Introduction
Kvantitativ nukleinsyraamplifiering är en viktig teknik för detektering av miljö-, livsmedelsburna och vattenburna patogener samt för klinisk diagnostik. Realtids kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) är den gyllene standarden metod för känslig, specifik och kvantitativ detektion av nukleinsyror, t.ex. för HIV-1 virusmängd tester, upptäckt av bakteriella patogener, och screening för många andra organismer en - 3. Under realtids qPCR, primrar amplifierar patogent DNA i cykler, och en fluorescerande signal alstras som är proportionell mot mängden av amplifierad DNA i provet vid varje cykel. Ett prov innehållande en okänd koncentration av patogent DNA kan kvantifieras med användning av en standardkurva som relaterar den initiala DNA-koncentrationen av standardprover och den tid vid vilken den fluorescerande signalen når ett visst tröskelvärde (dvs tröskelcykeln, eller C-T).
4. Dessa plattformar ger i allmänhet resultat snabbare och amplifiera nukleinsyror på en lägre, enda temperatur, vilket kan åstadkommas med billigare, enklare utrustning. RPA, vilket är särskilt attraktiv för point-of-care-program, förstärker DNA i minuter, kräver en låg förstärkning temperatur (37 ° C), och förblir aktiv i närvaro av föroreningar 5,6. RPA-analyser har utvecklats för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive livsmedelsanalys, detektion av patogener, cancer drug screening och upptäckt av biothreat agenter 7-12. Emellertid har användningen av RPA för kvantifiering av nukleinsyror begränsats 13,14.
I tidigare arbete, var det shown som i realtid kvantitativ RPA (qRPA) är genomförbart 15. Här är en mer detaljerad protokoll som avses med realtids kvantitativ RPA att kvantifiera okända prover med en standardkurva, en metod som är analog med kvantifiering med hjälp qPCR. Detta protokoll beskriver hur du utför en RPA reaktion på en värmecykeln för att upptäcka HIV-1-DNA som ett proof-of-concept, samt hur man kan utveckla en intern positiv kontroll (IPC) för att säkerställa att systemet fungerar korrekt. Datainsamling med hjälp av en värmecykeln eller mikroskop och dataanalys för att konstruera en standardkurva med träningsdata också beskrivet. Slutligen metod för kvantifiering okända prover med standardkurvan med en anpassad manus demonstreras. Denna qRPA metod möjliggör kvantifiering av prover med okända koncentrationer och har många fördelar jämfört med traditionell realtid qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Programmera värmecykeln för Real-time qRPA Reaktioner
- Skapa ett nytt protokoll i värmecykel programvaran.
- Sätt i ett inkubationssteg: 39 ° C under 1 min.
- Lägg ett andra steg: 39 ° C under 20 sek, följt av en platta läsning.
- Slutligen, infoga en "gå till" som upprepar det andra steget 59 gånger.
- Spara protokollet.
- Skapa en ny platta i "platt editor" fliken av programvaran. Välj brunnar på plattan motsvarar placeringen av RPA reaktioner (Här använder brunnar A1, A4-A8, B1 och B4-B8).
OBS: Det är inte viktigt om provet typ av brunnarna (t.ex. "Standard", "NTC") anges, eftersom dataanalys görs med en anpassad manus.- För experiment som innehåller HIV-1 DNA enbart, välj "HEX" fluorofor för alla brunnar. För experiment som innehåller HIV-1 DNA och en inre positiv control väljer både "HEX" och "FAM" fluoroforer för alla brunnar. Spara plattan.
2. Förbered för HIV-1 qRPA Experiment
- Montera RPA reaktioner i en utsedd pre-förstärkning arbetsyta innehåller utsedda pipetter, pipettspetsar, virvel och mini-centrifug, som för qPCR. Som RPA kan förstärka en enda kopia av DNA med så mycket som tio tiopotenser (data visas ej), hantera och bortskaffa rören innehåller efter förstärkta DNA-produkter i en utsedd efterförstärkningsområdet.
- Förhindra kontakt mellan alla pre-amplifieringsreagens och post-amplifieringsprodukter. Spray pre-amplifiering arbetsytor och utrustning med 50% blekmedel före och efter alla experiment. Använd en pappershandduk för att torka bort överflödigt blekmedel.
- Inköp framåtriktad primer sekvensen 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'och omvänd primer sekvensen 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'från kommersiella DNA syntar. Köp sondsekvensen 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 'från kommersiella källor. Förvara samtliga primrar och prober vid 4 ° C i alikvoter vid en koncentration av 10 | iM före användning.
OBS: Den qRPA analysen förstärker en unik HIV-1-sekvensen. För denna proof-of-concept-analysen, använd plasmiden pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr beskrivs av Sutton et al., Som innehåller målsekvensen 16. För qRPA experiment plasmiden lagrades vid 4 ° C i alikvoter innehållande 1, 10, 10 2, 10 3, och 10 4 kopior per ul i en buffert innehållande 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA vid pH 8,0, och 1 ng / il humant genomiskt bärar-DNA (360486). Detta bärar-DNA-koncentrationen är ekvivalent med DNA-koncentrationen som erhållits från kommersiella serum extraktion av DNA kit som används för HIV-1 diagnos 17. Dessa HIV-1utspädningar användes som mallar i qRPA reaktioner för att bygga en standardkurva.
