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Bioengineering

मल्टीमॉडल आण्विक इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए Biofunctionalized प्रशिया ब्लू नैनोकणों

Published: April 28, 2015 doi: 10.3791/52621
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,3,4
1The Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Medical Center, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 3Department of Radiology, George Washington University, 4Department of Pediatrics, George Washington University

Abstract

मल्टीमॉडल, आणविक इमेजिंग एकाधिक, पूरक इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर, सेलुलर subcellular, और आणविक स्तर के प्रस्तावों पर जैविक प्रक्रियाओं के दृश्य की अनुमति देता है। ये इमेजिंग एजेंट दोनों नैदानिक ​​और चिकित्सीय प्रभावकारिता को बढ़ाने के जो vivo में रास्ते और तंत्र के वास्तविक समय आकलन की सुविधा। बहुविध, आणविक इमेजिंग अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए एजेंटों की एक उपन्यास वर्ग - यह लेख biofunctionalized प्रशिया नीले नैनोकणों के संश्लेषण (पंजाब एनपीएस) के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। नैनोकणों, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) में शामिल रूपरेखा इमेजिंग, पूरक विशेषताएं हैं। पंजाब एनपीएस gadolinium और मैंगनीज आयनों टी -1 और टी 2 भारित दृश्यों में दोनों, पंजाब जाली के मध्य रिक्त स्थान के भीतर शामिल किया एमआरआई इसके विपरीत उत्पन्न जहां एक कोर-खोल डिजाइन के पास है। पंजाब एनपीएस इलेक्ट्रोस्टैटिक का उपयोग कर फ्लोरोसेंट avidin के साथ लेपित हैं आत्म-रूपप्रतिदीप्ति इमेजिंग सक्षम बनाता है जो विधानसभा,। avidin लेपित नैनोकणों नैनोकणों के लिए आणविक लक्ष्य-निर्धारण क्षमताओं प्रदान कि biotinylated ligands के साथ संशोधित कर रहे हैं। नैनोकणों की स्थिरता और विषाक्तता उनकी एमआरआई relaxivities, साथ ही मापा जाता है। इन biofunctionalized पंजाब एनपीएस की बहुविध, आणविक इमेजिंग क्षमताओं तो प्रतिदीप्ति इमेजिंग और इन विट्रो में आणविक एमआरआई के लिए उन्हें का उपयोग करके प्रदर्शन कर रहे हैं।

Introduction

आण्विक इमेजिंग सेलुलर, subcellular पर जैविक प्रक्रियाओं, और आणविक स्तर को एक के गैर इनवेसिव और लक्षित दृश्य है। आण्विक इमेजिंग अपनी अंतर्जात रास्ते और तंत्र वास्तविक समय में मूल्यांकन कर रहे हैं, जबकि इसके मूल microenvironment में रहने के लिए एक नमूना परमिट। आमतौर पर, आणविक इमेजिंग दो अध्ययन किया जा रहा है, कल्पना लक्ष्य, और प्रासंगिक शारीरिक प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए एक छोटा सा अणु, macromolecule, या nanoparticle के रूप में एक बहिर्जात इमेजिंग एजेंट के प्रशासन शामिल है। आणविक इमेजिंग में पता लगाया गया है कि विभिन्न इमेजिंग रूपात्मकता एमआरआई, सीटी, पीईटी, SPECT, अल्ट्रासाउंड, photoacoustics, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी, bioluminescence, प्रतिदीप्ति, और intravital माइक्रोस्कोपी 3 शामिल हैं। मल्टीमॉडल इमेजिंग संयोजन कल्पना और विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं और घटनाओं 4 चिह्नित करने की क्षमता को बढ़ाता है, जहां दो या दो से अधिक इमेजिंग तौर तरीकों का संयोजन है। Multimodaअपनी व्यक्तिगत सीमाओं 3 के लिए compensating जबकि एल इमेजिंग, व्यक्तिगत इमेजिंग तकनीक की ताकत का लाभ उठाते।

बहुविध, आणविक इमेजिंग एजेंटों की एक उपन्यास वर्ग - यह लेख biofunctionalized प्रशिया नीले नैनोकणों के संश्लेषण (पंजाब एनपीएस) के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। पंजाब एनपीएस प्रतिदीप्ति इमेजिंग और आणविक एमआरआई के लिए उपयोग किया जाता है। पंजाब एक चेहरा केन्द्रित घन नेटवर्क में लोहा (द्वितीय) और लोहे (तृतीय) परमाणुओं बारी से मिलकर एक वर्णक (चित्रा 1) है। सीएन - - अपने तीन आयामी नेटवर्क 5 के भीतर आरोपों संतुलन के लिए फैटायनों को शामिल किया गया है कि फे तृतीय लिंकेज पंजाब जाली एक फ़े द्वितीय में रेखीय साइनाइड ligands के शामिल है। इसके जाली में फैटायनों शामिल करने के लिए पंजाब की क्षमता अलग-अलग एमआरआई इसके विपरीत के लिए पंजाब एनपीएस में gadolinium और मैंगनीज आयनों लोड करके शोषण किया जाता है।

एमआरआई इसके विपरीत के लिए एक nanoparticle डिजाइन का पीछा के लिए तर्क की वजह से हैफायदे इस डिजाइन वर्तमान एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों के सापेक्ष प्रदान करता है। अमेरिकी एफडीए को मंजूरी दे दी एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों के विशाल बहुमत के स्वभाव में समचुंबक हैं और स्पिन जाली छूट तंत्र 6,7,8 द्वारा सकारात्मक विपरीत प्रदान कि गैडोलीनियम chelates हैं। अपने दम पर कम संकेत तीव्रता प्रदान करता है कि एक एकल गैडोलीनियम-chelate की तुलना में, नैनोकणों के पंजाब जाली के भीतर अनेक गैडोलीनियम आयनों के समावेश के संकेत तीव्रता (सकारात्मक विपरीत) 3,9 बढ़ाकर प्रदान करता है। इसके अलावा, पंजाब जाली के भीतर अनेक गैडोलीनियम आयनों की मौजूदगी जिससे स्पिन स्पिन छूट तंत्र द्वारा नकारात्मक विपरीत पैदा करने, समग्र स्पिन घनत्व और उसके आसपास के क्षेत्र में स्थानीय चुंबकीय क्षेत्र परेशान है जो नैनोकणों के paramagnetism की भयावहता, बढ़ जाती है। इस प्रकार गैडोलीनियम युक्त नैनोकणों टी (सकारात्मक) 1 और 2 टी (नकारात्मक) विपरीत एजेंटों 10,11 के रूप में दोनों कार्य करते हैं।

बिगड़ा गुर्दे समारोह के साथ रोगियों के एक सबसेट में, गैडोलीनियम आधारित विपरीत एजेंटों के प्रशासन वृक्कजनक प्रणालीगत फाइब्रोसिस 8,12, 13 के विकास के लिए जोड़ा गया है। इस अवलोकन विपरीत एजेंटों के रूप में वैकल्पिक समचुंबक आयनों के उपयोग के लिए जांच के लिये कहा गया एमआरआई। इसलिए, नैनोकणों के बहुमुखी डिजाइन पंजाब जाली भीतर मैंगनीज आयनों को शामिल करने के लिए अनुकूल है। गैडोलीनियम-chelates के लिए इसी प्रकार, मैंगनीज-chelates भी समचुंबक कर रहे हैं और आम तौर पर एमआरआई 7,14 में सकारात्मक संकेत तीव्रता प्रदान करने के लिए किया जाता है। गैडोलीनियम युक्त पंजाब एनपीएस के साथ के रूप में, मैंगनीज युक्त पंजाब एनपीएस भी (सकारात्मक) टी -1 और टी 2 (नकारात्मक) इसके विपरीत एजेंट के रूप में कार्य करते हैं।

