Introduction
Quantitative amplificazione degli acidi nucleici è una tecnica importante per il rilevamento di ambientale, di origine alimentare, e gli agenti patogeni di origine idrica, nonché per la diagnostica clinica. Real time PCR quantitativa (qPCR) è il metodo gold standard per il rilevamento sensibile, specifico e quantitativa degli acidi nucleici, ad esempio, per l'HIV-1 test di carica virale, il rilevamento di batteri patogeni, e lo screening per molti altri organismi 1 - 3. Durante tempo reale qPCR, primer amplificano patogeno DNA in cicli, e un segnale fluorescente viene generato che è proporzionale alla quantità di DNA amplificato nel campione ad ogni ciclo. Un campione contenente una concentrazione sconosciuta di DNA patogeno può essere quantificato utilizzando una curva standard che riguarda la concentrazione di DNA iniziale di campioni standard e il momento in cui il segnale fluorescente raggiunge una certa soglia (cioè, la soglia ciclo o C T).
4. Queste piattaforme genere forniscono risultati più rapidi e amplificare acidi nucleici a singolo temperatura inferiore, che può essere realizzato con meno costoso, attrezzature semplici. RPA, che è particolarmente interessante per applicazioni point-of-care, amplifica il DNA in minuti, richiede una temperatura bassa di amplificazione (37 ° C), e rimane attiva in presenza di impurità 5,6. Saggi RPA sono stati sviluppati per una vasta gamma di applicazioni, tra cui l'analisi degli alimenti, degli agenti patogeni, lo screening di farmaci antitumorali, e la rilevazione di agenti biothreat 7-12. Tuttavia, l'uso di RPA per la quantificazione degli acidi nucleici è stata limitata 13,14.
In lavori precedenti, è stato shown che in tempo reale RPA quantitativa (qRPA) è fattibile 15. Qui, un protocollo più dettagliata per l'utilizzo in tempo reale quantitativa RPA quantificare campioni sconosciuti utilizzando una curva standard, un metodo che è analogo a quantificazione utilizzando qPCR. Questo protocollo descrive come eseguire una reazione RPA su un termociclatore per rilevare HIV-1 DNA come un proof-of-concept, e come sviluppare un controllo positivo interno (IPC) per garantire che il sistema funzioni correttamente. La raccolta dei dati utilizzando un termociclatore o microscopio e analisi dei dati per la costruzione di una curva standard utilizzando i dati di formazione è anche dettagliato. Infine, il metodo per quantificare i campioni sconosciuti utilizzando la curva standard con uno script personalizzato è dimostrata. Questa tecnica consente qRPA quantificazione dei campioni con concentrazioni sconosciute e ha molti vantaggi rispetto tradizionale in tempo reale qPCR.
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Protocol
1. Programmare l'apparecchio per PCR in tempo reale Reazioni qRPA
- Creare un nuovo protocollo nel software termociclatore.
- Inserire una fase di pre-incubazione: 39 ° C per 1 min.
- Aggiungere una seconda fase: 39 ° C per 20 sec seguita da una lettura piatto.
- Infine, inserire un "go" che ripete il secondo passo 59 volte.
- Salvare il protocollo.
- Creare una nuova piastra nella scheda "Editor piatto" del software. Selezionare pozzetti sulla piastra corrispondenti alle posizioni delle reazioni RPA (qui, l'uso di pozzi A1, A4-A8, B1 e B4-B8).
NOTA: Non è importante se il tipo di campionamento dei pozzi (ad esempio, "Standard", "NTC") è specificato, come l'analisi dei dati viene effettuata utilizzando uno script personalizzato.- Per gli esperimenti che contengono solo HIV-1 DNA, selezionare il fluoroforo "HEX" per tutti i pozzetti. Per gli esperimenti contenenti HIV-1 DNA ed un co interna positivantrol, selezionare sia "HEX" e fluorofori "FAM" per tutti i pozzetti. Salvare la piastra.
2. Preparare per gli esperimenti di HIV-1 qRPA
- Montare reazioni RPA in uno spazio di lavoro di pre-amplificazione designato contenenti pipette designati, puntali, vortex, e mini-centrifuga, come per qPCR. Come RPA può amplificare una singola copia di DNA di ben dieci ordini di grandezza (dati non mostrati), gestire e smaltire provette contenenti prodotti DNA pubblicare amplificato in una zona post-amplificazione designato.
- Evitare il contatto tra tutti i reagenti pre-amplificazione e prodotti post-amplificazione. Spray aree di lavoro e le attrezzature con 50% di candeggina pre-amplificazione prima e dopo tutti gli esperimenti. Usare un tovagliolo di carta per asciugare l'eccesso di candeggina.
- Acquisto sequenza primer forward 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA AAG GAA G-3 'e invertire la sequenza di primer 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'da sintetizzatori DNA commerciali. Acquista la sequenza della sonda 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 'da fonti commerciali. Conservare tutti primer e sonde a 4 ° C in aliquote a una concentrazione di 10 mM prima dell'uso.
NOTA: Il test qRPA amplifica un unico HIV-1 sequenza. Per questo test proof-of-concept, utilizzare il plasmide pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr descritto da Sutton et al., Che contiene la sequenza bersaglio 16. Per gli esperimenti qRPA, il plasmide è stato conservato a 4 ° C in aliquote contenenti 1, 10, 10 2, 10 3 e 10 4 copie per microlitri in un tampone contenente Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM a pH 8,0 e 1 ng / microlitri DNA umano genomico carrier (360.486). Questa concentrazione vettore DNA è equivalente alla concentrazione DNA ottenuto dal kit di estrazione di DNA siero commerciali utilizzati per HIV-1 di diagnosi 17. Questi HIV-1diluizioni sono stati utilizzati come modelli nelle reazioni qRPA per costruire una curva standard.