3. Montera en HIV-1 qRPA standardkurva
- Innan montering av qRPA reaktioner, förbereda för-förstärkningen arbetsyta som beskrivs i steg 2.1.1. Placera en 96-brunnars kalla blocket i lagring vid 4 ° C.
- Förbered reagens för 12 reaktioner:
- Flytta magnesium acetat, den rehydrering buffert och 12 RPA reaktions pellets till pre-förstärkning arbetsyta.
- Tina magnesiumacetat och rehydrering buffert vid rumstemperatur.
- Alikvot 32.5 pl magnesium acetat (2,5 l per reaktion) till ett mikrocentrifugrör.
- Förbered en 13x huvudblandning. Lägg 383,5 il av rehydrering buffert (29,5 l per reaktion) till en separat mikrocentrifugrör för mastermixen. Lägg 41.6 pl nukleasfritt vatten (3,2 pl per reaktion) till mastermixen. Vortex mastermixen.
- Returnera magnesium acetate och rehydrering buffert till lagring vid -20 ° C.
- Flytta primer och prob portioner från kylskåpet till pre-förstärkningsområdet, undvika överdriven ljusexponering för att minimera fotoblekning.
- Lägg 27.3 l vardera av de 10 iM framåt och bakåt primers (2,1 l per primer per reaktion) till Master Mix.
- Lägg 7.8 ìl av 10 iM HEX-märkta HIV-1 DNA-sond (0,6 pl per reaktion) till mastermixen.
- Återgå primers och sond till lagring.
- Matcha plattan layout beskrivs i avsnitt 1.2, placera 1 enzym pelleten i var och en av de längst till vänster rör och 1 enzym pelleten i var och en av de fem långt rätt rör med 2 låga 8-well PCR tube remsor.
- Tillsätt försiktigt 37,5 | il av huvudblandning till varje rör innehållande en enzympellet, med användning av en ny pipettspets för varje rör och varsam omrörning Master Mix och pelleten med spetsen tills pelleten är helt upplöst. Rör om försiktigt för att förhindra bubbel formatipå, och avlägsna spetsen försiktigt för att förhindra varje förlust av reaktionsvolymen.
- Efter alla enzympellets har uppblött med mastermixen, hämta 96-väl kalla kvarter från 4 ° C lagring. Placera röret remsorna PCR i kylan blocket att kyla mastermixen.
- Medan huvudmixen kylning, ladda termocyklern programvara med protokollet och plattan som beskrivs i avsnitt 1.
- Klipp 2 remsor av genomskinlig plast mikro tätning lim vara något bredare än PCR-rören, och hämta två platta PCR röret remsor lock.
- Hämta 6 mall portioner från lager (som innehåller 0, 1, 10 1, 10 2, 10 3, eller 10 4 kopior av HIV-1-plasmiden per mikroliter).
- Tillsätt 10 ìl av varje mall till rören som utsetts i detta templatkoncentration. Använd en ny pipettspets för varje rör försiktigt omrörning av lösningen med spetsen för att blanda Master Mix och mall. Var noga med att lägga mallen till rätt plats till mATCH plattan layout beskrivs i avsnitt 1.2.
- Se till att en PCR-rör remsa adapter för mikro är på plats.
- Fördela 2.5 pl magnesium acetat i varje rör lock som kommer att placeras på ett rör innehållande en qRPA reaktion.
- Placera försiktigt locken ovanpå PCR-rören så att de inte är helt slutna och kan tas bort. Magnesiumacetatlösning kommer att följa locken och tydligt vara synliga från ovan.
- Sätt varje PCR-rör remsa med lock i varje sida av rörhållaren PCR. Stäng locket på minifug att snurra magnesiumacetat ur locken och in RPA reaktionen, initiera RPA reaktionen. Centrifugera tills alla bubblor är eliminerade och all vätska uppsamlas i botten av varje rör (ca 10 sek).
- Snabbt ta bort röret remsorna PCR och returnera dem till det kalla blocket att stoppa qRPA reaktioner.
- Försiktigt bort locken för att förhindra aerosolbildning och försegla varje PCR-rör remsa med snittetbitar av tydliga mikrotätningsfilm.
- Snabbt gå till värmecykeln och ladda de två PCR-rör remsor i värmecykeln på de platser som matchar plattlayouten (brunnar A1-B8). Stäng locket på termocyklern, klicka på "Start Kör" och utse ett filnamn för experimentet.
OBS: Även om tillverkaren rekommenderar agitera provet efter 5 min av inkubation, är detta steg inte nödvändigt för denna analys och kan utelämnas. - Efter körningen är klar, välj "Inställningar", "Baseline Inställning", "No Baseline Subtraktion" att visa de råa fluorescensdata. Exportera data till ett kalkylprogram genom att välja "Export", "Exportera alla Bladen till Excel." En fil med tillägget "Kvantifiering Amplification Results" kommer att skapas som innehåller de råa realtid fluorescens uppgifter.
4. Utveckla en intern positiv kontroll
- Välj en DNA-sekvens från en art som är osannolikt att finna i det riktade urvalet. Sekvensen måste vara längre än målamplikonen så att generering av målsekvensen gynnas.