प्रतिदीप्ति इमेजिंग क्षमताओं को शामिल करने के लिए, nanoparticle "कोर" fluorescently लेबल ग्लाइकोप्रोटीन avidin से मिलकर एक "biofunctional" शेल (चित्रा 1 के साथ लेपित हैं)। Avidin न केवल प्रतिदीप्ति इमेजिंग में सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी विशिष्ट कोशिकाओं और ऊतकों कि लक्ष्य biotinylated ligands के लिए एक डॉकिंग मंच के रूप में कार्य करता है। avidin बायोटिन बंधन avidin और बायोटिन 15 के बीच बेहद मजबूत बंधन आत्मीयता के द्वारा होती मजबूत ज्ञात, गैर सहसंयोजक बांड में से एक है। avidin लेपित पंजाब एनपीएस के लिए biotinylated ligands के लगाव पंजाब एनपीएस के लिए आणविक लक्ष्य-निर्धारण क्षमताओं प्रदान करता है।

इन रूपरेखा इमेजिंग पूरक सुविधाओं के अधिकारी, क्योंकि पंजाब एनपीएस का उपयोग कर प्रतिदीप्ति और एमआर इमेजिंग आगे बढ़ाने के लिए प्रेरणा है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल ऑप्टिकल आणविक इमेजिंग तकनीकों में से एक है, और उच्च संवेदनशीलता 1,16,17 में कई वस्तुओं का एक साथ दृश्य के लिए अनुमति देता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एक सुरक्षित, गैर इनवेसिव साधन है, लेकिन प्रवेश की कम गहराई और स्थानिक प्रस्तावों 1,3,16 के साथ जुड़ा हुआ है। दूसरी ओर, एमआरआई उच्च लौकिक एक उत्पन्न करता हैडी स्थानिक संकल्प गैर invasively और विकिरण 1,3,16 ionizing के लिए एक आवश्यकता के बिना। हालांकि एमआरआई कम संवेदनशीलता से ग्रस्त है। इसलिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग और एमआरआई की वजह से गहराई पैठ, संवेदनशीलता, और स्थानिक संकल्प के अपने पूरक सुविधाओं के लिए आणविक इमेजिंग तकनीक के रूप में चयन किया गया था।

यह लेख पंजाब एनपीएस के संश्लेषण और biofunctionalization के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, गैडोलीनियम युक्त पंजाब एनपीएस (GdPB), और मैंगनीज युक्त पंजाब एनपीएस (MnPB) 10,11। निम्न विधियों में वर्णित हैं: 1) आकार, प्रभारी की माप, और नैनोकणों के अस्थायी स्थिरता, एमआरआई relaxivities की 3) माप नैनोकणों के cytotoxicity के 2) मूल्यांकन, और प्रतिदीप्ति और आणविक एमआर इमेजिंग के लिए नैनोकणों 4) उपयोग इन विट्रो में लक्षित कोशिकाओं की आबादी की। इन परिणामों के vivo में बहुविध, आणविक इमेजिंग एजेंट के रूप में उपयोग के लिए एनपीएस की क्षमता प्रदर्शित करता है।

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Protocol

पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB 1. संश्लेषण

नैनोकणों (पंजाब एनपीएस, GdPB, या MnPB) के संश्लेषण के नीचे विस्तृत कदम प्रदर्शन से एक एक बर्तन संश्लेषण योजना का उपयोग कर हासिल की है:

  1. समाधान तैयार 'ए' विआयनीकृत (डीआई) पानी में 5 मिमी पोटेशियम hexacyanoferrate (द्वितीय) के 5 मिलीलीटर युक्त। इस प्रकार है: पंजाब एनपीएस, GdPB, या MnPB, समाधान 'बी' को तैयार - nanoparticle के प्रकार पर निर्भर करता है संश्लेषित किया जा रहा है
    1. के लिए पंजाब एनपीएस: डि पानी में 2.5 मिमी लोहा (तृतीय) क्लोराइड युक्त समाधान के 10 एमएल तैयार करते हैं।
    2. GdPB एनपीएस के लिए: 2.5 मिमी डि पानी में गैडोलीनियम के प्रत्येक (तृतीय) नाइट्रेट और लोहे (तृतीय) क्लोराइड युक्त समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी
    3. MnPB एनपीएस के लिए: 2.5 मिमी डि पानी में मैंगनीज की प्रत्येक (द्वितीय) क्लोराइड और लोहे (तृतीय) क्लोराइड युक्त समाधान के 10 एमएल तैयार करते हैं।
  2. एक दौर नीचे कुप्पी का हल 'बी' में जोड़ें, और कमरे के तापमान पर कुप्पी सामग्री (आरटी) हलचल और1000 आरपीएम। समाधान 'ए' ड्रॉप-वार दौर नीचे कुप्पी समाधान युक्त 'बी' में जोड़ें। लगभग 10 मिलीलीटर / घंटा बांटना करने के लिए सेट एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से 'बी' का हल 'ए' के ​​अलावा के लिए प्रवाह दर को नियंत्रित।
  3. 'बी' का हल 'ए' के ​​अलावा के बाद एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए आरटी पर 1000 rpm पर सरगर्मी जारी पूरा हो गया है। सरगर्मी रोक और मिश्रण इकट्ठा।
  4. Unreacted तत्वों से मुक्त नैनोकणों कुल्ला करने के लिए microcentrifuge ट्यूब में मिश्रण की aliquots स्थानांतरण। Centrifugation द्वारा कण संग्रह में सहायता करने के लिए प्रत्येक विभाज्य करने के लिए 5 एम NaCl (0.2 मिलीग्राम सोडियम क्लोराइड / एमएल प्रतिक्रिया मिश्रण) जोड़ें।
  5. अपकेंद्रित्र 20,000 × छ पर कम से कम 10 मिनट के लिए नैनोकणों के प्रत्येक विभाज्य। Centrifugation के बाद, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. एक microtip (sonication के नाड़ी का उपयोग sonication के माध्यम से 1 मिलीलीटर डि पानी में प्रत्येक nanoparticle गोली Resuspend / बंद = 1/1 सेकंड पर, आयाम = 50%, अवधि =5 सेकंड, sonicator शक्ति दर्ज़ा = 125 डब्ल्यू) गोली को तोड़ने के लिए।
  7. दोहराएँ नैनोकणों प्रारंभिक प्रतिक्रिया और प्रतिक्रिया byproducts के घटकों के लिए स्वतंत्र हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए 1.4-1.6 कम से कम 3 × कदम। अंतिम centrifugation के बाद, 1 मिलीलीटर डि पानी में कणों resuspend।

पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB 2. Biofunctionalization

नीचे वर्णित के रूप में नैनोकणों के Biofunctionalization avidin और biotinylated ligands के जोड़ने के साथ nanoparticle "कोर" की कोटिंग शामिल है:

  1. फ्लोरोसेंट avidin साथ नैनोकणों की कोटिंग
    सकारात्मक avidin (पीआई ~ 10.5) 18 प्रकार के रूप में नकारात्मक नैनोकणों आरोप लगाया करने पर लेपित है आरोप लगाया जहां फ्लोरोसेंट avidin साथ नैनोकणों की कोटिंग इलेक्ट्रोस्टैटिक आत्म विधानसभा का प्रयोग कर प्राप्त किया जाता है:
    1. 1 मिलीलीटर डि पानी में पंजाब एनपीएस, GdPB, या MnPB के निलंबन की तैयारी। एलेक्सा Fluor 488 लेबल avidin फिल्टर (A488, डि पानी में पुनर्गठन)10 मिनट के लिए 14,000 × छ पर एक 0.2 माइक्रोन नायलॉन microcentrifuge फिल्टर के माध्यम से। ≤0.2 मिलीग्राम avidin / मिलीग्राम नैनोकणों जोड़ें। पंजाब एनपीएस, GdPB, या MnPB की aliquots करने के लिए अलग से A488 के प्रत्येक फ़िल्टर्ड विभाज्य जोड़ें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों या रोटेशन के साथ 2-4 घंटे के लिए A488 के साथ नैनोकणों से संपर्क करें। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से नमूनों को सुरक्षित रखें।
      नोट: पंजाब एनपीएस (पीबी-A488), GdPB (GdPB-A488), और MnPB (MnPB-A488) लेपित यह कदम पैदावार A488।
  2. Biotinylated एंटीबॉडी के अनुलग्नक
    इस प्रकार के रूप avidin लेपित नैनोकणों पर biotinylated को लक्षित एंटीबॉडी के अनुलग्नक avidin बायोटिन बातचीत का उपयोग कर हासिल की है:
    1. पंजाब-A488, GdPB-A488, और 1 मिलीलीटर डि पानी में MnPB-A488 - avidin लेपित नैनोकणों के निलंबन की तैयारी। 10 मिनट के लिए 14,000 × छ पर एक 0.2 माइक्रोन नायलॉन microcentrifuge फिल्टर के माध्यम से biotinylated एंटीबॉडी (निर्माता द्वारा आपूर्ति के रूप में) फिल्टर।
      नोट: यहाँ, वर्तमान अध्ययन Biot का उपयोग करता हैinylated विरोधी न्यूरॉन glial प्रतिजन 2 (ANG2) NG2 कोशिकाओं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों और भीतर overexpressed कि लक्ष्य biotinylated विरोधी मानव eotaxin-तीन इयोस्नोफिल्स या इओसिनोफिलिक सेल लाइनों पर overexpressed रिसेप्टर्स कि लक्ष्य (Eot3)।
    2. Avidin लेपित नैनोकणों की aliquots करने के लिए अलग से biotinylated एंटीबॉडी के प्रत्येक फ़िल्टर्ड विभाज्य जोड़ें। ≤0.05 मिलीग्राम biotinylated एंटीबॉडी / मिलीग्राम avidin लेपित नैनोकणों जोड़ें। कोमल 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए या रोटेशन के साथ 2-4 घंटे के लिए biotinylated एंटीबॉडी (ANG2 या Eot3) के साथ avidin लेपित नैनोकणों से संपर्क करें। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से नमूनों को सुरक्षित रखें।
      नोट: यह कदम पैदावार एंटीबॉडी लेपित नैनोकणों (जैसे GdPB-A488-Eot3 और MnPB-A488-ANG2)।

नैनोकणों 3. नौकरशाही का आकार घटाने, जीटा संभावित, और लौकिक स्थिरता

नैनोकणों के आकार के वितरण, प्रभारी, और स्थिरता गतिशील का उपयोग कर रहे हैं मापाप्रकाश बिखरने (DLS) तरीके से नीचे वर्णित के रूप में:

  1. नैनोकणों की नौकरशाही का आकार घटाने
    नैनोकणों के आकार के रूप में इस प्रकार गतिशील प्रकाश बिखरने का प्रयोग कर प्राप्त किया जाता है:
    1. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक क्युवेट में डि पानी के 990 μl के लिए nanoparticle के नमूने (1 मिलीग्राम / एमएल) के 10 μl जोड़ें।
      नोट: यह एक अच्छा डीएलएस संकेत के लिए प्रतिनिधि मान है।
    2. मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए क्युवेट और भंवर टोपी। नैनोकणों के आकार को मापने के क्रम में कण आकार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक प्रणाली में क्युवेट रखें। 173 डिग्री की एक माप के कोण पर कण आकार के विश्लेषण के लिए बाहर ले।
  2. नैनोकणों की जीटा संभावित
    इस प्रकार के रूप नैनोकणों के जीटा संभावित चरण विश्लेषण प्रकाश बिखरने का उपयोग कर मापा जाता है:
    1. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक केशिका सेल में डि पानी के 900 μl के लिए nanoparticle के नमूने (1 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μl जोड़ें। यह मान एक अच्छा जीटा संभावित माप के लिए प्रतिनिधि है।
    2. Capillar रखें25 डिग्री सेल्सियस पर डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग नैनोकणों के जीटा संभावित उपाय करने के क्रम में जीटा संभावित विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक प्रणाली में y सेल।
  3. नैनोकणों के अस्थायी स्थिरता
    नैनोकणों के टेम्पोरल स्थिरता के रूप में निम्नानुसार गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग कर मापा जाता है:
    1. डि पानी के साथ ही धारा 3.1 में वर्णित के रूप में Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में नैनोकणों के आकार को मापने के द्वारा नैनोकणों की स्थिरता का आकलन करें।
    2. 5 दिन की अवधि में डि पानी और DMEM एक बार / दिन में आकार माप दोहराएँ।

नैनोकणों 4. cytotoxicity

इस प्रकार के रूप नैनोकणों के cytotoxicity एक XTT सेल प्रसार परख का उपयोग मापा जाता है:

  1. बीज 10,000-15,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका प्रकार एक 96 अच्छी तरह से थाली में (Neuro2a, BSG D10, EOL-1, और OE21) का अध्ययन किया। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की कुल मात्रा ई नहीं है यह सुनिश्चितXceed 0.2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से। रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. कोशिकाओं के साथ नैनोकणों से संपर्क:
    1. (- 0.5 मिलीग्राम / एमएल 0.01) नैनोकणों के अलग सांद्रता के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। (50 μl में) नैनोकणों की मात्रा का वर्णन करता है कि एक प्रतिनिधि तालिका के रूप में 1 टेबल का संदर्भ लें / अच्छी तरह से मध्यम के 50 μl हटाने के बाद कोशिकाओं को जोड़ा।
      1. परख के भीतर नैनोकणों के किसी भी हस्तक्षेप absorbance के लिए खाते में करने के लिए, नैनोकणों के उचित एकाग्रता से मिलकर एक खाली जोड़ने (0-0.5 मिलीग्राम / एमएल, कोशिकाओं को जोड़ा मात्रा में करने के लिए तुल्यता में) कोशिकाओं के बिना मध्यम करने के लिए।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात नैनोकणों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2। महाप्राण मीडिया से अच्छी तरह से प्रत्येक और फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के शामिल धुंधला बफर के साथ कुल्ला। फिनोल लाल के बिना मीडिया के 100 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 सेते16-18 घंटे के लिए।
  3. निर्माता विनिर्देशों के अनुसार किट घटकों (XTT अभिकर्मक और XTT उत्प्रेरक) के मिश्रण से XTT सेल प्रसार परख काम कर समाधान तैयार है। कुओं से मीडिया Aspirate और या अध्ययन सेल प्रकार के लिए उपयुक्त मध्यम (/ फिनोल O + लाल 10% FBS के +1 × पेन Strep के डब्ल्यू RPMI) RPMI के 100 μl जोड़ें। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए XTT काम कर समाधान के 50 μl जोड़ें और 2-2.5 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5%।
  4. उंगलियों के निशान या smudges के लिए सही करने के लिए 630 एनएम के एक संदर्भ के तरंग दैर्ध्य के साथ, 490 एनएम पर absorbance के उपाय। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सही absorbance के (ए 490 ए 630) की गणना और प्रतिकृति के लिए रीडिंग औसत।
  5. अंतिम सुधारा absorbance के मूल्यों की गणना करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से मूल्य से खाली रीडिंग घटाना। नैनोकणों बिना इलाज कोशिकाओं की है कि अंतिम सुधारा absorbance के सामान्य से प्रत्येक नमूने के लिए अस्तित्व प्रतिशत की गणना। प्लॉट सुnanoparticle एकाग्रता के एक समारोह के रूप में rvival प्रतिशत।