3. Montare un HIV-1 qRPA Curva Standard
- Prima di montare le reazioni qRPA, preparare l'area di lavoro di pre-amplificazione come descritto al punto 2.1.1. Posizionare un blocco a 96 pozzetti freddo in conservazione a 4 ° C.
- Preparare i reagenti per 12 reazioni:
- Spostare il magnesio acetato, il buffer di reidratazione, e 12 CPT pellets di reazione al lavoro pre-amplificazione.
- Scongelare l'acetato di magnesio e il buffer reidratazione a temperatura ambiente.
- Aliquota 32,5 ml di acetato di magnesio (2,5 microlitri per reazione) in una provetta.
- Preparare una miscela 13x master. Aggiungere 383,5 ml di buffer di reidratazione (29,5 ml per reazione) in una provetta separata per il master mix. Aggiungere 41,6 ml di acqua priva di nucleasi (3,2 microlitri per reazione) per il master mix. Agitare il master mix.
- Restituire il aceta magnesiote e reidratazione buffer per la conservazione a -20 ° C.
- Spostare i primer e sonda aliquote dal frigorifero alla zona di pre-amplificazione, evitando l'esposizione alla luce per ridurre al minimo photobleaching.
- Aggiungere 27,3 ml ciascuno dei 10 micron in avanti e indietro primer (2,1 microlitri per fondo per reazione) al master mix.
- Aggiungere 7,8 ml di HIV-1 sonda di DNA HEX-marcato 10 micron (0,6 microlitri per reazione) per il master mix.
- Ritorno primer e sonda di stoccaggio.
- Adattamento del layout di piastra descritto nella Sezione 1.2, posizionare 1 enzima pellet in ognuna delle provette estrema sinistra e 1 enzima pellet in ognuna delle 5 tubi di estrema destra di 2 a vita bassa e 8-strips tubo PCR.
- Aggiungere con cautela 37,5 ml di master mix per ogni provetta contenente un pellet enzima, utilizzando un nuovo puntale per ogni tubo e mescolando delicatamente la master mix e pellet con la punta fino a quando il pellet sia completamente dissolto. Mescolare delicatamente per evitare Formati bollaon, e rimuovere accuratamente la punta per prevenire qualsiasi perdita di volume di reazione.
- Dopo che tutti i pellet enzimi sono stati reidratati con il master mix, recuperare il blocco a 96 pozzetti a freddo dal 4 ° C di stoccaggio. Mettere le strisce tubo PCR nel blocco freddo per raffreddare il master mix.
- Mentre il master mix sta raffreddando, caricare il software termociclatore con il protocollo e la piastra descritto nella Sezione 1.
- Tagliare 2 strisce di adesivo trasparente micro-sigillo di plastica per essere leggermente più larga delle provette PCR, e recuperare 2 TV PCR coperchi striscia tubo.
- Recupera 6 aliquote modello da stoccaggio (contenenti 0, 1, 10 1, 10 2, 10 3, 4 o 10 copie del virus HIV-1 plasmide per microlitro).
- Aggiungere 10 ml di ogni modello per i tubi designate a tale concentrazione modello. Utilizzare un nuovo puntale per ogni tubo, mescolando delicatamente la soluzione con la punta per mescolare il master mix e il modello. Assicurarsi di aggiungere il modello nella posizione corretta per mATCH il layout di piastra descritto nella Sezione 1.2.
- Assicurarsi che una scheda striscia tubo PCR per la microcentrifuga è a posto.
- Dispensare 2,5 ml di acetato di magnesio in ogni coperchio tubo che sarà posto su un tubo contenente una reazione qRPA.
- Posizionare delicatamente i coperchi sopra dei tubi PCR tale che essi non sono completamente sigillate e possono essere rimossi. Il magnesio acetato aderirà alla coperchi ed essere ben visibile dall'alto.
- Inserire ogni striscia tubo PCR con coperchi in ogni lato del supporto tubo PCR. Chiudere il coperchio del minicentrifuga per ruotare il magnesio acetato di coperchi e nella reazione RPA, iniziare la reazione RPA. Centrifugare finché tutte le bolle vengono eliminati e tutto il liquido viene raccolto sul fondo di ciascun tubo (10 sec).
- Rimuovere rapidamente le strisce tubo PCR e restituirli al blocco freddo di fermare le reazioni qRPA.
- Rimuovere con cautela i coperchi per evitare la formazione di aerosol e sigillare ogni striscia provetta PCR con il tagliopezzi di pellicola trasparente micro-seal.
- Camminare velocemente al termociclatore e caricare le due strisce tubo PCR nel termociclatore nelle posizioni corrispondenti al layout di piastra (pozzetti A1-B8). Chiudere il coperchio del termociclatore, fare clic su "Start Esegui" e designa un nome di file per l'esperimento.
NOTA: Sebbene il produttore raccomanda agitazione campione dopo 5 minuti di incubazione, questo passo non è necessario per questa particolare dosaggio e può essere omesso. - Dopo la corsa è stata completata, selezionare "Impostazioni", "Baseline Impostazione", "No Baseline Sottrazione" per visualizzare i dati grezzi di fluorescenza. Esportare i dati in un foglio di calcolo selezionando "Export", "Esporta tutte le schede tecniche di Excel." Un file con l'addendum "Risultati Quantificazione amplificazione verrà creata" contenente i dati grezzi di fluorescenza in tempo reale.
