Abstract
Multimodale, gjør molekylær avbildning visualisering av biologiske prosesser på mobilnettet, subcellulære, og molekylær nivå resolusjoner ved hjelp av flere, utfyllende bildeteknikker. Disse avbildningsmidler lette sanntidsvurdering av trasé og mekanismer in vivo, som forbedrer både diagnostisk og terapeutisk effekt. Denne artikkelen presenterer protokollen for syntese av biofunctionalized prøyssiske blå nanopartikler (PB NPs) - en ny klasse av midler til bruk i multimodale, molekylære bildebehandlingsprogrammer. De avbildningsmodaliteter innlemmet i nanopartikler, fluorescens bildebehandling og magnetic resonance imaging (MRI), har komplementære egenskaper. PB NPS har en kjerne-skall utforming hvor gadolinium og manganioner innarbeidet i mellomrommene i gitteret PB generere MRI-kontrast, både i T-1 og T-2 -vektede sekvenser. PB NPs er belagt med fluorescerende avidin ved hjelp av elektroselv somForsamlingen, som gjør at fluorescens bildebehandling. De avidinbelagte nanopartikler er modifisert med biotinylerte ligander der det gis molekylære målretting evner til nanopartikler. Stabiliteten og toksisitet av nanopartiklene blir målt, så vel som deres MRI relaksiviteter. De multimodale, molekylær imaging evner av disse biofunctionalized PB NPs deretter demonstrert ved å bruke dem for fluorescens bildebehandling og molekylær MR in vitro.
Introduction
Molekyl avbildning er ikke-invasiv og målrettet visualisering av biologiske prosesser på celle, subcellulære, og molekylære nivå 1. Molekylær avbildning tillater et eksemplar for å forbli i det opprinnelige mikromiljøet mens de endogene trasé og mekanismer vurderes i sanntid. Vanligvis innebærer molekyl avbildning administrering av et eksogent avbildningsmiddel i form av et lite molekyl, makromolekyl, eller nanopartikler for å visualisere målet, og spor aktuelle fysiologiske prosesser som studeres 2. De ulike bildediagnostikk som har blitt utforsket i molekylær avbildning inkludere MR, CT, PET, SPECT, ultralyd, photoacoustics, Raman-spektroskopi, Bioluminescens, fluorescens, og intramikros tre. Multimodal bilde er kombinasjonen av to eller flere bildediagnostikk hvor kombinasjonen forbedrer evnen til å visualisere og karakterisere forskjellige biologiske prosesser og hendelser 4. Multimodal bildebehandling utnytter styrkene til de enkelte bildeteknikker, mens kompensere for sine individuelle begrensninger tre.
Denne artikkelen presenterer protokollen for syntese av biofunctionalized prøyssiske blå nanopartikler (PB NPs) - en ny klasse av multimodale, molekylær avbildning agenter. PB NPs benyttes for fluorescens bildebehandling og molekylær MR. PB er et pigment bestående av alternerende jern (II) og jern (III) atomene i et flate-sentrert kubisk nettverk (figur 1). PB gitter består av lineære cyanid ligander i et Fe II - CN - Fe III binding som inneholder kationer for å balansere ladninger i sin tredimensjonale nettverk 5. Muligheten av å innlemme PB kationer inn i sin gitteret blir utnyttet ved separat lasting gadolinium og manganioner i PB NPS for MRI-kontrast.
Begrunnelsen for å forfølge en nanopartikkel design for MR kontrast er på grunn avfordelene dette design gir i forhold til agenter dagens MR-kontrast. Det store flertallet av amerikanske FDA-godkjente agenter MR-kontrast er gadoliniumchelater som er paramagnetisk i naturen og gi positiv kontrast av spin-gitter relaksasjonsmekanisme 6,7,8. I forhold til en enkelt gadolinium-chelatet som gir lav signalintensitet på egen hånd, gir innlemmelse av multiple gadolinium-ioner innenfor PB gitter av nanopartikler forbedret signalintensitet (positiv kontrast) 3,9. Videre, tilstedeværelsen av flere gadolinium-ioner i PB gitter øker den samlede spinn tetthet og størrelsen av paramagnetisme av nanopartikler, som forstyrrer den lokale magnetfelt i sin nærhet, og dermed generere negative kontrast ved spinn-spinn relaksasjonsmekanisme. Således gadolinium-inneholdende nanopartikler fungere både som en t (positiv) og T 2 agenter (negativ) kontrast 10,11.
I en undergruppe av pasienter med nedsatt nyrefunksjon, har administrasjonen av kontrastmidler gadolinium-basert vært knyttet til utvikling av nefrogen systemisk fibrose 8,12, 13. Denne observasjonen har bedt om undersøkelser av bruk av alternative paramagnetiske ioner som kontrastmidler for MR. Derfor er den allsidige utformingen av nanopartikler innrettet til å inkorporere manganioner i PB gitteret. I likhet med gadolinium--chelatene, mangan--chelatene er også paramagnetisk og brukes vanligvis til å gi positiv signalintensitet i MRI 7,14. Som med gadolinium-inneholdende PB NPS, manganholdige PB NPS også fungere som T 1 (positiv) og T 2 midler (negativ) kontrast.