5. एमआरआई पंजाब एनपीएस की Relaxivities, GdPB, और MnPB

एमआरआई relaxivity 1 टी का उपयोग करके मापा जाता है - और 2 टी नीचे वर्णित के रूप में नैनोकणों युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर एक एमआरआई "प्रेत" की तैयारी से भारित दृश्यों:

  1. प्रेत तैयारी
    1. उपयुक्त एकाग्रता में प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 100 μl नैनोकणों (पंजाब एनपीएस, GdPB, या MnPB) के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली तैयार है। Nanoparticle की प्रत्येक प्रकार के लिए 0.4 मिमी की एक एकाग्रता के साथ शुरू, क्रमानुसार एम पहुँच जाता है 2.4 × 10 -5 के एक एकाग्रता जब तक डि पानी का उपयोग नैनोकणों 2 × पतला है (यह 14 dilutions और 15 कुओं की आवश्यकता है)।
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक में डि पानी में पिघला हुआ 1% agarose समाधान के 100 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। जेल में 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमना करने की अनुमति दें।
      नोट: इस के धारावाहिक dilutions युक्त एक प्रेत पैदावारजम agarose में नैनोकणों।
    3. 2% अगर (150 सेमी 3) का एक ठोस ब्लॉक के तहत एक क्षैतिज 3 टी नैदानिक ​​चुंबक में प्रेत रखें। एक 8 चैनल HD मस्तिष्क कुंडली के केंद्र के भीतर अगर की प्रेत और ब्लॉक सुरक्षित। 96 अच्छी तरह से थाली 11 के मध्य ऊंचाई पर 0.5 मिमी मोटी राज्याभिषेक स्लाइस का उपयोग कर छूट टाइम्स उपाय।
  2. टी 1 - और 2 टी भारित दृश्यों
    नैदानिक ​​चुंबक में दृश्यों को प्राप्त करने के लिए निम्न प्रतिनिधि सेटिंग्स का उपयोग करें।
    नोट: ये मान वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल नैनोकणों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं:
    1. टी मोल निम्नलिखित द्रव तनु उलटा वसूली (स्वभाव) अनुक्रम का उपयोग कर एक भारित (T1W) एमआर छवियों: ट्रेन इको (ईटी) = 8, पुनरावृत्ति समय (टी.आर.) = 2300 मिसे, गूंज समय (ते) = 24.4 मिसे, मैट्रिक्स आकार = 512 X 224, देखने के फील्ड (FOV) 16 एक्स 16 सेमी = 2।
    2. निम्नलिखित तेजी relaxa का उपयोग करते हुए टी 2 भारित (T2W) एमआर छवियों का मोलtion के तेजी से स्पिन गूंज (FRFSE) अनुक्रम: एट = 21; टी.आर. = 3500 मिसे; ते = 104 मिसे; मैट्रिक्स आकार = 512 X 224; FOV = 16 X 16 सेमी 2।
    3. निम्नलिखित उलटा समय पर 127 मेगाहर्ट्ज (3 टी) पर T1W और T2W एमआर छवियों का मोल: 50, 177, 432, 942, 1961, और 4000 मिसे।
  3. एमआरआई Relaxivities मापने
    1. खंड 5.2 में वर्णित दृश्यों का उपयोग T1W और T2W छवियों को प्राप्त करने के बाद, फिर, आगे से मुख्य उपकरण पट्टी पर स्थित अंडाकार फसल बटन का उपयोग कर प्रत्येक रॉय का चयन करके ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के रूप में नामित प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग ImageJ के लिए संकेत तीव्रता को मापने > उपाय विश्लेषण का चयन।
      ध्यान दें: एक पॉप-अप "मतलब" लेबल कॉलम के तहत प्रत्येक रॉय का मतलब संकेत तीव्रता प्रदर्शित करना चाहिए।
    2. प्रत्येक रॉय के लिए, अपने विशिष्ट उलटा समय के खिलाफ मापा संकेत तीव्रता साजिश है। जरूरत है, पलटना अंक साजिश की शुरुआत में एक प्रारंभिक "बुलबुले" या outliers कि उत्पन्न (रीडिंग) (कम उलट हैंटाइम्स)।
      नोट: एमआरआई बल्कि 19 के लिए सही हिसाब करने की जरूरत है, जो उनके वास्तविक (नकारात्मक) मूल्य, / से छवियों का परिमाण या निरपेक्ष मूल्य के उपाय, क्योंकि ये रीडिंग कम उलटा समय पर उत्पन्न कर रहे हैं।
    3. खंड 5.2 में वर्णित के रूप में उलटा टाइम्स बनाम ROIs (एसआई) (टी आई) के लिए संकेत तीव्रता के प्रत्येक भूखंड के लिए एक घातीय फिट तैयार करें। एक्स-अक्ष पर प्लॉट टी मैं, वाई अक्ष पर एसआई; ɑ और Δ प्रतिगमन द्वारा निर्धारित स्थिरांक हैं, और टी 1 या 2 टी हल करने के लिए चर रहा है:
      1 समीकरण
      जहां टी टी 1, टी = 2।
    4. उपरोक्त समीकरण का उपयोग कर टी 1 या 2 टी के लिए सुलझाने और प्रत्येक रॉय में इस्तेमाल नैनोकणों की सांद्रता के खिलाफ मूल्यों की गणना (1 / टी 1 और 1/2 टी) का उलटा साजिश है।
    5. रेखीय ग्राफ के ढलान की गणना जोrelaxivities 1 आर और 2 r पैदावार।
      नोट: प्रोटोकॉल के निम्नलिखित खंड फ्लोरोसेंट लेबलिंग और लक्षित कोशिकाओं में पैदा करने एमआरआई इसके विपरीत के लिए नैनोकणों के आवेदन का वर्णन है।

Confocal माइक्रोस्कोपी - नैनोकणों का उपयोग कर लक्षित कोशिकाओं के 6. फ्लोरोसेंट लेबलिंग

नोट: नैनोकणों (पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB) fluorescently रूप में इस प्रकार (confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी) लक्षित कोशिकाओं की आबादी के लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:

  1. फ्लोरोसेंट नैनोकणों के संश्लेषण
    1. वर्गों 1 और 2 में विस्तृत चरणों का पालन करके लक्षित कोशिकाओं की आबादी के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 synthesize।
  2. कोशिकाओं की तैयारी प्रतिदीप्ति लक्ष्य निर्धारण के लिए
    1. कोट नहीं। 90 मिनट के लिए 0.002% पाली (एल lysine) hydrobromide की एक समाधान में उन्हें सूई से 1.5 माइक्रो कवर चश्मा। समाधान से कवर चश्मे निकालें और उन्हें 24 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
    2. बीज कोशिकाओं (जैसे EOL -1, BSG D10, SUDIPG1) 6 अच्छी तरह से थाली में रखा गया है और कम से कम 16 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% लेपित कवर चश्मे पर। एक 1 × पीबीएस समाधान और के साथ कोशिकाओं कुल्ला (वैकल्पिक) 15 मिनट के लिए तटस्थ बफर समाधान में 10% formaldehyde के साथ तय कर लो। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 5 माइक्रोन लाल-नारंगी सेल permeant डाई के साथ दाग कोशिकाओं। इसके बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
  3. > लक्षित कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    1. 1% गोजातीय सीरम albumin जोड़ें (बीएसए; डि पानी में) कोशिकाओं कोशिकाओं पर बाध्यकारी गैर विशिष्ट कम करने, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 1 घंटे के लिए 1% BSA में नैनोकणों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। EOL-1 के लिए: 0.2 मिलीग्राम / एमएल GdPB-A488 या GdPB-A488-Eot3 साथ सेते हैं; BSG D10 और SUDIPG1 के लिए: 0.2 मिलीग्राम / एमएल MnPB-A488 या MnPB-A488-ANG2 साथ सेते हैं। Unbou दूर करने के लिए पीबीएस के साथ 3 × कोशिकाओं कुल्लाएन डी नैनोकणों।
    3. ध्यान से कोई फँस हवा बुलबुले हैं सुनिश्चित करना है कि एक खुर्दबीन स्लाइड पर (कोशिकाओं और नैनोकणों युक्त) कवर गिलास पलटना। ध्यान से स्पष्ट नेल पॉलिश लगाने से कवर कांच और माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच किनारे सील। छवि एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कोशिकाओं।

