罗（即所需“JoVE_qRPA_standard_curve.m”剧本从第5相同的信息）。
- 类型的实验数量（ 即电子表格文件）来分析进行验证/定量。
7.筹备数据收集使用荧光显微镜和加热芯片
- 确保荧光显微镜有一个阶段，加热器和1通道，高精度，高稳定性温度控制器到位。
- 确保荧光显微镜有一个过滤器立方体激发并从每个荧光收集荧光。激发和收集通过GFP过滤器（激发BP四十分之四百七十○纳米，发射BP五十〇分之五百二十○纳米）IPC DNA扩增过程中产生的FAM荧光。激发和收集通过HEX过滤器（BP激发波长530/30，排放BP40分之575nm）的HIV-1 DNA扩增过程中产生的HEX荧光。
- 使用显微镜脚本编辑软件来创建一个自动算法来复制的热循环仪的数据收集。
- 第一插入一个“设置”步骤以关闭快门。下一步添加一个“曝光”一步曝光设置为60秒。将“捕捉”执行60秒的延迟，它实现了1分钟前的潜伏期。添加一个“设置”步骤的工作组更改为GFP过滤器。插入另一张“暴露”的步骤来调整曝光，以200毫秒。使用GFP或HEX滤波器立方体所有曝光将被设置为200毫秒。
- 之后，“曝光”的步骤，添加一个“快照”，指定该图像将采取相机。使用另一个“设置”的步骤，关闭快门和“保存图像”的步骤将图像保存到一个用户定义的临时文件夹。
- 使用另一个“设置”的步骤和TH接下来切换到HEX过滤立方体恩添加“曝光”在200毫秒，一个“快”和“保存图像”的步骤。
- 重复此过程59次20秒而不是60（靠近快门的初始延迟，等待20秒，切换到GFP滤块，设置曝光为200毫秒，扣，关闭快门，保存，切换到HEX滤块，设置曝光至200毫秒，SNAP）。
- 创建一个芯片将举行qRPA反应。
- 为使用显微镜的实验中，使用文件JoVE_qRPA_base.ai于使用激光切割器设定为100％的功率，10％的速度从1/8“厚的黑色丙烯酸树脂的片材切割为40×15毫米矩形基。
- 使用文件JoVE_qRPA_well.ai切割反应以及由一个10×10平方毫米的具有从1.5毫米厚的透明的丙烯酸片材一个5mm直径的圆形孔切割。
- 连上三个井用强力胶凝胶一个基地。
- 干燥过夜。
8.数据收集和ANALYSIS使用荧光显微镜
- 通过装载自动数据收集脚本JoVE_AxioVision_Script.ziscript准备显微镜进行数据收集。
- 设置阶段加热器至48℃和预热上段加热器的反应芯片为约20分钟。 48℃的温度设定保持39°C的反应以及温度（数据未显示）。
- 使用10X，0.45 NA物镜，着眼于反应很好地与代替GFP过滤器的内边缘的顶部。丙烯酸类的边缘激光切割后自身荧光，并且可以很容易地可视化。对焦后，不调整显微镜阶段的高度，直到所有的数据收集。
- 组装qRPA预混在指定的前置放大工作区，如步骤4.5.1描述。对于每个样本，混合酶颗粒，主控组合，并在离心管中HIV-1 DNA模板。加入2.5微升的醋酸镁至第一reaction和简要旋涡。
- 迅速输送含有qRPA样品荧光显微镜的离心管中。
- 认真吸取30微升的RPA反应到反应良好，没有产生气泡。放置一滴的PCR级矿物油在RPA反应以防止蒸发。
- 定位以及直接的显微镜物镜下，注意图像只有中央的很好，没有任何自动荧光亚克力边缘。井被定位后，运行自动化的脚本7.脚本中使用FAM过滤立方体和使用HEX滤块每20秒1 JPEG图像生成一个JPEG图像。
- 剧本完成后，运行其他样品之前，这些转移出来的图像临时存储文件夹中。
- 每个荧光基团（ 即 “十六进制”和“FAM”）1：创建2个文件夹。存储在同一个父文件夹这两个文件夹。在每一个荧光文件夹中创建标记存在于样品（ 例如，0，10，等等 ）中的DNA拷贝数的文件夹。
- 转移的前缀“HEX”所有文件到相应的子文件夹中的“HEX”文件夹中。转移在“FAM”文件夹中的前缀“GFP”进入相应的子文件夹中的所有文件。
- 对于qRPA反应以0，10，10 2，10 3，10 4，和10 5的HIV-1 DNA拷贝重复部分8.2-8.4。
- 收集在一个实验中所有样品qRPA数据后，加载脚本“JoVE_real_time_intensity_to_excel.m。”当脚本提示时，选择含有2荧光的文件夹，这反过来又包含子文件夹中的每个浓度的图像的父文件夹。