OBS: För denna analys, Cryptosporidium parvum, en tarmparasiten, valdes för att tjäna som mall för generering av IPC-sekvensen eftersom denna organism är osannolikt att finna i blod och var tillgänglig i labbet från ett annat projekt. För att generera IPC-sekvensen, extrahera och rena DNA från C. parvum oocystor som beskrivs på annan plats 18. - Köp framåt (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') och bakåt (5'CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') primers från kommersiella källor. IPC PCR-primrar som användes i denna analys visas i Figur 1 och innehåller en region som är komplementär till IPC mall DNA (t.ex. C. parvum, lila i figur 1) och en region som är gratis för målorganismen (t.ex. HIV-1, blå i figur 1).
- Utför PCR med hjälp av primers och IPC-mall-DNA.
- Montera 50 pl PCR-reaktioner med hjälp av Phusion hifi-DNA polymeras reagenser enligt tillverkarens anvisningar, exklusive polymeras. Använd 2 pl DNA-mall och Phusion Buffer HF.
- Till Phusion polymeras till varje reaktion efter en varm start vid 98 ° C, följt av 60 sek vid 98 ° C, följt av 40 cykler av 15 sek vid 98 ° C, 30 sek vid 62 ° C och 30 sek vid 72 ° C med en slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min. Efter termisk cykling, hålla proverna vid 4 ° C.
- Analysera prover genom gelelektrofores på en 2% TAE agarosgel, och sedan extrahera och rena DNA med hjälp av QIAquick Gel Extraction Kit enligt mikroprotokoll medföljersatsen.
- Skärm IPC kandidater för deras förmåga att förstärka med hjälp qRPA.
- Förbered qRPA reaktioner som beskrivs i avsnitt 3, med hjälp av HIV-1 primer, ett FAM-märkt sond specifika för IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '), och totalt 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, eller 10 5 exemplar av varje IPC kandidat per reaktion, testa alla koncentrationer i duplikat.
- Välj IPC kandidaten som förstärker mest konsekvent och har den lägsta gräns-of-detektion.
- Co-förstärka HIV-1 och IPC att bestämma den optimala koncentrationen av IPC-DNA.
- Liknar Avsnitt 3, kombinera följande i varje 50 pl reaktion: 29.5 pl rehydrering buffert, 2.1 pl RPA framåt primer [10 iM], 2.1 pl RPA omvänd primer [10 iM], 0,6 pl HIV-1 HEX -märkt sond [10 uM], 10 | ilav HIV-1-DNA vid varierande koncentrationer, 2,5 | il av magnesiumacetat, och ett enzympellet. Istället för att lägga 3,2 pl nukleasfritt vatten som gjordes i steg 3.2.4, till 0.6 pl IPC FAM-märkt sond [10 iM], och 2,6 pl IPC-DNA. Använd IPC koncentration som är gränsen-för-detektion (LOD) när qRPA utförs med IPC-DNA enbart (LOD definieras som den lägsta koncentration, där mängden fluorescens signalgenerering är större än den som genereras av den fluorescens som genereras av proverna med inget mål-DNA).
- Inkubera prover med det protokoll som beskrivs i avsnitt 1.1.
- Om IPC inte förstärka i varje prov, anser att upprepa experimentet med en IPC koncentration en storleksordning högre. Den optimala koncentrationen av IPC-DNA för HIV-1-analysen är 10.000 kopior / | il. Medan proverna anses giltiga om det finns antingen IPC eller HIV-1 DNA-amplifiering, helst IPC uppvisar detekterbara förstärkning förvarje reaktion.
5. Att bygga en standardkurva från flera experiment
- Se till data för varje experiment har exporterats till ett kalkylprogram som beskrivs i Avsnitt 3.13.
- Öppna och köra skriptet "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Alla ingångar automatiskt uppmanas i kommandofönstret. Efter skriptet initieras användaren automatiskt uppmanas att utse den "Antal datafiler" används för att bygga standardkurvan.
- I kommandofönstret skriver du antalet filer som ska användas för att bygga standardkurvan och tryck enter.
- Skriv in kommandofönstret antalet prover och antalet replikat i varje träningsfilen (tryck på RETUR efter varje post).
OBSERVERA: I plattslayouten beskrivs i avsnitt 1.2, fanns det sex prover med olika koncentrationer och två replikat av varje prov). - Skriv in kommandofönstret lägst DNEn koncentration som används för att bygga standardkurvan (i log10 kopior) och tryck enter (för plattan layout som beskrivs i avsnitt 1.2, är den lägsta mallkoncentrationen 'en' log10 kopior).
- Skriv in kommandofönstret skillnaden i koncentration mellan varje standard (i log10 kopior) tryck sedan på Retur (för plattan layout som beskrivs i avsnitt 1.2, är koncentrationen intervallet "1" log10 kopior).
- Efter att du har bekräftat skriver "Slope tröskel" i kommandofönstret och tryck på enter.
- I kommandofönstret, skriver "Number (z) standardavvikelser över bakgrunden för positiv tröskel" och tryck sedan på enter. Typiska värden för z intervall från 1 till 5.
- Ange om uppgifterna samlades in med hjälp av värmecykeln ('1'), * .tiff mikroskop bilder ('2'), eller * bilder .jpg mikroskop ('3') genom att skriva numret "1", "2" eller "3" och pressing anger.