4. Sviluppare un controllo positivo interno
- Selezionare una sequenza di DNA da una specie che è improbabile che si trovano nel campione di destinazione. La sequenza deve essere più lungo del amplicone bersaglio in modo che la generazione della sequenza bersaglio è favorita.
NOTA: Per questa analisi, Cryptosporidium parvum, un parassita intestinale, è stato scelto per servire come modello per la generazione della sequenza di IPC, perché questo organismo è improbabile che si trovano nel sangue ed era disponibile in laboratorio da un altro progetto. Per generare la sequenza di IPC, estrarre e purificare il DNA da C. oocisti parvum come descritto altrove 18. - Acquista il forward (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA AAG GAA G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') e indietro (5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') primer da fonti commerciali. I primer PCR IPC utilizzati in questo test sono illustrati nella Figura 1 e contengono una regione che è gratuita per il modello IPC DNA (ad esempio, C. parvum, viola nella figura 1) ed una regione che è gratuita per l'organismo bersaglio (ad esempio, HIV-1, blu nella Figura 1).
- Eseguire PCR utilizzando i primer e IPC DNA stampo.
- Montare 50 reazioni microlitri PCR utilizzando i reagenti del kit Phusion alta fedeltà DNA Polymerase secondo le istruzioni del produttore, escludendo la polimerasi. Utilizzare 2 ml di DNA stampo e Phusion Buffer HF.
- Aggiungere la polimerasi Phusion per ciascuna reazione dopo un avviamento a caldo a 98 ° C, seguita da 60 sec a 98 ° C, seguiti da 40 cicli di 15 secondi a 98 ° C, 30 sec a 62 ° C e 30 secondi a 72 ° C con una estensione finale a 72 ° C per 5 min. Dopo cicli termici, tenere i campioni a 4 ° C.
- Analizzare campioni di gel elettroforesi su un gel di TAE agarosio 2%, e poi estrarre e purificare DNA usando il QIAquick Gel Extraction Kit secondo il protocollo microcentrifuga inclusail kit.
- Schermo candidati IPC per la loro capacità di amplificare con qRPA.
- Preparare reazioni qRPA come descritto nella Sezione 3, con HIV-1 primer, una sonda FAM marcata specifici della IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '), e un totale di 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, o 10 5 copie di ciascun candidato IPC per reazione, prova tutte le concentrazioni in duplice copia.
- Scegliere il candidato IPC che amplifica più costantemente e ha il limite di rilevamento più basso.
- Co-amplificare HIV-1 e il IPC per determinare la concentrazione ottimale di DNA IPC.
- Simile alla Sezione 3, unire il seguente in ogni reazione 50 microlitri: 29,5 ml di tampone di reidratazione, 2,1 ml di RPA di primer forward [10 micron], 2.1 ml di RPA invertire fondo [10] micron, 0,6 ml di HIV-1 HEX Sonda -labeled [10 micron], 10 mldi HIV-1 DNA a concentrazioni variabili, 2,5 ml di acetato di magnesio e 1 enzima pellet. Invece di aggiungere 3,2 ml di acqua priva di nucleasi come è stato fatto nella fase 3.2.4, aggiungere 0,6 ml di sonda IPC FAM marcata [10 micron], e 2,6 ml di DNA IPC. Utilizzare la concentrazione IPC che è il limite di rilevazione-di-(LOD) quando qRPA viene eseguita con DNA IPC sola (LOD definita come la concentrazione minima cui la quantità di generazione del segnale di fluorescenza è maggiore di quello generato dalla fluorescenza generata dai campioni con no DNA bersaglio).
- Incubare i campioni utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 1.1.
- Se l'IPC non amplifica in ogni campione, considerare ripetendo l'esperimento IPC concentrazione di un ordine di grandezza superiore. La concentrazione ottimale di DNA IPC per l'HIV-1 dosaggio è 10.000 copie / ml. Mentre i campioni sono considerate valide se si è o IPC o HIV-1 di amplificazione del DNA, idealmente la IPC presenta di amplificazione rilevabile perogni reazione.
5. Costruire una curva standard da più esperimenti
- Assicurarsi che i dati di ogni esperimento è stato esportato in un programma di foglio di calcolo come descritto nella Sezione 3.13.
- Aprire ed eseguire lo script "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Tutti gli ingressi sono richiesto automaticamente nella finestra di comando. Dopo aver avviato lo script, all'utente viene richiesto automaticamente a designare la "Numero di file di dati" utilizzati per costruire la curva standard.
- Nella finestra di comando, digitare il numero di file da utilizzare per costruire la curva standard e premere invio.
- Digitare nella finestra di comando il numero di campioni e il numero di repliche per ogni file di allenamento (premendo INVIO dopo ciascuna voce).
NOTA: Nel layout piatto descritto nella Sezione 1.2, ci sono stati 6 campioni con diverse concentrazioni e 2 repliche di ogni campione). - Digitare nella finestra di comando il più basso DNUna concentrazione utilizzata per costruire la curva standard (in log10 copie) e premere invio (per il layout di piastra descritto nella Sezione 1.2, la concentrazione più bassa template è '1' log10 copie).
- Digitare nella finestra di comando la differenza di concentrazione tra ogni standard (in log10 copie), quindi premere invio (per il layout di piastra descritto nella Sezione 1.2, l'intervallo di concentrazione è '1' log10 copie).
- Dopo essere stato richiesto, digitare la "soglia Slope" nella finestra di comando e premere invio.