फ्लो - नैनोकणों का उपयोग कर लक्षित कोशिकाओं का 7. फ्लोरोसेंट लेबलिंग

इस प्रकार के रूप नैनोकणों (पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB) fluorescently लेबल करने के लिए (फ्लो द्वारा निगरानी) लक्षित कोशिकाओं की आबादी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:

  1. कोशिकाओं को तैयार निलंबन पीबीएस में निशाना बनाया जा रहा। शुद्ध संस्कृति के अध्ययन के लिए, निलंबन एक एकल कोशिका प्रकार (जैसे BSG D10) से मिलकर; 100,000 कोशिकाओं / एमएल (10 मिलीलीटर कुल) में पीबीएस में BSG D10 कोशिकाओं के एक सेल गोली resuspend। मिश्रित संस्कृति के अध्ययन के लिए, निलंबन कम से कम दो प्रकार की कोशिकाओं (जैसे EOL-1 और ँ से मिलकर बनता है21); (10 मिलीलीटर कुल) 100,000 कोशिकाओं / एमएल प्रत्येक में BSG D10, पीबीएस में EOL-1 और OE21 की resuspend सेल छर्रों के समान है।
    1. EOL-1 के अलग अनुपात तैयार: OE21 1: 0 (2 मिलीलीटर EOL-1), 3: 1 (1.5 मिलीलीटर EOL-1, 0.5 मिलीग्राम OE21), 1: 1 (1 मिलीलीटर EOL-1 और OE21 के प्रत्येक), 1: 3 (EOL-एक 0.5 मिलीलीटर, 1.5 मिलीग्राम OE21), 0: 1 (2 मिलीलीटर OE21)।
  2. कोशिकाओं (शुद्ध और मिश्रित निलंबन) ब्लॉक गैर विशिष्ट बंधनकारी कम करने के लिए 5% BSA के 2 मिलीलीटर के साथ नैनोकणों द्वारा निशाना बनाया जा रहा है।
  3. कोशिकाओं के लिए 1 मिलीलीटर (1 मिलीग्राम / एमएल) नैनोकणों जोड़ें और 1 घंटे के लिए सेते हैं। BSG D10 के लिए, MnPB-A488, MnPB-A488-एबीसी (नियंत्रण एंटीबॉडी), या MnPB-A488-ANG2) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। EOL-1 और OE21 के मिश्रण के लिए, GdPB-A488-Eot3 की एक निश्चित राशि के साथ मिश्रण सेते हैं।
  4. अपार कणों को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए 1000 × छ पर कम से कम 3 × नमूने नीचे कताई द्वारा अनबाउंड नैनोकणों के स्वतंत्र कोशिकाओं कुल्ला। 1 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और पीबीएस में 10% formaldehyde के साथ तय कर लो। 10 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ incubating द्वारा कोशिकाओं दाग30 मिनट के लिए बर्फ पर पीबीएस में सात-Aminoactinomytcin डी। , पीबीएस के साथ कुल्ला तो एक प्रवाह cytometer का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने से 10,000 gated कोशिकाओं का विश्लेषण।

नैनोकणों का उपयोग कर लक्षित कोशिकाओं पर 8. उत्पन्न एमआरआई इसके विपरीत

इस प्रकार है: लक्षित कोशिकाओं की आबादी में - नैनोकणों (पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB) (और टी 2 भारित दृश्यों दोनों टी 1 में) एमआरआई इसके विपरीत उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

  1. प्रेत तैयारी
    1. 80% संगम ~ जब तक T75 बोतल में कोशिकाओं (जैसे BSG D10) में वृद्धि। उपयुक्त मध्यम विकास और शर्तों का उपयोग करें। BSG D10 के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर DMEM के 10% FBS + 1 × पेन Strep में कोशिकाओं को विकसित और 5% सीओ 2।
    2. 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ मध्यम से मुक्त कोशिकाओं कुल्ला और गैर विशिष्ट बंधनकारी कम करने के लिए एक घंटे के लिए पीबीएस में 5 मिलीलीटर 1% BSA के साथ कोशिकाओं ब्लॉक। कोशिकाओं के लिए 5 मिलीलीटर (0.5 मिलीग्राम / एमएल) नैनोकणों जोड़ें। BSG D10 के लिए, MnPB-A488, MnPB-A488-एबीसी (नियंत्रण एंटीबॉडी), और एमएनपी के साथ कोशिकाओं को सेतेबी-A488-ANG2 1 घंटे के लिए।
    3. अनबाउंड नैनोकणों दूर करने के लिए कोशिकाओं 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 3 × कुल्ला। प्रेत तैयारी के लिए कुप्पी से उन्हें अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 2 मिलीलीटर ट्रिप्सिन EDTA 0.25% समाधान के साथ 5 मिनट के लिए 1 × कोशिकाओं incubating द्वारा कोशिकाओं Trypsinize। कोशिकाओं के trypsinization बुझाने के लिए DMEM के 8 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. 5 मिनट के लिए 1000 × छ पर उन्हें centrifuging से कोशिकाओं को इकट्ठा; सतह पर तैरनेवाला बाहर aspirate। 1 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए पीबीएस में 1 मिलीलीटर 10% formaldehyde के जोड़ें। एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक अलग अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक नमूना के 100 μl जोड़ें।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक में डि पानी में पिघला हुआ 1% agarose समाधान के 100 μl जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स। जेल में 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमना करने की अनुमति दें।
      नोट: यह जम agarose में संलग्न नैनोकणों के साथ कोशिकाओं से युक्त एक प्रेत पैदावार।
    6. (अगले 2% अगर का एक ठोस ब्लॉक करने के लिए एक क्षैतिज 3 टी नैदानिक ​​चुंबक में 150 सेमी प्रेत रखें 11 के मध्य ऊंचाई पर 0.5 मिमी मोटी राज्याभिषेक स्लाइस का उपयोग कर छूट टाइम्स उपाय।
  2. टी 1 - और 2 टी भारित दृश्यों
    नैदानिक ​​एमआरआई चुंबक में दृश्यों को प्राप्त करने के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें:
    1. निम्नलिखित स्पिन गूंज अनुक्रम का उपयोग T1W एमआर छवियों का मोल: ट्रेन इको (ईटी) = 1, पुनरावृत्ति समय (टी.आर.) = 650 मिसे, गूंज समय (ते) = 11 मिसे, मैट्रिक्स आकार = 320 X 256, देखने के फील्ड (FOV) = 10 x 10 सेमी 2।
    2. निम्नलिखित FRFSE अनुक्रम का उपयोग T2W एमआर छवियों का मोल: एट = 28; टी.आर. = 3000 मिसे; ते = 101 मिसे; मैट्रिक्स आकार = 384 X 288; FOV = 10 x 10 सेमी 2।
  3. पोस्ट-अधिग्रहण प्रसंस्करण
    1. पैमाने ग्रे छवि बदलने के लिए, चयन छवि> प्रकार> 8-बिट: आसानी से पढ़ने के लिए, ImageJ का उपयोग एक रंग पैमाने छवि में मूल ग्रे स्केल छवियों कन्वर्ट।
    2. Agarose समाधान से संकेत योगदान को घटाने के बाद प्रत्येक नमूने के लिए सामान्यीकृत तीव्रता की गणना।