- Välj att ställa in en ny IPC tröskel eller att använda ett standardvärde för tröskeln genom att skriva "y" eller "n", respektive, vid uppmaning.
- Därefter väljer varje kalkylbladsfiler som används för att bygga standardkurvan.
OBS: Skriptet kommer då automatiskt att importera data HEX och FAM fluorescens; avgöra om varje reaktion var giltigt (dvs, om fluorescens signaler till tröskelvärdena för HEX eller FAM kanaler); bestämma r2 koefficienten för en exponentiell, linjär, och andra ordningens polynomanpassning; plot "log10 kopior kontra cykel tröskel" för varje prov som används för att bygga standardkurvan; och skapa ett kalkylblad som innehåller viktiga variabler för att bygga om standardkurvan för valideringsexperiment utan att användaren att åter komma in alla inparametrar igen.
6. Analys Validering och kvantifiering av okända prover Användastandardkurvan
- Använd skriptet "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" för att uppskatta den precision och noggrannhet i analysen genom att använda prover med kända koncentrationer eller använda den för att kvantifiera prover med okända koncentrationer.
OBS: Eftersom tidigare publicerad forskning visade att en exponentiell passning gav den bästa r-kvadrat koefficienten 18, skriptet använder en exponentiell passform för standardkurvan. Om en annan typ av passning önskas kan skriptet ändras.- Öppna och köra skriptet "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Efter skriptet initieras användaren automatiskt uppmanas att ange alla ingångar i kommandofönstret.
- Ange '1' för att validera en analys med hjälp av en standardkurva med kända provkoncentrationer eller ange "2" för att kvantifiera okända prover.
- När du uppmanas att antingen välja en sparad standardkurva eller bygga ett nytt genom att ange the information som automatiskt beställt i kommandofönstret (samma information som krävs för "JoVE_qRPA_standard_curve.m" manus från avsnitt 5).
- Skriv in antalet försök (dvs, kalkylbladsfiler) för att analysera för validering / kvantifiering.
7. Förberedelser för datainsamling Använda ett fluorescensmikroskop och en uppvärmd Chip
- Se till fluorescensmikroskop har en etapp värmare och 1-Kanal Precision Hög stabilitet temperaturregulator på plats.
- Se till fluorescensmikroskop har ett filter kub att excitera och samla fluorescens från varje fluoroforen. Excite och samla FAM fluorescens genereras under IPC DNA förstärkning genom en GFP filter (excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm). Excite och samla HEX fluorescens genereras under HIV-1 DNA förstärkning genom ett HEX-filter (excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm).
- Använd mikroskop script redigeringsprogram för att skapa en automatiserad algoritm för att replikera data-samling på termocyklern.
- Först infoga ett "Inställningar" steg för att stänga slutaren. Nästa lägga till en "Exponering" steg för att ställa in exponeringen för 60 sek. Sätt i ett "Snap" för att verkställa 60 sek fördröjning, som implementerar 1 min förinkubationsperiod. Lägg en "Inställning" steg för att ändra arbetsgrupp för att GFP filtret. Sätt i en annan "Exponering" steg för att justera exponeringen till 200 ms. Samtliga exponeringar som använder GFP eller HEX filter kuberna kommer att sättas till 200 ms.
- Efter "Exposure" steg, lägg till en "Snap" och ange kameran med vilken bilden kommer att tas. Använd en annan "Inställning" steg för att stänga slutaren och en "Spara bild" steg för att spara bilden i en användardefinierad temporär mapp.
- Nästa byta till HEX filter kuben med en annan "Inställning" steg och thsv lägga till en "Exposure" på 200 ms, en "Snap" och en "Spara bild" steg.
- Upprepa denna process 59 gånger med en initial fördröjning på 20 sek istället för 60 (nära slutare, vänta 20 sek, byta till GFP filter kub, ställa in exponering till 200 ms, snap, nära slutare, spara, byta till HEX filter kub, ställa in exponering till 200 msek, snap).
- Skapa ett chip som kommer att hålla qRPA reaktioner.
- För experiment med användning av mikroskopet, använda filen JoVE_qRPA_base.ai att skära en 40 x 15 mm rektangulär bas från ett ark av 8/1 "tjock svart akryl med hjälp av en laserskärare satt till 100% effekt, 10% varvtal.
- Använd filen JoVE_qRPA_well.ai att skära reaktion väl som består av en 10 x 10 mm i kvadrat med en 5 mm diameter cirkulärt hål skurna från ett ark av 1,5 mm tjock klar akryl.
- Anslut upp till tre brunnar till en enda bas använder superlim gel.
- Torka över natten.
8. Datainsamling och Analysis ett fluorescensmikroskop
- Förbered mikroskop för datainsamling genom att ladda den automatiska datainsamling script JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
- Ställ scenen värmaren till 48 ° C och förvärma reaktions chip på scenen värmare för ca 20 min. En temperaturinställning av 48 ° C upprätthåller en temperatur av 39 ° C i reaktionskällan (data ej visade).
- Med användning av en 10X, 0,45 NA objektiv, fokusera på toppen av den inre kanten av reaktionen väl med GFP filtret på plats. Kanterna på akryl är autofluorescerande efter laserskärning och kan lätt visualiseras. Efter fokusering, inte justera höjden på mikroskop scenen tills alla uppgifter samlas.