- Nella finestra di comando, digitare il "Number (z) deviazioni standard sopra lo sfondo per la soglia positiva", quindi premere invio. Valori tipici per la gamma z da 1 a 5.
- Specificare se i dati sono stati raccolti utilizzando il termociclatore ('1'), * .tiff immagini al microscopio ('2'), o * .jpg immagini al microscopio ('3') digitando il numero '1', '2,' o '3,' e pressing entrare.
- Scegliere di impostare una nuova soglia IPC o per utilizzare un valore predefinito per la soglia digitando 'y' o 'n', rispettivamente, quando richiesto.
- Quindi, selezionare tutti i file di foglio di calcolo utilizzati per costruire la curva standard.
NOTA: Lo script quindi importare automaticamente i dati HEX e FAM fluorescenza; determinare se ogni reazione era valido (cioè, se i segnali di fluorescenza superato le soglie per la HEX o canali FAM); determinare il coefficiente r 2 per un esponenziale, lineare e secondo ordine polinomiale; trama "log10 copie rispetto alla soglia del ciclo" per ogni campione usato per costruire la curva standard; e creare un foglio di calcolo contenente variabili essenziali per ricostruire la curva standard per gli esperimenti di convalida senza richiedere all'utente di immettere nuovamente tutti i parametri di input di nuovo.
6. Assay Validazione e quantificazione dei campioni sconosciuti Utilizzola curva standard
- Utilizzare lo script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" per stimare la precisione e l'accuratezza del test utilizzando campioni con concentrazioni note o usarlo per quantificare i campioni con concentrazioni sconosciute.
NOTA: Perché la ricerca precedentemente pubblicato ha dimostrato che una misura esponenziale ha prodotto il miglior coefficiente R-squared 18, questo script utilizza un fit esponenziale per la curva standard. Se si desidera un diverso tipo di forma, lo script può essere modificata di conseguenza.- Aprire ed eseguire lo script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Dopo aver avviato lo script, all'utente viene richiesto per entrare in tutti gli ingressi nella finestra di comando.
- Inserire '1' per convalidare un test usando una curva standard con concentrazioni del campione conosciuti o digitare '2' per quantificare i campioni sconosciuti.
- Quando richiesto, selezionare un curva standard salvato o costruirne uno nuovo inserendo the le informazioni che viene sollecitato automaticamente nella finestra di comando (le stesse informazioni che è necessario per lo script "JoVE_qRPA_standard_curve.m" dalla Sezione 5).
- Digitare il numero di esperimenti (ad esempio, fogli elettronici) per analizzare per la convalida / quantificazione.
7. Preparazione per la raccolta dati utilizzando un microscopio a fluorescenza e un chip riscaldata
- Assicurarsi che il microscopio a fluorescenza ha un riscaldatore palcoscenico e regolatore di temperatura 1-Channel di precisione ad alta stabilità in luogo.
- Assicurarsi che il microscopio a fluorescenza è un cubo di filtro per eccitare la fluorescenza e raccogliere da ogni fluoroforo. Excite e raccogliere la fluorescenza FAM generato durante l'amplificazione del DNA IPC attraverso un filtro GFP (eccitazione BP 470/40 nm, emissione BP 520/50 nm). Excite e raccogliere la fluorescenza HEX generato durante HIV-1 amplificazione del DNA attraverso un filtro HEX (eccitazione BP 530/30 nm, emissione BP 575/40 nm).
- Utilizzare il software di editing di script microscopio per creare un algoritmo automatico di replicare di raccolta dati sul termociclatore.
- Prima inserire una "Impostazioni" passo per chiudere l'otturatore. Successivamente aggiungere un "Exposure" passo per impostare l'esposizione a 60 sec. Inserire una "Snap" per eseguire il ritardo di 60 secondi, che implementa il 1 min periodo di pre-incubazione. Aggiungi un "Setting" passo per cambiare il gruppo di lavoro per il filtro GFP. Inserire un'altra "Exposure" passo per regolare l'esposizione a 200 msec. Tutte le esposizioni con la GFP oi cubetti di filtro HEX verranno impostate a 200 msec.
- Dopo la fase di "Exposure", aggiungere un "Snap" e specificare la macchina fotografica con la quale sarà presa l'immagine. Utilizzare un altro passo "Setting" per chiudere l'otturatore e un passo "Salva Immagine" per salvare l'immagine in una cartella temporanea definita dall'utente.
- Avanti interruttore al cubo filtro HEX usando un altro "Impostazioni" step e then aggiungere una "esposizione" a 200 msec, un "Snap" e "Salva immagine" step.
- Ripetere questo processo 59 volte con un ritardo iniziale di 20 secondi invece di 60 (vicino dell'otturatore, attendere 20 secondi, l'interruttore di filtro GFP cubo, l'esposizione impostato a 200 msec, scatto, scatto vicino, salvare, passare a filtrare HEX cubo, esposizione impostata a 200 msec, scatto).
- Creare un chip che conterrà le reazioni qRPA.
- Per esperimenti utilizzando il microscopio, utilizzare il file JoVE_qRPA_base.ai per tagliare una base rettangolare 40 x 15 mm da una lastra di 1/8 "acrilico nero di spessore con un cutter laser impostato a 100% di potenza, velocità 10%.
- Utilizzare il file JoVE_qRPA_well.ai tagliare pozzetto di reazione costituito da un quadrato di 10 x 10 mm con un diametro di 5 mm foro circolare tagliato da un foglio di 1,5 mm di spessore acrilico trasparente.
- Collegare fino a tre pozzi a una singola base con gel supercolla.