注：该脚本将自动生成在其中HEX荧光数据将被保存在一个表南的父目录中的电子表格文件主编“HEX”，和FAM荧光数据将被保存在一个名为“FAM”表。在每个片材中，循环数被列在B列，和用于增加模板的浓度的实时荧光数据中列C，D 等中给出。每个实时荧光数据是在该时间点拍摄的图像的平均荧光强度。 - 使用默认的散点图功能的电子表格程序绘制单元格B2：在“HEX”和“FAM”片H61形象化实时荧光并产生图类似于图2A，2B，3A和3B。
注：在步骤8.6中产生的电子表格，也可以在脚本“JoVE_qRPA_standard_curve.m”和“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”使用。
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Representative Results
选择一个序列作为IPC在qRPA实验目标之前（HIV-1）的DNA，内部阳性对照（IPC）的候选人中产生和筛选它们放大的qRPA反应无HIV-1 DNA存在的能力。 IPC考生比目标（HIV-1）的DNA，以防止出竞争的HIV-1扩增子形成IPC形成更长的时间。 如图2A所示 ，两个C的代孢子虫 IPC候选人是由使 用凝胶电泳415和435 bp的条带的存在验证。在qRPA反应，较短的IPC候选呈现小的扩增（ 图2B），而较长的候补一致扩增时共有10 4和10 5个拷贝人出席（ 图2C）。因此，时间越长候选人被选为了IPC的HIV-1 qRPA实验。
实时qRPA可以使用感兴趣的靶单独使用或使用来执行两个目标和IPC。 图3示出了使用两个HIV-1的DNA和C.关于热循环仪的实验孢子虫 IPC。在该实验中，2.6×10 4个拷贝的IPC的DNA被加入到每个反应中，浓度接近检测IPC的限制，以避免影响检测HIV-1的靶DNA的限制。这表现在图3A中，其中显示对应于实时的HIV-1的DNA产生的HEX荧光数据，可检测的扩增开始的时间是反比于初始靶浓度。因此，放大明显较早的高浓度的HIV-1 DNA和以后的低浓度的HIV-1 DNA。与此相反，IPC的DNA检测的扩增在大约开始的同时，因为起始的IPC浓度在所有样品中相同的， 如图3B所示 ，其中显示吨在对应于IPC的DNA产生的FAM荧光数据他同样的实验。荧光产生由IPC的速率成反比的HIV-1的DNA的浓度由于扩增过程中的竞争。
与发展与qRPA反应的字段可操作的荧光读取器的目标，qRPA实验可以在与一个段加热器和1通道，高精度高稳定性温度控制器直立荧光显微镜下进行。 图4A和4B显示HEX和FAM荧光数据采集在显微镜。使用激光切割片收集在显微镜的数据表明在基线荧光和波峰和波谷，可能是由于光漂白轻微变性。然而，该脚本确定利用荧光的变化率在初始扩增期，这是不受在荧光基线荧光或变异发生在初始放大后的循环阈值。正如在网络古尔4C，绘制标准曲线，从该实验中构建具有0.990的R 2系数。值得注意的是，在IPC仅对于低浓度的HIV-1的DNA的扩增。虽然此行为不同于在热循环仪进行的实验中，使用该方法的所有样品都仍然分类为有效。
使用已知浓度的目标从多个实验数据可以被编译来构建标准曲线，然后可将其用于评估测定性能或量化样品与未知浓度。 图5示出了从五个实验和指数的标准曲线使用脚本生成的数据“JoVE_qRPA_standard_curve.m”，与最初的HIV-1的靶的浓度，以在该可检测的扩增开始的时间。 图5中使用5个独立的实验中，每个包含2 qRPA反应在每个模板浓度来构建标准曲线。需要注意的是指数适合有0.959高R 2系数。标准曲线，然后用于使用脚本“JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”脚 本。 表1示出定量结果，使用标准曲线在图5中5个附加的实验来预测与已知浓度的测定法验证另外的样品的浓度。需要注意的是算法正确分类含的HIV-1 DNA作为阳性和9个10无靶对照组样品为阴性的所有样品。此外，该平均的预测浓度是正确的浓度的大小和预测的浓度的标准偏差中的一个命令是小于0.5 log10的（每个反应份）范围内。
图1：定量RPA DNA目标框图的QRP一个检测放大由相同的序列两侧两个DNA序列，其中引物结合（“RPA前进”和“RPA反转”）。该扩增的序列是：1）中的HIV-1的基因组中（“HIV-1”的序列），该被检测的“HIV-1的探针”和2）的内部阳性对照序列（为“IPC（ 微小隐孢子虫 ）”。）包括在检测到与每个反应为“IPC探针。”该IPC的是使用微小隐孢子虫基因组作为模板和引物（“PCR正向”和“反向PCR”），包含互补于C的区域通过PCR产生孢子虫 （紫），并补充到HIV-1（蓝色）的区域。图最初发表在分析化学2014年，转载这里与权限9。