- Montera qRPA Master Mix i en utsedd pre-förstärkning arbetsyta som beskrivs i steg 4.5.1. För varje prov, blanda en enzympellet, Master Mix, och HIV-1 DNA-mall i ett mikrocentrifugrör. Lägg 2,5 pl av magnesiumacetat till den första reaction och kort virvel.
- Snabbt transportera mikrocentrifugrör innehåller qRPA provet till fluorescensmikroskop.
- Försiktigt pipett 30 ìl av RPA reaktionen i reaktions väl utan att skapa bubblor. Placera en droppe av PCR-grade mineralolja över RPA reaktionen för att förhindra avdunstning.
- Placera väl direkt under mikroskop målet, var noga med att bilden endast i mitten av brunnen, inte någon av de auto-fluorescerande akryl kanter. Efter väl position, kör den automatiserade skript 7. Skriptet genererar en JPEG-bild med hjälp av FAM filter kub och en JPEG-bild med hjälp av HEX filter kuben var 20 sek.
- Efter skriptet är klar, överföra dessa bilder från mappen tillfällig lagring innan du kör ytterligare prover.
- Skapa två mappar: 1 för varje fluoroforen (dvs "HEX" och "FAM"). Förvara båda mapparna i samma överordnade mappen. I varje fluoroformapp, skapa en mapp märkt med antalet DNA-kopior som finns i provet (t.ex. 0, 10, etc.).
- Överför alla filer med prefixet "HEX" i motsvarande undermapp i "HEX" mappen. Överför alla filer med prefixet "GFP" i motsvarande undermapp i "FAM" mappen.
- Upprepa avsnitt 8,2-8,4 för qRPA reaktioner med 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4 och 10 5 HIV-1 DNA-kopior.
- Efter insamling av data för alla qRPA prover i ett experiment, ladda skriptet "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." När du uppmanas av skriptet, välj den överordnade mappen som innehåller de två fluoroforenhetema mappar, som i sin tur innehåller bilderna för varje koncentration i undermappar.
OBS: Skriptet kommer automatiskt generera ett kalkylblad i moderkatalogen där HEX fluorescens data sparas i ett ark named "HEX", och FAM fluorescens data sparas i ett ark som heter "FAM". I varje ark, är cykelnummer som anges i kolumn B, och fluorescensuppgifter i realtid för ökande koncentrationer av mall ges i kolumnerna C, D, osv. Varje realtid fluorescens nollpunkt är den genomsnittliga fluorescensintensitet av bilden fångas vid denna tidpunkt. - Använd standardpunktdiagram funktion i kalkylprogrammet för att rita cellerna B2: H61 av "HEX" och "FAM" ark för att visualisera realtid fluorescens och generera tomter liknande de i figurerna 2A, 2B, 3A och 3B.
OBS: kalkylblad genererats i steg 8,6 kan också användas i skripten "JoVE_qRPA_standard_curve.m" och "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan man väljer en sekvens för att tjäna som IPC i qRPA experiment med målet (HIV-1) DNA, intern positiv kontroll (IPC) kandidater genereras och screenas för deras förmåga att amplifiera i qRPA reaktioner utan HIV-1 DNA närvarande. IPC kandidater är längre än målet (HIV-1) DNA för att förhindra IPC bildning från ut-konkurrerande hiv-1 amplicon bildning. Såsom visas i fig 2A, alstringen av två C. parvum IPC kandidater verifierades genom närvaron av 415 och 435 bp band med hjälp gelelektrofores. I qRPA reaktioner, den kortare IPC kandidaten uppvisade liten förstärkning (Figur 2B), medan den längre kandidaten konsekvent förstärks när totalt 10 4 och 10 5 kopior var närvarande (figur 2C). Således var längre kandidaten vald att vara IPC för HIV-1 qRPA experiment.
Realtids qRPA kan utföras med användning av målet av intresse enbart eller med användning avbåde målet och IPC. Figur 3 visar ett experiment på värmecykeln med användning av både HIV-1 DNA och C. parvum IPC. I detta experiment var 2,6 x 10 4 kopior av IPC-DNA sätts till varje reaktion, en koncentration nära IPC detektionsgränsen, för att undvika att påverka detektionsgräns av HIV-1 mål-DNA. Som visas i figur 3A, som visar HEX fluorescens data motsvarande realtid HIV-1 DNA generationen, är den tidpunkt då detekterbara förstärkning börjar omvänt proportionell mot det ursprungliga målet koncentrationen. Således är amplifiering uppenbar tidigare för höga koncentrationer av HIV-1-DNA och senare för låga koncentrationer av HIV-1-DNA. Däremot detekterbar amplifiering av IPC-DNA börjar vid ungefär samma tid, eftersom utgångs IPC koncentrationen är densamma i alla prover, såsom visas i figur 3B, som visar FAM fluorescensdata som motsvarar IPC-DNA bildning under than samma experiment. Hastigheten av fluorescensgenerering från IPC är omvänt proportionell mot koncentrationen av HIV-1-DNA på grund av konkurrens under amplifiering.