- Durante la notte a secco.
8. Data Collection e Analysis Utilizzando un microscopio a fluorescenza
- Preparare il microscopio per la raccolta dati caricando script automatico di raccolta dati JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
- Impostare il riscaldatore fase a 48 ° C e preriscaldare il chip di reazione sul riscaldatore palco per circa 20 min. Un'impostazione temperatura di 48 ° C mantiene una temperatura di 39 ° C nel pozzetto di reazione (dati non mostrati).
- Utilizzando un obiettivo 10X, 0,45 NA, concentrarsi sulla parte superiore del bordo interno del pozzetto di reazione con il filtro in posizione GFP. I bordi di acrilico sono autofluorescenti dopo il taglio laser e possono essere facilmente visualizzati. Dopo la messa a fuoco, non regolare l'altezza del palco microscopio fino a quando tutti i dati sono raccolti.
- Montare il master mix qRPA in uno spazio di lavoro di pre-amplificazione designato come descritto al punto 4.5.1. Per ogni campione, mescolare un pellet enzima, master mix, e HIV-1 DNA stampo in una provetta. Aggiungere 2,5 ml di acetato di magnesio al primo reaction e brevemente vortex.
- Trasportare rapidamente la provetta contenente il campione qRPA al microscopio a fluorescenza.
- Pipettare attentamente 30 microlitri della reazione RPA nel pozzetto di reazione senza creare bolle. Mettere una goccia di olio minerale PCR-grade sulla reazione RPA per evitare l'evaporazione.
- Posizionare il pozzo direttamente sotto l'obiettivo microscopio, avendo cura di immagine solo il centro del pozzo, alcun dei bordi acrilici auto-fluorescente. Dopo che il pozzo è posizionato, eseguire lo script automatizzato 7. Lo script genera un'immagine JPEG utilizzando un'immagine JPEG utilizzando il cubo filtro HEX ogni 20 sec filtro cubo FAM e.
- Dopo che lo script è completato, trasferire queste immagini dalla cartella di archiviazione temporanea prima di eseguire altri campioni.
- Crea 2 cartelle: 1 per ciascun fluoroforo (cioè, 'HEX' e 'FAM'). Conservare entrambe le cartelle nella stessa cartella principale. In ogni fluoroforocartella, crea una cartella corrispondente al numero di copie di DNA presenti nel campione (ad esempio, 0, 10, ecc).
- Trasferire tutti i file con il prefisso 'HEX' nella corrispondente sottocartella nella cartella 'HEX'. Trasferire tutti i file con il prefisso 'GFP' nella corrispondente sottocartella nella cartella 'FAM'.
- Ripetere Sezioni 8.2-8.4 per reazioni qRPA con 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 e HIV-1 esemplari DNA.
- Dopo aver raccolto i dati di tutti i campioni qRPA in un esperimento, caricare lo script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Quando richiesto dallo script, selezionare la cartella principale che contiene le 2 cartelle fluoroforo, che a loro volta contengono le immagini per ciascuna concentrazione in sottocartelle.
NOTA: Lo script genererà automaticamente un file foglio di calcolo nella directory principale in cui i dati HEX fluorescenza verranno salvati in un foglio di named 'HEX', e i dati FAM fluorescenza verranno salvati in un foglio denominato 'FAM'. In ogni foglio, il numero di cicli è elencato nella colonna B, ei dati di fluorescenza in tempo reale per concentrazioni crescenti di modello sono riportati nelle colonne C, D, ecc. Ogni fluorescenza datum tempo reale è l'intensità media di fluorescenza dell'immagine catturata in quel punto di tempo. - Utilizzare la funzione di diagramma a dispersione di default nel programma foglio di calcolo per tracciare celle B2: H61 del 'HEX' e lenzuola 'fam' di visualizzare in tempo reale la fluorescenza e generare grafici simili a quelli nelle figure 2A, 2B, 3A, 3B e.
NOTA: Il foglio generato nel passaggio 8.6 può essere utilizzato anche in script "JoVE_qRPA_standard_curve.m" e "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".
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Representative Results
Prima di selezionare una sequenza di servire come IPC negli esperimenti qRPA con l'obiettivo (HIV-1) DNA, controllo interno positivo (IPC) i candidati sono generati e screening per la loro capacità di amplificare in reazioni qRPA senza HIV-1 DNA presente. Candidati IPC sono più lunghi rispetto al target (HIV-1) DNA per prevenire la formazione IPC da fuori competizione HIV-1 formazione amplicon. Come mostrato in Figura 2A, la generazione di due C. candidati parvum IPC sono stati verificati per la presenza di 415 e 435 bp bande utilizzando elettroforesi su gel. Nelle reazioni qRPA, IPC candidato più breve esposto poco amplificazione (Figura 2B), mentre il candidato più stabilmente amplificato quando un totale di 10 4 e 10 5 copie erano presenti (Figura 2C). Così, il candidato più è stato scelto per essere la IPC per esperimenti HIV-1 qRPA.