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Representative Results

एक बर्तन संश्लेषण योजना का उपयोग कर, पंजाब एनपीएस के नैनोकणों (व्यास 78.8 एनएम, polydispersity सूचकांक (PDI) = 0.230 मतलब है, गतिशील प्रकाश बिखरने साधन द्वारा गणना), GdPB, या MnPB (व्यास 164.2 एनएम, PDI = 0.102 मतलब है) ( व्यास डीएलएस द्वारा मापा (monodisperse हैं कि 122.4 एनएम, PDI = 0.124)) लगातार संश्लेषित किया जा सकता है (2A चित्रा) से मतलब है। संश्लेषित नैनोकणों मापा जीटा क्षमता उनकी सतह के आरोपों के आधार पर कणों के उदारवादी स्थिरता का संकेत कम से कम -30 एम वी (चित्रा 2B), कर रहे हैं। उनके अनुरूप आकार (; चित्रा -2 hydrodynamic व्यास) द्वारा संकेत के रूप में संश्लेषित नैनोकणों 5 दिन की अवधि में पर्याप्त लौकिक स्थिरता दिखा रहे हैं।

कोशिकाओं के साथ सह-incubated करते हैं, नैनोकणों (पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB) निश्चित सीमा से सांद्रता नीचे कोशिकाओं (चित्रा 3) के लिए नगण्य cytotoxicity दिखा रहे हैं। Cytotoxicity छात्र0.67 × 10 -6 मिलीग्राम / सेल (चित्रा 3 ए) की तुलना में कम सांद्रता में Neuro2a साथ-incubated सह जब Neuro2a कोशिकाओं पर पंजाब एनपीएस से मर जाता है नगण्य cytotoxicity संकेत मिलता है। EOL-1 और OE21 कोशिकाओं के साथ GdPB के सह-ऊष्मायन द्वारा आयोजित cytotoxicity पढ़ाई 0.25 × 10 -6 मिलीग्राम / सेल (3B चित्रा) की तुलना में कम सांद्रता में दोनों प्रकार की कोशिकाओं पर GdPB की नगण्य cytotoxicity संकेत मिलता है। 0.25 × 10 -6 मिलीग्राम / सेल (चित्रा -3 सी) की तुलना में कम सांद्रता में BSG D10 के साथ सह-incubated जब इसी प्रकार, cytotoxicity पढ़ाई MnPB की नगण्य cytotoxicity संकेत मिलता है। MnPB और GdPB के अतिरिक्त cytotoxicity nanoparticle कोर के भीतर (GdPB के लिए MnPB और जी.डी. 3+ के लिए करोड़ 2 +) अतिरिक्त आयनों की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

एमआरआई relaxivity पढ़ाई पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB के अलग सांद्रता के शामिल phantoms का उपयोग किया गया था। पढ़ाई nanopar की उपयोगिता का संकेतT1W और T2W दृश्यों (चित्रा 4) दोनों में एमआरआई इसके विपरीत एजेंट के रूप में ticles। यह टी में वृद्धि हुई hyperintensities (सकारात्मक विपरीत) द्वारा एक भारित दृश्यों और 2 टी GdPB (चित्रा -4 ए) और MnPB (4B चित्रा) दोनों की बढ़ती सांद्रता के साथ भारित दृश्यों में वृद्धि हुई hypointensities (नकारात्मक विपरीत) का प्रदर्शन किया जाता है। GdPB एक मजबूत टी एक एजेंट और एक उदारवादी 2 टी एजेंट (चित्रा 4C) है, जबकि relaxivity माप के आधार पर, MnPB एक उदारवादी टी एक एजेंट और एक मजबूत टी दो एजेंट है। GdPB और MnPB की मापा relaxivities चिकित्सकीय अनुमोदित विपरीत एजेंटों 10, 11 के लोगों के साथ कृपापूर्वक तुलना करें।

biofunctionalized पंजाब एनपीएस fluorescently इन विट्रो में (चित्रा 5) लक्षित कोशिकाओं की आबादी के लेबल करने के लिए सक्षम हैं। दोनों फ्लोरोसेंट avidin (A488) और biotinylated विरोधी मानव ई के साथ biofunctionalized जबotaxin-तीन एंटीबॉडी (Eot3), GdPB fluorescently EOL-1 कोशिकाओं (चित्रा 5 ब) की आबादी को लक्षित कर सकते हैं। GdPB दोनों फ्लोरोसेंट avidin (A488) और biotinylated विरोधी न्यूरोनल glial प्रतिजन-2 (ANG2) के साथ biofunctionalized है जब Eot3 प्रदर्शनी नगण्य बाध्यकारी (चित्रा 5A) के बिना नियंत्रण GdPB नैनोकणों इसी प्रकार, नैनोकणों fluorescently BSG D10 और SUDIPG1 neurospheres की आबादी को लक्षित कर सकते (आंकड़े 5D और एफ) को लक्षित एंटीबॉडी के बिना नियंत्रण नैनोकणों fluorescently कोशिकाओं (आंकड़े 5C और ई) लेबल करने में असमर्थ रहे हैं। इस प्रकार, कुशल लक्ष्यीकरण और फ्लोरोसेंट लेबलिंग फ्लोरोसेंट avidin और biotinylated को लक्षित ligand के दोनों की उपस्थिति की आवश्यकता है।

प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा के रूप में biofunctionalized नैनोकणों की क्षमता fluorescently, कोशिकाओं की आबादी के लेबल करने के लिए, फ्लोरोसेंट avidin और बायोटिन दोनों के लिए की जरूरत की पुष्टिप्रभावी फ्लोरोसेंट लेबलिंग (चित्रा 6) के लिए ligand के ylated-लक्ष्य। BSG D10 कोशिकाओं MnPB A488 और ANG2 दोनों को रोकने के साथ संपर्क किया (MnPB-A488-ANG2) प्रदर्शनी में वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति (चित्रा 6A) और एक नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट नैनोकणों नियंत्रण की तुलना में जब fluorescently लेबल कोशिकाओं का प्रतिशत (चित्रा 6B) (MnPB-A488 -AbC) और एक एंटीबॉडी के बिना (MnPB-A488)। biofunctionalized नैनोकणों fluorescently एक सेल मिश्रण (चित्रा 6C) के भीतर कोशिकाओं की एक विशिष्ट उप-जनसंख्या को लक्षित करने में सक्षम हैं। इस EOL-1-लक्ष्य-निर्धारण की निर्धारित मात्रा के रूप में प्रदर्शन किया है, फ्लोरोसेंट GdPB (GdPB-A488-Eot3) लक्षित कोशिकाओं (EOL-1) और नियंत्रण कोशिकाओं (OE21) के साथ संपर्क कर रहे हैं। मिश्रण के भीतर; EOL-1 के अनुपात के रूप में प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है (चित्रा 6C वृद्धि हुई एलेक्सा Fluor 488 संकेत तीव्रता) बढ़ रहे हैं। इस सीई के भीतर कोशिकाओं के इस उप-जनसंख्या के लिए नैनोकणों की विशिष्टता को इंगित करता हैडालूँगा मिश्रण।

biofunctionalized पंजाब एनपीएस (चित्रा 7) लक्षित कोशिकाओं की आबादी में एमआरआई इसके विपरीत वृद्धि हुई है। BSG D10 कोशिकाओं प्रयोगात्मक (MnPB-A488-ANG2) और नियंत्रण (MnPB-A488-एबीसी और MnPB-A488) नैनोकणों के बराबर सांद्रता के साथ संपर्क कर रहे हैं, जब प्रदर्शनी में नियंत्रण की तुलना में MnPB-A488-ANG2 के साथ संपर्क किया कोशिकाओं के लिए hyperintensity वृद्धि हुई phantoms T2W दृश्यों (चित्रा 7A) में नियंत्रण की तुलना में MnPB-A488-ANG2 के साथ संपर्क किया कोशिकाओं के लिए T1W दृश्यों, और वृद्धि की hypointensity। प्रेत के भीतर ROIs की छवि विश्लेषण T1W दृश्यों में नियंत्रण की तुलना में और काफी T2W दृश्यों (चित्रा 7B) में नियंत्रण करने के लिए तीव्रता सापेक्ष कमी आई है जब प्रयोगात्मक कणों के साथ संपर्क किया कोशिकाओं में काफी तीव्रता में वृद्धि हुई एक्ज़िबिट जहां इस प्रवृत्ति की पुष्टि करें।