Med målet att utveckla en fält manövreras fluorescens läsaren med qRPA reaktioner, kan qRPA experiment utföras på en upprätt fluorescensmikroskop med en scen värmare och 1-Kanal Precision Hög stabilitetstemperaturregulator. Figur 4A och 4B display HEX och FAM fluorescensdata samlas på ett mikroskop. Uppgifter som samlats in på mikroskopet med laserskurna chips visar svag variabilitet i baslinje fluorescens och kammar och dalar som kan vara på grund av fotoblekning. Bestämmer emellertid skriptet cykeltröskeln med hjälp av graden av förändring av fluorescens under den initiala amplifieringen perioden, vilken är opåverkad av baslinje fluorescens eller en förändring i fluorescens efter den initiala amplifiering har skett. Såsom ses i Figur 4C, standardkurvan byggs från detta experiment har en r2 koefficient 0.990. Noterbart är IPC förstärks endast för låga koncentrationer av HIV-1-DNA. Även om detta beteende skiljer sig från experiment utförda på termocyklern är alla prover fortfarande klassas som giltigt med denna metod.
Data från flera experiment med kända målkoncentrationer kan sammanställas för att konstruera en standardkurva, som sedan kan användas för att bedöma analysens prestanda eller kvantifiera prover med okända koncentrationer. Figur 5 visar data från fem experiment och en exponentiell standardkurva genereras med hjälp av skript "JoVE_qRPA_standard_curve.m", som avser den inledande HIV-1 målkoncentration till den tidpunkt då detekterbara förstärkning började. Figur 5 använde fem separata experiment, vardera innehållande 2 qRPA reaktioner vid varje mall koncentration för att bygga en standardkurva. Notera att den exponentiellapassform har en hög r2 koefficient 0,959. Standardkurvan användes sedan för att förutsäga koncentrationen av ytterligare prover med kända koncentrationer för analysvalidering använder skriptet "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" skript. Tabell 1 visar kvantifieringen resultat för 5 ytterligare experiment med användning av standardkurvan i Figur 5. Notera att algoritmen korrekt klassificerat alla prover som innehåller HIV-1-DNA som positiv och 9 av 10 av de no-mål-kontrollprover som negativa. Dessutom var den genomsnittliga förväntade koncentrationen inom en storleksordning av rätt koncentration och standardavvikelsen för förväntade koncentrationerna var mindre än 0,5 log10 (kopior per reaktion).
Figur 1:. Blockdiagram av kvantitativa RPA DNA-mål QRPEn analys förstärker två DNA-sekvenser flankerade av identiska sekvenser till vilka primrarna binder ("RPA framåt" och "RPA omvända"). De förstärkta sekvenserna är 1) en sekvens inom HIV-1-genomet ("HIV-1") som detekteras med "HIV-1-sond" och 2) en intern positiv kontrollsekvens ("IPC (C. parvum)") inkluderas i varje reaktion som detekteras med "IPC sonden." IPC alstrades via PCR med användning av Cryptosporidium parvum-genomet som en mall och primrar ("PCR framåt" och "PCR-bakåt") som innehåller en region som är komplementär till C. parvum (lila) och en region som är komplementär till HIV-1 (blå). Figur ursprungligen publicerades i analytisk kemi 2014, omtryckt här med tillåtelse 9.
Figur 2:
Figur 3: Typiska rå fluorescens data som genereras vid samtidig amplification av HIV-1 DNA och IPC på en termisk cykler. (A) För HIV-1, uppkomsten av detekterbara förstärkning, framgår av en påtaglig ökning av HEX fluorescens, inträffar tidigare för höga koncentrationer av HIV-1-DNA. (B) För IPC, uppkomsten av detekterbara förstärkning, framgår av en påtaglig ökning av FAM fluorescens, inträffar vid ungefär samma tidpunkt oavsett HIV-1 DNA-koncentration. Emellertid är omvänt proportionell mot mängden av HIV-1 DNA närvarande hastigheten för FAM fluorescens generering grund av konkurrens. Figur ursprungligen publicerades i analytisk kemi 2014, omtryckt här med tillåtelse 9.
Figur 4: Typiska rå fluorescens data som genereras vid samtidig förstärkning av HIV-1 DNA och IPC på ett mikroskop (A) Liknar data som genereras på t.Han termocykler, uppkomsten av detekterbart HIV-1-förstärkning, som visas av en påtaglig ökning av HEX fluorescens, inträffar tidigare för höga koncentrationer av HIV-1-DNA. (B) IPC-förstärkning på mikroskopet, som visas av FAM fluorescens, framgår för låga HIV-1 DNA-koncentrationer, men inte alltid tydligt i prover med höga HIV-1 DNA-koncentrationer. (C) En standardkurva kan byggas med hjälp av de JoVE_standard_curve.m skript som ger en hög r2 koefficient.
Figur 5:. Typisk standardkurva för HIV-1 Använda JoVE_standard_curve.m skriptet, rå HEX fluorescensdata som genereras under HIV-1 amplifiering bearbetas för att bygga en standardkurva, vilken kan användas för att förutsäga den HIV-1-DNA-koncentration av okänd prover. Denna standardkurva (z = 1) genererades med hjälp av data från 5 experiments, i vilken sex koncentrationer testades med användning av två replikat vid varje koncentration. Alla koncentrationer anges i log10 kopior. Figur ursprungligen publicerades i analytisk kemi 2014, omtryckt här med tillåtelse 9.