Tempo reale qRPA può essere eseguita utilizzando il bersaglio di interesse solo o usandosia il bersaglio e l'IPC. La Figura 3 mostra un esperimento sul termociclatore utilizzando sia HIV-1 DNA e C. parvum IPC. In questo esperimento, 2,6 x 10 4 copie di DNA IPC sono state aggiunte a ciascuna reazione, una concentrazione vicino al limite di rilevamento IPC, per evitare di compromettere il limite di rilevazione del virus HIV-1 DNA bersaglio. Come mostrato nella Figura 3A, che visualizza dati di fluorescenza HEX corrispondenti al tempo reale HIV-1 generazione DNA, il momento in cui inizia l'amplificazione rilevabile è inversamente proporzionale alla concentrazione iniziale di destinazione. Così, l'amplificazione risulta prima per alte concentrazioni di HIV-1 DNA e successivamente per basse concentrazioni di HIV-1 DNA. Al contrario, l'amplificazione del DNA rilevabile IPC inizia approssimativamente nello stesso tempo perché la concentrazione di partenza IPC è la stessa in tutti i campioni, come mostrato nella Figura 3B, che visualizza dati di fluorescenza FAM corrispondenti alla generazione DNA IPC durante tegli stesso esperimento. La velocità di generazione di fluorescenza dalla IPC è inversamente proporzionale alla concentrazione di HIV-1 DNA a causa della concorrenza durante l'amplificazione.
Con l'obiettivo di sviluppare un lettore di fluorescenza campo-operabile con reazioni qRPA, esperimenti qRPA possono essere eseguite su un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con un riscaldatore palco e regolatore di temperatura di precisione 1-Channel High stabilità. Figura 4A e 4B visualizzazione dati HEX e FAM fluorescenza raccolti su un microscopio. I dati raccolti sul microscopio utilizzando chip tagliati al laser dimostrano lieve variabilità in fluorescenza basale e creste e gli avvallamenti che possono essere causa di photobleaching. Tuttavia, lo script determina la soglia ciclo utilizzando la velocità di variazione della fluorescenza durante il periodo di amplificazione iniziale, che è influenzata dalla fluorescenza basale o variabilità fluorescenza dopo si è verificato l'amplificazione iniziale. Come visto in Fifigura 4C, la curva standard costruita da questo esperimento ha un coefficiente r 2 di 0.990. In particolare, l'IPC è amplificato solo per basse concentrazioni di HIV-1 DNA. Anche se questo comportamento è diverso da esperimenti condotti su termociclatore, tutti i campioni sono ancora classificati come valido con questo metodo.
I dati provenienti da più esperimenti con concentrazioni target noti possono essere compilati per costruire una curva standard, che può quindi essere utilizzato per valutare le prestazioni del test o quantificare i campioni con concentrazioni sconosciute. La Figura 5 mostra i dati di cinque esperimenti e una curva standard esponenziale generati usando lo script "JoVE_qRPA_standard_curve.m", in relazione iniziale di HIV-1 concentrazione target per il momento in cui l'amplificazione rilevabile iniziata. Figura 5 usato 5 esperimenti separati, ciascuno contenente 2 reazioni qRPA con ogni concentrazione template per costruire una curva standard. Si noti che l'esponenzialefit ha un alto r 2 coefficiente di 0,959. La curva standard è stato poi utilizzato per prevedere le concentrazioni di altri campioni con concentrazioni note per la validazione del test con lo script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" sceneggiatura. La tabella 1 mostra i risultati di quantificazione per 5 ulteriori esperimenti utilizzando la curva standard in figura 5. Si noti che il algoritmo correttamente classificata tutti i campioni contenenti HIV-1 DNA positivo e 9 su 10 dei campioni non-target come controllo negativo. Inoltre, la concentrazione media prevista era entro un ordine di grandezza della concentrazione corretta e la deviazione standard per concentrazioni previste era meno di 0,5 log10 (copie per reazione).
Figura 1:. Schema di quantitative obiettivi DNA RPA Il QRPUn test amplifica due sequenze di DNA fiancheggiate da sequenze identiche alle quali primer bind ("RPA avanti" e "RPA Reverse"). Le sequenze amplificate sono 1) una sequenza all'interno del genoma di HIV-1 ("HIV-1") che viene rilevata con il "HIV-1 probe" e 2) una sequenza di controllo positivo interno ("IPC (C. parvum)") incluso in ciascuna reazione che viene rilevata con il "probe IPC." La IPC è stata generata tramite PCR utilizzando il genoma Cryptosporidium parvum come modello e primers ("PCR avanti" e "PCR inversa") che contiene la regione complementare a C. parvum (viola) ed una regione complementare a HIV-1 (blu). Figura pubblicato originariamente in Analytical Chemistry 2014, ristampato qui con il permesso 9.
Figura 2:
Figura 3: i dati tipici di fluorescenza grezzi generati durante la co-amplification di HIV-1 DNA e IPC in un termociclatore. (A) per l'HIV-1, l'insorgenza di amplificazione rilevabile, mostrato da un evidente aumento di fluorescenza HEX, si verifica prima per alte concentrazioni di HIV-1 DNA. (B) Per l'IPC, l'insorgenza di amplificazione rilevabile, mostrato da un evidente aumento di fluorescenza FAM, viene raggiunto all'incirca allo stesso tempo indipendentemente dalla concentrazione di HIV-1 DNA. Tuttavia, la velocità di generazione di fluorescenza FAM è inversamente proporzionale alla quantità di HIV-1 DNA presente causa della concorrenza. Figura pubblicato originariamente in Analytical Chemistry 2014, ristampato qui con il permesso 9.
Figura 4: Dati tipici fluorescenza grezzi generati durante la co-amplificazione di HIV-1 DNA e IPC su un microscopio (A) simili dati generati sulla t.egli termociclatore, l'insorgenza di HIV-1 rilevabile amplificazione, mostrato da un evidente aumento di fluorescenza HEX, si verifica prima per alte concentrazioni di HIV-1 DNA. (B) IPC amplificazione sul microscopio, dimostrato da FAM fluorescenza, è evidente per basse HIV-1 concentrazioni di DNA, ma non sempre risulta in campioni con alti HIV-1 concentrazioni di DNA. (C) una curva standard può essere costruito usando gli script JoVE_standard_curve.m che produce un alto coefficiente r 2.