चित्र 1 चित्रा 1: पंजाब एनपीएस की कोर-खोल डिजाइन। सीएन - - कोर एक एक फ़े द्वितीय में रेखीय साइनाइड ligands के शामिल है जो पंजाब जाली, के होते हैं। फ़े तृतीय लिंकेज इन संबंधों को पंजाब एनपीएस के आरोप में 5 संतुलन का एक साधन के रूप में अपने तीन आयामी नेटवर्क के भीतर फैटायनों को शामिल करने के लिए सक्षम है। प्रशिया नीले रंग की यह कटियन बाध्यकारी क्षमता एमआरआई विपरीत प्रदान करता है जो जाली, भीतर gadolinium और मैंगनीज आयनों लोड करने के लिए उपयोग किया जाता है। कोर आणविक लक्ष्य-निर्धारण सक्षम करने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग और biotinylated ligands के सक्षम करने के लिए फ्लोरोसेंट avidin के शामिल एक biofunctional खोल के साथ लेपित है।

चित्र 2
चित्रा 2:। आकार, प्रभारी, और पंजाब एनपीएस की स्थिरता (ए) पंजाब (नीला) के आकार वितरण, GdPB (लाल) और MnPB (काला) डीएलएस द्वारा मापा नैनोकणों। (बी (सी) पंजाब (नीला) के टेम्पोरल स्थिरता, GdPB (लाल) और MnPB (काला) पानी में नैनोकणों, उनके संश्लेषण के बाद पांच दिनों के लिए (ठोस) और DMEM (बिंदीदार) डीएलएस द्वारा मापा।

चित्र तीन
चित्रा 3:। पीबी एनपीएस की cytotoxicity-21 ँ कोशिकाओं, क्रमशः और पंजाब एनपीएस GdPB EOL-एक और की एक निश्चित राशि के लिए जोड़ा Neuro2a कोशिकाओं (बी) की एक निश्चित संख्या में जोड़ा (ए) के विभिन्न सांद्रता का उपयोग कर cytotoxicity स्टडीज ( सी) MnPB BSG D10 कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या में जोड़ा। सेल जीवित रहने की दर 24 और 48 घंटा में गणना की गई। रेफरी 11 से अनुमति के साथ Reproduced, कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी; कबूतर प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ रेफरी 10; और रेफरी रसायन विज्ञान की रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ 21।


चित्रा 4: 2 टी नैनोकणों की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में (ए) GdPB और (बी) MnPB की भारित दृश्यों में 1 टी भारित दृश्यों और hypointensity में श्री छवियों और तीन टी Hyperintensity पर GdPB और MnPB की relaxivities। (सी) रेफरी 11, कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से अनुमति के साथ तीन टी Reproduced पर मापा पंजाब एनपीएस, GdPB, और MnPB की relaxitivies का सारणीकरण।

चित्रा 5
चित्रा 5: biofunctionalized पंजाब एनपीएस का उपयोग करते हुए लक्षित कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा के रूप में (ए) नियंत्रण (GdPB-A488) और (बी) प्रयोगात्मक (GdPB-A488-Eot3 के साथ इलाज EOL-1 कोशिकाओं की छवियाँ। ) नैनोकणों।(सी) नियंत्रण (MnPB-A488) और (डी) प्रयोगात्मक (MnPB-A488-ANG2) नैनोकणों के साथ इलाज BSG neurospheres की छवियाँ। (ई) नियंत्रण (MnPB-A488) और (च) प्रयोगात्मक (MnPB-A488-ANG2) नैनोकणों के साथ इलाज SUDIPG1 neurospheres की छवियाँ। रेफरी 11 से अनुमति के साथ Reproduced, कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: प्रवाह cytometry द्वारा मापा biofunctionalized पंजाब एनपीएस का उपयोग करते हुए लक्षित कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग (ए) (MnPB-A488-ANG2) प्रयोगात्मक और नियंत्रण (MnPB-A488-एबीसी और MnPB के साथ इलाज BSG D10 कोशिकाओं के histograms के प्रवाह cytometry। -A488) नैनोकणों। (बी) पीईप्रयोगात्मक (MnPB-A488-ANG2) के साथ उपचार और नियंत्रण पर (एलेक्सा Fluor सकारात्मक का%) फ्लोरोसेंट हैं कि पैनल (ए) से BSG D10 कोशिकाओं के rcentage (MnPB-A488-एबीसी और MnPB-A488) नैनोकणों, पी ** <0.05। (सी) नैनोकणों (GdPB-A488-Eot3) द्वारा लक्षित EOL -1 (लक्षित कोशिकाओं) और OE21 (नियंत्रण सेल) के अलग अनुपात से युक्त एक सेल मिश्रण का बिखराव भूखंडों प्रवाह cytometry। रेफरी 11, कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से और रेफरी 10 से कबूतर प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ अनुमति के साथ Reproduced इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7:। Biofunctionalized पंजाब एनपीएस का उपयोग करते हुए लक्षित कोशिकाओं में बढ़ाने एमआरआई इसके विपरीत (ए) 1 टी भारित और टी <प्रयोगात्मक (MnPB-A488-ANG2) और नियंत्रण (MnPB-A488-एबीसी और MnPB-A488) नैनोकणों के साथ इलाज BSG D10 कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या के शामिल phantoms में उप> 2 भारित विपरीत वृद्धि। (बी) BSG D10 प्रयोगात्मक (MnPB-A488-ANG2) के साथ इलाज कोशिकाओं और नियंत्रण (MnPB-A488-एबीसी और MnPB-A488) नैनोकणों के लिए सामान्यीकृत संकेत तीव्रता, ** पी <0.05। कबूतर प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ रेफरी 10 से reproduced

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Discussion

यह लेख biofunctionalized प्रशिया नीले नैनोकणों के आधार पर बहुविध, आणविक इमेजिंग एजेंटों की एक उपन्यास वर्ग के संश्लेषण के लिए तरीकों को प्रस्तुत किया गया है। नैनोकणों में शामिल आणविक इमेजिंग तौर तरीकों के कारण उनके पूरक सुविधाओं के लिए, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और आणविक एमआरआई हैं। biofunctionalized प्रशिया नीले नैनोकणों एक कोर-खोल डिजाइन किया है। इन नैनोकणों के संश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) एक-पॉट प्रशिया नीले नैनोकणों के शामिल कर रहे हैं कि कोर (पंजाब एनपीएस), गैडोलीनियम युक्त प्रशिया नीले नैनोकणों (GdPB), या मैंगनीज युक्त प्रशिया नीले जो पैदावार संश्लेषण नैनोकणों (MnPB) इलेक्ट्रोस्टैटिक आत्म विधानसभा द्वारा फ्लोरोसेंट avidin का उपयोग कर नैनोकणों, 2) biofunctionalization, और मजबूत avidin बायोटिन बातचीत का उपयोग नैनोकणों के लिए biotinylated ligands के (एंटीबॉडी) की 3) लगाव। फ्लोरोसेंट avidin और biotinylated ligands के दोनों biof का गठननैनोकणों के unctional खोल।