Figur 6:. Algoritm avstämbarhet Justering av algoritmparametrarna ändrar standardkurva som används för att bestämma den koncentration av okända prover. Den JoVE_validation_and_quantification.m manus användes för att bestämma den koncentration av okända prover med z = 1 (röd) och z = 5 (blå). Alla koncentrationer anges i log10 kopior. Förutsägelser är mer exakt för låga DNA-koncentrationer då z = 1; tipsen är säkrare för höga DNA-koncentrationer då z = 5. Genom att justera algoritmparametrarna kan qRPA standardkurvan inställda enligt kliniska behov. Figurursprungligen publicerat i analytisk kemi 2014, omtryckt här med tillåtelse 9.
| Prov Koncentration | Genomsnittlig förväntad koncentration | Standardavvikelse | Procent av prover identifieras som positiva |
| Inga målgruppkontroller | 0,1 | 0,3 | 10% |
| 1 | 0,9 | 0,1 | 100% |
| 2 | 2,2 | 0,5 | 100% |
| 3 | 3 | 0,1 | 100% |
| 4 | 3,7 | 0,1 | 100% |
| 5 | 4,2 | 0,2 | 100% |
Tabell 1: HIV-1 qRPA analys validering Använda standa.rd kurvan i Figur 4, var JoVE_validation_and_quantification.m skriptet som används för att förutsäga koncentrationerna (i log10 kopior) av prover för fem ytterligare experiment. Tabell ursprungligen publicerades i analytisk kemi 2014, omtryckt här med tillåtelse 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att få en ändamålsenlig kvantifiering data med hjälp av MATLAB-algoritmen måste användaren välja lämpliga ingångsvärden vid uppmaning. Efter initiering varje manus i avsnitten 5 och 6, är alla ingångsvariabler automatiskt önskade i kommandofönstret och utgångar genereras automatiskt. I avsnitt 5.7 användaren uppmanas att välja en sluttning tröskel. Värdet på tröskeln lutning påverkar kvadraten på korrelationskoefficienten (r 2) i passform. Vid användning av rå fluorescens data som exporteras från ett termocykler, värden mellan 2,0 och 5,0 tenderar att ge en hög r2 koefficient. I avsnitt 5.8 måste användaren ange antalet standardavvikelser över bakgrunden för att ställa den positiva tröskeln. Gör mål ett prov som positiva eller negativa, bestämmer skriptet automatiskt provskillnaden Δ mellan den högsta och lägsta fluorescens för varje prov med hjälp av rå fluorescens data som exporteras från Thermal cycler. Den beräknar den genomsnittliga skillnaden Δ bakgrund och standardavvikelse σ bakgrund för alla utan målgruppen kontrollprover. Ett prov anses positivt om Δ provet är mer än z × σ bakgrund ovanför Δ bakgrund. I avsnitt 5.10 användaren bestämmer om du vill använda standard tröskel eller ställa en ny tröskel. Om användaren önskar att sätta en ny tröskel, bestämma den nya tröskeln experimentellt genom att utföra tre experiment som vardera innehåller 12 RPA reaktioner utan HIV-1 DNA närvarande. Ställ tröskeln vid den genomsnittliga ökningen i fluorescensintensitet från dessa experiment plus 3 standardavvikelser. Efter att ha avslutat 6 § återgår manuset JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m automatiskt beräknade DNA-koncentrationen för varje qRPA reaktion (i log10 kopior). Om skriptet bestämmer att ingen HIV-1 DNA i provet, är den beräknade koncentrationen anges som antingen "Netiva för HIV "eller" Ogiltig ", beroende på om den fluorescerande signalen för den inre positiva kontrollen överskridit gränsvärdet (z × σ bakgrund + Δ bakgrund). Om användaren validerar standardkurva med kända provkoncentrationer kommer skriptet också returnera ytterligare en tabell liknande den i tabell 1.
För att utveckla en realtids RPA-analys som ger exakt kvantifiering, är experimentell konsistens avgörande. Till exempel använder samma primer och sond portioner för både standardkurvan och valideringsexperiment. Också undvika frys-tö-cykler genom lagring av primer och sond alikvoter vid 4 ° C mellan experiment i stället för -20 ° C. Mall alikvoter används för standardkurvan och valideringsexperiment lagras på samma sätt. RPA enzympellets och reagenser från samma parti används enligt tillverkarens rekommendationer. Slutligen becaAnvänd RPA saknar riktiga "cykler" att exakt kontrollera graden av förstärkning, är standardisering av användarsteg absolut nödvändigt. Vid montering reaktioner, måste användaren alltid följa samma steg i samma ordning, spenderar ungefär lika mycket tid på varje steg. Reaktioner måste alltid blandas försiktigt med en ny pipett och bubblor måste alltid elimineras. Före förstärkning, måste reaktionerna hållas vid en jämn temperatur och värmecykeln eller mikroskop programvara måste alltid vara beredd innan du lägger reaktioner att undvika förstärkning vid suboptimala temperaturer som kan påverka kvantifieringen. Alla variationer i de inledande reaktionsförhållandena kan leda till inkonsekvens i experimentella resultat.