Figura 5:. Curva standard tipica per HIV-1 Utilizzando lo script JoVE_standard_curve.m, dati di fluorescenza HEX grezzi generati durante HIV-1 di amplificazione viene processato per costruire una curva standard, che può essere usato per predire la concentrazione di HIV-1 DNA di sconosciuta campioni. Questa curva standard (z = 1) è stata generata utilizzando i dati di 5 sperimEnt, in cui 6 concentrazioni sono state testate con 2 repliche per ogni concentrazione. Tutte le concentrazioni sono date in log10 copie. Figura pubblicato originariamente in Analytical Chemistry 2014, ristampato qui con il permesso 9.
Figura 6:. Algoritmo tunability Regolazione dei parametri dell'algoritmo cambia la curva standard usato per predire la concentrazione dei campioni sconosciuti. Lo script JoVE_validation_and_quantification.m è stato utilizzato per prevedere la concentrazione di campioni sconosciuti con z = 1 (rossa) e z = 5 (blu). Tutte le concentrazioni sono date in log10 copie. Previsioni più accurate per le concentrazioni di DNA basse quando z = 1; previsioni sono più accurato per alte concentrazioni di DNA quando z = 5. Regolando i parametri dell'algoritmo, la curva standard qRPA possono essere regolati in base alle esigenze cliniche. Figurapubblicato originariamente in Analytical Chemistry 2014, ristampato qui con il permesso 9.
| Campione Concentrazione | Media concentrazione prevista | Deviazione standard | Percentuale di campioni identificati come positivi |
| Nessun controllo di destinazione | 0.1 | 0.3 | 10% |
| 1 | 0.9 | 0.1 | 100% |
| 2 | 2.2 | 0.5 | 100% |
| 3 | 3 | 0.1 | 100% |
| 4 | 3.7 | 0.1 | 100% |
| 5 | 4.2 | 0.2 | 100% |
Tabella 1: convalida del test HIV-1 qRPA Utilizzo della standa.Curva rd in figura 4, lo script JoVE_validation_and_quantification.m stato utilizzato per prevedere le concentrazioni (in log10 copie) di campioni per 5 ulteriori esperimenti. Tabella pubblicato originariamente in Analytical Chemistry 2014, ristampato qui con il permesso 9.
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Discussion
Al fine di ottenere dati di quantificazione significativi utilizzando l'algoritmo di MATLAB, l'utente deve selezionare i valori di input appropriati quando richiesto. Dopo l'avvio ogni script ai punti 5 e 6, tutte le variabili di input sono sollecitati automaticamente nella finestra di comando e le uscite sono generati automaticamente. Nella Sezione 5.7 all'utente viene richiesto di selezionare una soglia pista. Il valore della soglia pista colpisce il quadrato del coefficiente di correlazione (r 2) della forma. Quando si utilizzano i dati di fluorescenza prime esportate da un termociclatore, valori compresi tra 2.0 e 5.0 tendono a produrre un elevato coefficiente r 2. Nella Sezione 5.8 l'utente deve indicare il numero di deviazioni standard sopra lo sfondo per impostare la soglia positiva. Per segnare un campione come positivo o negativo, lo script determina automaticamente il campione differenza Δ tra la fluorescenza massima e minima per ogni campione utilizzando i dati di fluorescenza prime esportate dal thermal cycler. Calcola la differenza media di sfondo Δ e deviazione standard σ sfondo per i campioni di controllo tutti i no-target. Un campione viene considerato positivo se il campione Δ è più di z × sfondo σ sopra Δ sfondo. Nella Sezione 5.10 l'utente decide se utilizzare la soglia predefinita o impostare una nuova soglia. Se l'utente desidera impostare una nuova soglia, determinare la nuova soglia sperimentalmente effettuando 3 esperimenti contenenti ciascuna 12 reazioni RPA senza HIV-1 DNA presente. Impostare la soglia per l'aumento medio di intensità di fluorescenza da questi esperimenti più 3 deviazioni standard. Dopo aver completato la sezione 6, lo script JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m ritorna automaticamente la concentrazione di DNA stimato per ogni reazione qRPA (in log10 copie). Se lo script determina che nessun HIV-1 DNA era presente nel campione, la concentrazione stimata viene elencato come "Nequirente per HIV "o" non valido ", a seconda che il segnale fluorescente per il controllo interno positivo superato la soglia (z × σ sfondo + Δ background). Se l'utente sta convalidando la curva standard con concentrazione del campione noti, lo script sarà anche restituire una tabella aggiuntiva simile a quella della tabella 1.
Per sviluppare un saggio RPA tempo reale che fornisce quantificazione accurata, coerenza sperimentale è cruciale. Ad esempio, utilizzare gli stessi primer e della sonda aliquote sia per la curva standard e gli esperimenti di convalida. Anche evitare cicli di gelo-disgelo memorizzando i primer e della sonda aliquote a 4 ° C tra esperimenti anziché -20 ° C. Le aliquote modello utilizzato per gli esperimenti con curva e validazione standard sono memorizzati nello stesso modo. RPA pellets enzimi e reagenti dello stesso lotto vengono utilizzati in conformità alle indicazioni del produttore. Infine, becautilizzare RPA manca "cicli" veri per controllare con precisione la velocità di amplificazione, la standardizzazione dei passaggi degli utenti è assolutamente indispensabile. Durante il montaggio reazioni, l'utente deve seguire sempre gli stessi passi nello stesso ordine, spendendo circa la stessa quantità di tempo ad ogni passo. Reazioni devono sempre essere mescolati delicatamente con un nuovo puntale, e le bolle devono sempre essere eliminati. Prima di amplificazione, le reazioni devono essere tenuti ad una temperatura costante, e il termociclatore o software microscopio devono sempre essere preparati prima di caricare le reazioni per evitare l'amplificazione a temperature sub-ottimali che potrebbero influenzare la quantificazione. Qualsiasi variazione delle condizioni di reazione iniziali può portare a incoerenza risultati sperimentali.