एक बर्तन संश्लेषण टी -1 और टी एमआरआई के लिए दो विपरीत एजेंट के रूप में दोनों समारोह में कहा कि पंजाब एनपीएस, GdPB, या MnPB पैदावार। nanoparticle कोर में लोड समचुंबक आयनों (गैडोलीनियम या मैंगनीज) की मात्रा में (वृद्धि या कमी) बदल समचुंबक आयन युक्त लवण की मात्रा अलग से किया जा सकता है (गैडोलीनियम (तृतीय) नाइट्रेट और मैंगनीज (द्वितीय) क्लोराइड) में एक बर्तन संश्लेषण (1.2 चरण)। इस बदल में यह परिणाम एमआरआई संकेत तीव्रता (वृद्धि या कमी)। हालांकि, संश्लेषण योजना के लिए इन संशोधनों अस्थिर, एकत्रित नैनोकणों में हो सकता है। एकत्रीकरण के साथ जुड़ी चिंताओं को कम करने के लिए, एक-पॉट संश्लेषण संश्लेषण 20 के दौरान इस तरह साइट्रेट के रूप में एजेंट कैपिंग आकार को नियंत्रित शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Nanoparticle कोर के Biofunctionalization फ्लोरोसेंट avidin, जो enab साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक आत्म विधानसभा द्वारा हासिल की हैलेस प्रतिदीप्ति इमेजिंग। इलेक्ट्रोस्टैटिक आत्म विधानसभा नैनोकणों के सतह और (इस लेख में, फ्लोरोसेंट avidin) कोटिंग बहुलक पर विपरीत आरोपों की आवश्यकता है। नैनोकणों के सतह कार्यक्षमता में परिवर्तन करने के लिए, avidin सकारात्मक आरोप लगाया पॉलिमर (जैसे polylysine या पॉलीथीन ग्लाइकोल युक्त एक amine-समूह) संश्लेषण के दौरान द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हालांकि नैनोकणों और कोटिंग बहुलक के रिश्तेदार अनुपात nanoparticle के आकार और स्थिरता बनाए रखने के लिए और एकत्रीकरण को रोकने के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ेगा।

Avidin लेपित नैनोकणों पर biotinylated एंटीबॉडी के अलावा पंजाब आधारित नैनोकणों के लिए आणविक लक्ष्य-निर्धारण क्षमताओं प्रदान करता है। यह कदम avidin और बायोटिन के बीच मजबूत बातचीत पर आधारित है (निरंतर संतुलन हदबंदी, कश्मीर ~ 10 -15 डी)। पिछले चरणों के साथ के रूप में, avidin लेपित नैनोकणों और biotinylated ligands के सापेक्ष अनुपात सेशन होने की जरूरतएक साथ nanoparticle के एकत्रीकरण में जिसके परिणामस्वरूप दो avidin लेपित नैनोकणों बंधन से biotinylated ligand को रोकने के लिए इतनी के रूप में timized। आणविक लक्ष्य-निर्धारण के लिए, एंटीबॉडी अन्य को लक्षित ऐसे एंटीबॉडी टुकड़े के रूप में ligands के (फैब), एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv), पेप्टाइड्स, या aptamers द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

बहुविध रूप biofunctionalized नैनोकणों synthesizing के लिए इस विधि का मुख्य लाभ, आणविक इमेजिंग एजेंट हैं: nanoparticle कोर के 1) सतही एक-पॉट (1-कदम) संश्लेषण, और 2) अनुक्रमिक संपर्क कदम (इलेक्ट्रोस्टैटिक स्वयं विधानसभा और avidin- एक biofunctional खोल के साथ nanoparticle कोर कोटिंग के लिए बायोटिन बातचीत)। नैनोकणों के अन्य लाभ (Radiogardase के रूप में बेचा) प्रशिया नीले पहले से ही मानव उपयोग के लिए एफडीए को मंजूरी दी है कि और एक बर्तन संश्लेषण योजना का परिणाम है कि नैनोकणों (एक एमआरआई विपरीत एजेंट के रूप में दोनों टी 1 में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तथ्य शामिल सकारात्मक) और टी 2 </ उप> आसानी से विपरीत एजेंटों के संश्लेषण के लिए जटिल संश्लेषण योजनाओं या विशेष रसायनों के बिना विपरीत एजेंटों या nanoparticle प्लेटफार्मों अन्य का प्रयोग कर प्राप्त नहीं है, जो (नकारात्मक) भारित दृश्यों। तकनीक की एक सीमा है nanoparticle कोर संश्लेषण और biofunctional खोल कोटिंग दोनों चरणों में reactants के सापेक्ष अनुपात कड़ाई से विशेष रूप से उन चरणों में इस्तेमाल किया अभिकारकों के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं अगर संश्लेषण समुच्चय के साथ polydisperse नैनोकणों का कारण बन सकता है। उदाहरण के लिए, avidin साथ नैनोकणों कोर कोटिंग के लिए सापेक्ष अनुपात से पहले अनुकूलन के अध्ययन के बिना polylysine साथ नैनोकणों कोटिंग करने के लिए नहीं बढ़ाया जा सकता है।

यहाँ वर्णित biofunctionalized प्रशिया नीले नैनोकणों synthesizing के लिए तकनीक माहिर के बाद, इस बहुमुखी डिजाइन विवो में आणविक इमेजिंग अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह कम Immun के लिए नैनोकणों के PEGylation की आवश्यकता होगीogenicity और vivo में अब परिसंचरण बार। यहाँ वर्णित डिजाइन करने के लिए भी इसी तरह, पंजाब एनपीएस में विवो प्रशासन के पहले एंटीबॉडी के साथ biofunctionalized जा सकता है। अन्य अध्ययनों theranostic (एक साथ चिकित्सा + नैदानिक) विवो में अनुप्रयोगों के लिए biofunctionalized पंजाब एनपीएस का उपयोग शामिल है। Photothermal उपचार के लिए प्रशिया नीले नैनोकणों के उपयोग की जांच स्टडीज (निकट अवरक्त तरंगदैर्ध्य पर उनके absorbance के विशेषताओं के आधार पर) वर्तमान में 21 चल रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) Sigma-Aldrich P9387
Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) Sigma-Aldrich 211591
Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) Sigma-Aldrich 236489
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody Millipore AB5320
Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 Peprotech 500-P156GBT
Neuro-2a Cell Line ATCC CCL-131
BSG D10 Cell Line Lab stock ---
OE21 Cell Line Sigma-Aldrich 96062201
SUDIPG1 Neurospheres Lab stock ---
Eol-1 Cell Line Sigma-Aldrich 94042252
Poly(L-lysine) hydrobromide Sigma-Aldrich P1399
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Aminoactinomycin D Sigma-Aldrich A9400
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
CellTrace Calcein Red-Orange, AM Life Technologies C34851
Avidin-Alexa Fluor 488 Life Technologies A21370
Centrifuge Eppendorf 5424
Peristaltic Pump Instech P270
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600
Sonicator QSonica Q125
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-642
Ultra Clean Aluminum Foil VWR 89107-732
Vortex Mixer VWR 58816-121
1.7 ml conical microcentrifuge tubes VWR 87003-295
15 ml conical centrifuge tubes VWR 21008-918
Tube holders VWR 82024-342
Disposable plastic cuvettes VWR 7000-590 (/586)
Zetasizer capillary cell VWR DTS1070
Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column VWR 82031-356
96-well cell culture tray VWR 29442-056
Trypsin EDTA 0.25% solution 1x JR Scientific 82702
Cell Culture Grade PBS (1x) Life Technologies 10010023
XTT Cell Proliferation Assay Kit Trevigen 4891-025-K
T75 Flask 89092-700 VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Biowhitaker 12-604Q
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10437-010
Pen-Strep 1x Life Technologies 15070063
Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope Olympus FV1200
Chambered Microscope Slides Thermo Scientific 154534
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 VWR 48366-227
Microscope Slides VWR 16004-368
RPMI Sigma-Aldrich R8758 
Agarose Sigma-Aldrich A9539 
FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences
3 T Clinical MRI Magnet GE Healthcare
100 ml round-bottom flask

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References

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