图2：
图3：在共安培产生典型的原始荧光数据lification的HIV-1 DNA和IPC在热循环。（A）对HIV-1，检测放大的发作，在HEX荧光的明显增加表明，早期出现高浓度的HIV-1 DNA。 （b）对于IPC的，可检测的扩增，通过在FAM荧光的明显增加所示的发作，发生在大约相同的时间，无论在HIV-1的DNA的浓度。然而，FAM荧光产生的速率成反比的HIV-1的DNA的存在量由于竞争。图最初发表在分析化学2014年，转载这里与权限9。
图4：在共扩增的HIV-1 DNA和IPC在显微镜生成的典 型的原始荧光数据（A）类似在T生成的数据。他热循环仪中，发病可检测的HIV-1扩增，通过以HEX荧光的明显增加所示，较早出现于高浓度的HIV-1的DNA。 （B）IPC放大的显微镜，通过荧光FAM显示，在高HIV-1 DNA样本浓度低HIV-1 DNA浓度明显，但并不总是显而易见的。 （C）的标准曲线可以利用能够产生一个高的R 2系数的JoVE_standard_curve.m脚本来建立。
图5：对HIV-1的典型标准曲线使用JoVE_standard_curve.m脚本，在HIV-1的扩增产生的原始的HEX荧光数据进行处理，以建立一个标准曲线，其可用于预测未知的HIV-1的DNA的浓度样品。此标准曲线（Z = 1），使用由5 experim数据生成需求测试，其中6浓度用2次重复每个浓度测试。所有浓度中给出log10拷贝。图最初发表在分析化学2014年，转载这里与权限9。
图6：算法可调谐的调整算法的参数改变用于预测未知样品的浓度标准曲线。该JoVE_validation_and_quantification.m脚本是用来预测使用Z = 1（红色）和z = 5（蓝色）未知样品的浓度。所有浓度中给出log10拷贝。预测是更精确的低的DNA浓度当z = 1;预测是更加准确当z = 5，通过调整算法参数，qRPA标准曲线可根据临床需要调谐高的DNA的浓度。人物最初发表在分析化学2014年，这里许可转载9。
| 样品浓度 | 平均预测浓度 | 标准差 | 样品被鉴定为阳性的百分比 |
| 没有目标控制 | 0.1 | 0.3 | 10％ |
| 1 | 0.9 | 0.1 | 100％ |
| 2 | 2.2 | 0.5 | 100％ |
| 3 | 3 | 0.1 | 100％ |
| 4 | 3.7 | 0.1 | 100％ |
| 五 | 4.2 | 0.2 | 100％ |
表1：HIV-1 qRPA实验验证使用standa。在图4中的RD曲线，该JoVE_validation_and_quantification.m脚本是用来预测样品的浓度（log10拷贝）为5个附加实验。表最初发表在分析化学2014年，转载这里与权限9。
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Discussion
为了获得使用MATLAB算法有意义的量化数据，系统提示时，用户必须选择合适的输入值。开始在第5和第6的每个脚本之后，所有的输入变量自动征求在命令窗口中，并自动生成输出。在第5.7节中提示用户选择斜率阈值。的斜率阈值影响契合的相关系数（R 2）的平方。当使用从热循环仪导出原始荧光数据，在2.0和5.0的值趋向于产生高R 2系数。在第5.8节，用户必须指定背景以上的标准偏差的数量来设置正阈值。得分的样品为阳性或阴性，该脚本自动确定使用从THERMA导出的原始荧光数据的最大和最小荧光各样品之间的差Δ 样本升循环仪。它计算平均差Δ 背景和标准偏差σ 背景对于所有无目标的对照样品。样品被认为是阳性的，如果Δ 样本是大于Z×σ 背景之上Δ 背景 。在第5.10节用户决定是否使用默认的阈值或设定新的门槛。如果用户希望设置一个新的阈值，通过实验进行3个实验各自含有12 RPA反应，没有任何的HIV-1的DNA本确定新的阈值。从这些实验中加3个标准差中的荧光强度的平均增加设置的阈值。在完成第6节之后，脚本JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m自动返回每个qRPA反应估计DNA浓度（log10拷贝）。如果脚本确定没有HIV-1的DNA是存在于样品中，所估计的浓度被列为要么“氖gative艾滋病“或”无效的“，这取决于是否有荧光信号的内部阳性对照超过阈值（Z×σ 背景 +Δ 背景 ）。如果用户被验证的标准曲线与已知样品的浓度，该脚本也将返回类似于表1的一个额外的表。