Quando si usa un microscopio per raccogliere dati, variabili aggiuntive devono essere controllati per minimizzare la variazione di intensità di fluorescenza. Tutte le reazioni devono essere collocati nella stessa regione sulla fase più calda, e la microscope deve essere focalizzata sulla stessa regione del pozzo per ogni campione. Anche se queste pratiche sono seguite, i dati di fluorescenza raccolti su un microscopio possono presentare variabilità dovuta ai punti locali luminosi che si formano naturalmente durante le reazioni RPA, la formazione di bolle all'interno delle camere di reazione, o photobleaching derivanti dall'esposizione ripetuta alla luce di eccitazione. L'influenza di queste variabili è evidente nei dati di fluorescenza raccolti sul microscopio (Figure 4A e 4B), che dimostrano la variabilità basale, picchi e depressioni. Queste caratteristiche sono assenti dai dati raccolti fluorescenza sul termociclatore (Figure 3A e 3B). In ultima analisi, la raccolta dei dati sul microscopio ha scopi puramente prova di principio e il test finale sarà implementato su un lettore a fluorescenza campo-operabile con geometrie più precise e software di controllo che riduce al minimo le variabili.
Un'altra importanteaspetto del processo di sviluppo del test qRPA è la coerenza nel trattamento dei dati. Il protocollo descritto nella sezione Metodi utilizza script per elaborare i dati grezzi di fluorescenza (memorizzati in un file di foglio di calcolo) raccolti da un termociclatore o microscopio. Tutti gli esperimenti utilizzati per costruire la curva standard devono essere formattati in modo identico. Quando si utilizza un termociclatore per raccogliere i dati, lo stesso layout di piastra deve essere utilizzato, e dati provenienti da pozzi che non contengono reazioni RPA non deve essere esportato. Quando si usa un microscopio per raccogliere dati, il formato dei dati deve corrispondere al formato dei dati esportati automaticamente dal termociclatore. Ad esempio, i dati non-target-comando devono essere nelle celle C2: C61, e dati per concentrazioni crescenti modello devono essere in celle D2: D61, E2: E61, ecc Se esistono più repliche di ogni concentrazione di un esperimento, la serie 2 ° replicare diluizione deve essere ordinato da sinistra a destra da nessun controllo di destinazione (NTC) a più alta concentrazione esalvato nelle colonne immediatamente a destra del 1 ° replicano serie di diluizioni. Ad esempio, nel layout piastra utilizzata nella sezione 1.2 con 2 repliche per ogni campione, dati di fluorescenza per la 1a copia di ogni campione nella serie di diluizioni devono essere salvati in celle C2: dati H61 e fluorescenza per il 2 ° copia di ogni campione in la serie di diluizione deve essere salvato in celle I2: N61. Per il layout di piastra utilizzata al punto 1.2, questo è il formattazione durante l'esportazione dei dati dal software termociclatore ad un foglio di calcolo di default.
I dati rappresentativi forniti da esperimenti HIV-1 qRPA dimostrano supporto prova di concetto che RPA può essere utilizzato per la quantificazione di concentrazione di acido nucleico in campioni sconosciuti. Clinicamente utili HIV-1 prove di carico virale hanno una gamma clinica di almeno 4 ordini di grandezza, una precisione di 0,5 log10 copie, e un limite di rilevazione-di-di almeno 200 copie 19,20. L'HIV-1 test DNA descritto incontra questi criteria ed è più accurata a basse concentrazioni, come mostrato nella Tabella 1. Pertanto, con l'inclusione di un passo trascrittasi inversa, questi risultati suggeriscono che un test HIV-1 RT-RPA può avere il potenziale per misurare HIV-1 carica virale in campioni clinici. Quando si sviluppa un saggio qRPA, regolando i parametri dell'algoritmo può sintonizzare la gamma dinamica sensibilità e lineare a seconda delle esigenze cliniche. Figura 6 mostra che regolando z (un parametro che determina la soglia per campioni positivi) possono influenzare la sensibilità e la precisione a bassa ed alta concentrazioni target. Inoltre, può essere possibile aumentare la risoluzione e precisione di quantificazione incubando reazioni ad una temperatura inferiore o meno usando acetato di magnesio, riducendo così il tasso di amplificazione.
Questa prova di concetto qRPA test può essere utilizzato per quantificare la concentrazione dei campioni contenenti HIV-1 DNA. Il dosaggio qRPA descritto in questo manuscript include istruzioni dettagliate su come assemblare le reazioni CPT in tempo reale, lo sviluppo e lo schermo di un IPC, ed elaborare i dati grezzi di fluorescenza per costruire una curva standard che può essere utilizzato per quantificare i campioni sconosciuti. Con le istruzioni dettagliate incluse, questo protocollo può essere adattato per quantificare la concentrazione di DNA in una vasta gamma di campioni.
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Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione della Bill & Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges in Global Health Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qRPA Assay | |||
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
- Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).