När du använder ett mikroskop för att samla in data, måste ytterligare variabler kontrolleras för att minimera variation i fluorescensintensitet. Alla reaktioner måste placeras i samma region på scenen varmare och microscope måste inriktas på samma område i brunnen för varje prov. Även om dessa metoder följs, kan fluorescens data som samlas på ett mikroskop uppvisa variabilitet på grund av lokala ljuspunkter som naturligt bildas under RPA reaktioner, bubbelbildning inom reaktionskammare eller fotoblekning följd av upprepad exponering för excitation ljus. Inverkan av dessa variabler är tydlig i fluorescens data som samlas på mikroskop (Figur 4A och 4B), som visar baslinje variabilitet, toppar och dalar. Dessa funktioner är frånvarande från fluorescens uppgifter som samlats in på värmecykeln (Figur 3A och 3B). Ytterst är datainsamling på mikroskopet för korrektur av princip endast syften och den slutliga analysen kommer att genomföras på ett fält-manövrerbar fluorescens läsare med mer exakt geometri och styrprogramvara som minimerar dessa variabler.
En annan viktigaspekt av qRPA analys utvecklingsprocessen är konsekvens i databehandling. Protokollet beskrivs i avsnittet metoder använder skript för att bearbeta rå fluorescens data (som lagras i ett kalkylblad) som samlats in från ett termocykeln eller mikroskop. Alla experiment används för att bygga standardkurvan måste formateras identiskt. När du använder en värmecykeln att samla in data, måste samma platta layout användas, och data från brunnar som inte innehåller RPA reaktioner får inte exporteras. När du använder ett mikroskop för att samla in data, måste formatet på de uppgifter matchar formatet på data automatiskt exporteras från apparaten. Till exempel måste data accepteras inget-mål-kontroll vara i cellerna C2: C61, och data för att öka templatkoncentrationer måste vara i cellerna D2: D61, E2: E61, etc. Om det finns flera replikat av varje koncentration i ett experiment, 2: a replikera spädningsserie måste beställas från vänster till höger från inget mål kontroll (NTC) till högsta koncentrationen ochsparas i kolumnerna omedelbart till höger om ett st replikera utspädningsserie. Till exempel i plattan layout som används i avsnitt 1.2 med 2 replikat för varje prov, fluorescens data för den 1: a kopia av varje prov i utspädningsserie måste sparas i cellerna C2: H61 och fluorescensdata för 2: a satsen av varje prov i utspädningsserie måste sparas i cellerna I2: N61. För plattan layout som används i avsnitt 1.2, är detta standardformatering när exportera data från apparaten mjukvaran till ett kalkylblad.
Representativa uppgifter från HIV-1 qRPA experiment visar proof-of-concept stöd som RPA kan användas för kvantifiering av nukleinsyra koncentration i okända prov. Kliniskt användbara HIV-1 virusmängd tester har en klinisk räckvidd på minst fyra tiopotenser, en precision på 0,5 log10 kopior, och en gräns-of-detektion av minst 200 exemplar 19,20. HIV-1-DNA-analys som beskrivits uppfyller dessa criteria och är mest exakt vid låga koncentrationer, såsom visas i tabell 1. Därför, med införandet av ett omvänt transkriptas steg, antyder dessa resultat att ett HIV-1 RT-RPA-analys kan ha potential för att mäta HIV-1 virusmängd i kliniska prover. När man utvecklar en qRPA assay, justera algoritmparametrarna kan trimma känsligheten och linjära dynamiska område beroende på det kliniska behovet. Figur 6 visar att en anpassning (en parameter som fastställer tröskeln för positiva prov) z kan påverka känsligheten och noggrannheten vid låg och hög målkoncentrationer. Dessutom kan det vara möjligt att öka upplösningen och noggrannheten av kvantifiering genom inkubation reaktioner vid en lägre temperatur eller använda mindre magnesium acetat, och därmed minska graden av förstärkning.
Denna koncept qRPA analys kan användas för att kvantifiera koncentrationen av prover innehållande HIV-1-DNA. Den qRPA analys som beskrivs i denna manuscript innehåller detaljerade instruktioner om hur man monterar realtid RPA reaktioner, utveckla och screena ett IPC, och bearbeta rå fluorescens uppgifter för att bygga en standardkurva som kan användas för att kvantifiera okända prover. Med de detaljerade anvisningar som ingår, kan detta protokoll anpassas för att kvantifiera DNA-koncentration i en mängd olika prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av ett anslag från Bill & Melinda Gates Foundation genom stora utmaningarna i Global Health Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qRPA Assay | |||
| HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
| HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
| HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
| IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
| RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
| PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
| PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
| Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
| HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
| Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
| 96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
| Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
| MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | |
| Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| IPC Development | |||
| Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
| PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
| PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
| Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Microscope Experiments | |||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
| Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
| 1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
| FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
| HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
| Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
| 1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
| 1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
| Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
| PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
| Data Analysis | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| MATLAB | MATLAB | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
| MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
| JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
| AxioVision software | Zeiss | ||
| JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |
References
- Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
- Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
- Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
- Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99 (2014).
- Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
- Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082 (2012).
- Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
- Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
- Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642 (2013).
- Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730 (2014).
- Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15 (2010).
- Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
- DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
- Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
- Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869 (2014).
- Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).