为了开发一个实时RPA检测，提供准确的定量，实验的一致性是至关重要的。例如，使用相同的引物和探针的等分试样为标准曲线和验证实验。还通过存储所述引物和探针的等分试样于4℃下的实验之间，而不是-20℃下避免反复冻融。用于标准曲线和验证实验模板等分试样存储在相同的方式进行。 RPA酶颗粒和试剂从同一批是根据制造商的建议使用。最后，贝科使用RPA缺乏真正的'循环'来精确地控制扩增的速度，用户的步骤标准化是绝对必要的。当装配反应中，用户必须总是按照相同的顺序相同的步骤，在每个步骤花费大约相同的时间量。反应必须始终与一个新的枪头轻轻混合，和气泡必须被淘汰。扩增前，反应必须在一个一致的温度下保持，并且在热循环仪或显微镜软件必须始终装载反应，以避免在亚最佳温度可能影响量化任何放大之前制备。任何变化在初始反应条件可能会导致不一致的实验结果。
当用显微镜收集数据，附加变量必须加以控制，以尽量减少变化的荧光强度。所有反应必须放置在台上温暖的相同区域，以及microscoPE必须集中在该井的每一个样品的相同区域。即使这些做法都跟着，收集在荧光显微镜的数据可能会出现变化，由于当地的亮点，在RPA反应，在反应室形成气泡，或漂白反复暴露于激发光产生的自然形成。这些变量的影响是在收集在显微镜（ 图4A和4B）的荧光的数据，这表明基线变异性，峰和波谷明显。这些特征是从收集在热循环仪（ 图3A和3B）的荧光数据不存在。最终，在显微镜收集数据是用于证明型的原则只宗旨和最终测定将在更精确的几何形状和软件控制，最大限度地减少这些变量的字段可操作的荧光读取器来实现。
另一个重要的在qRPA检测开发过程中的一个方面是数据处理的一致性。在方法部分中描述的协议使用脚本来处理从热循环仪或显微镜采集的原始荧光数据（存储在电子表格文件）。用于构建标准曲线所有实验必须在相同的格式。当使用热循环仪来收集数据，相同的板的布局，必须使用，并且从井的数据不包含RPA反应不能导出。当用显微镜收集数据，该数据的格式，必须从热循环仪自动导出的数据的格式相匹配。例如，没有目标，控制数据必须是在小区C2：C61，和数据用于增加模板的浓度必须在单元格D2：D61，E2：E61， 等等。如果有各浓度在实验中多次重复，第二届复制稀释系列必须订购从左至右无靶对照（NTC），以最高浓度和立即向1日的右侧保存在列复制稀释系列。例如，在用于第1.2节用2板布局复制对每个样品，荧光数据中的稀释系列各样品的第一复制必须保存在小区C2：H61和荧光数据对每个样品中的第二复制稀释系列必须保存在细胞I2：N61。对于第1.2节所用的板布局，这是默认的热循环仪软件到电子表格导出数据时格式化。
从HIV-1 qRPA试验提供有代表性的数据表明概念证明那RPA可用于核酸浓度未知样品的定量支持。临床上有用的HIV-1病毒负荷测试具有临床范围中的至少4个数量级，0.5 log10拷贝精度，以及一个极限-的检测中的至少200个拷贝19,20。描述的HIV-1 DNA检测符合这些CRiteria并且是最准确的低浓度，如表1所示。因此，与包含逆转录酶的步骤，这些结果表明，一种HIV-1的RT-RPA试验可能必须测量HIV-1的病毒载量的可能性临床样本。当开发一个qRPA测定中，调整算法参数可以调谐根据临床需要的灵敏性和线性动态范围， 图6示出了调整Z（一个参数，用于确定所述阈值对于阳性样品）可以在低温和高温的影响的灵敏度和精度目标浓度。此外，有可能通过孵育反应在较低的温度或使用更少的乙酸镁，由此降低扩增的速率增加量化的分辨率和精度。
的概念qRPA测定这证明可用于量化含有HIV-1的DNA样品的浓度。在这马中描述的qRPA分析nuscript包括关于如何组装即时RPA反应，开发和筛选一个IPC，并且处理原始荧光数据建立一个标准曲线，可用于定量未知样品的详细说明。与详细的说明包括在内，该协议可以适于量化DNA浓度在各种各样的样品。
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Acknowledgments
该研究是由来自比尔和梅林达·盖茨基金会通过大挑战全球健康计划的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qRPA Assay | |||
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
- Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).