Å innlemme fluorescens imaging evner, er nanopartikkel "kjerner" belagt med en "biofunksjonell" skall bestående av fluoresceinmerkede glykoprotein avidin (figur 1). Avidin ikke bare gjør at fluorescens bildebehandling, men fungerer også som en docking plattform for biotinylerte ligander som er rettet mot spesifikke celler og vev. Avidin-biotin binding er en av de sterkeste kjente, ikke-kovalente bindinger er karakterisert ved ekstremt sterk bindende affinitet mellom avidin og biotin 15. Feste av biotinylerte ligander til avidinbelagte PB NPs tildeler molekylære målretting evner til PB NPs.
Motivasjonen for å forfølge fluorescens og MR bruker PB NPs er fordi disse bildediagnostikk har komplementære egenskaper. Fluorescens bildebehandling er en av de mest brukte optiske molekylære bildeteknikker, og gir mulighet for samtidig visualisering av flere objekter ved høy følsomhet 1,16,17. Fluorescens bildebehandling er en trygg, ikke-invasiv modalitet, men er assosiert med lave dypet av penetrasjon og romlig oppløsning 1,3,16. På den annen side frembringer MR høy temporal end romlig oppløsning ikke-invasiv måte og uten behov for ioniserende stråling 1,3,16. Men MR lider av lav følsomhet. Derfor fluorescens-avbildning og MR ble valgt som de molekylære bildeteknikker på grunn av deres komplementære funksjoner av dybdepenetrering, følsomhet og romlig oppløsning.
Denne artikkelen presenterer protokollen for syntese og biofunctionalization av PB NPs, gadolinium-holdige PB NPs (GdPB), og mangan-holdige PB NPs (MnPB) 10,11. De følgende fremgangsmåter er beskrevet: 1) måling av størrelse, ladning, og tidsmessig stabilitet av nanopartiklene, 2) evaluering av cytotoksisitet av nanopartikler, 3) Måling av MRI relaksiviteter, og 4) utnyttelse av nanopartikler for fluorescens og molekyl MR-avbildning av en populasjon av målceller in vitro. Disse resultater viser at potensialet av NPS for anvendelse som multimodale molekyl, avbildningsmidler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av PB NPs, GdPB og MnPB
Syntese av nanopartikler (PB NPS, GdPB, eller MnPB) er oppnådd ved hjelp av en one-pot syntese ordningen ved å utføre trinnene beskrevet nedenfor:
- Forbered oppløsning "A" inneholdende 5 ml av 5 mM kalium hexacyanoferrate (II) i deionisert (DI) vann. Avhengig av hvilken type nanopartikkel blir syntetisert - PB NPs, GdPB, eller MnPB, forberede løsning 'B' som følger:
- For PB NPS: fremstille 10 ml av en oppløsning inneholdende 2,5 mM jern (III) klorid i DI-vann.
- For GdPB NPS: fremstille 10 ml av en oppløsning inneholdende 2,5 mM av hver av gadolinium (III) nitrat og jern (III) klorid i DI vann
- For MnPB NPS: fremstille 10 ml av en oppløsning inneholdende 2,5 mM av hver av mangan (II) klorid og jern (III) klorid i DI-vann.
- Legg oppløsning 'B' til en rundkolbe, og omrøres kolbeinnholdet ved værelsetemperatur (RT), og1000 rpm. Legg oppløsning 'A' dråpevis inn i rundbunnet kolbe inneholdende oppløsning 'B'. Styre strømningshastigheten for tilsetningen av oppløsningen "A" til "B" av en peristaltisk pumpe satt til å dispensere ca. 10 ml / time.
- Fortsett omrøring ved 1000 rpm ved romtemperatur i ytterligere 30 min etter tilsetningen av oppløsningen "A" til "B" er fullført. Stoppe stirring og samle blandingen.
- Overfør alikvoter av blandingen i mikrosentrifugerør å skylle nanopartiklene frie for ikke-omsatte komponenter. Tilsett 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml reaksjonsblanding) for hver prøve for å bistå i partikkelsamling ved sentrifugering.
- Sentrifuger hver alikvot av nanopartikler i minst 10 min ved 20 000 x g. Etter sentrifugering, fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender hver nanopartikkel pellet i 1 ml DI vann via sonikasjon bruker en mikrotip (ultralydpuls på / av = 1/1 sek, amplitude = 50%, varighet =5 sek, ultralydeffekt = 125 W) for å bryte opp pelleten.
- Gjenta trinn 1.4 til 1.6 i det minste 3 x for å sikre at nanopartiklene er frie for komponenter i de innledende reaksjons og reaksjons-biprodukter. Etter den siste sentrifugering, resuspendere partiklene i 1 ml avionisert vann.
2. Biofunctionalization of PB NPs, GdPB og MnPB
Biofunctionalization av nanopartikler innbefatter belegging av nanopartikkel "kjerner" med avidin og tilsetning av biotinylerte ligander som beskrevet nedenfor:
- Belegg av Nanopartikler med Fluorescent Avidin
Belegg av nanopartikler med fluorescerende avidin oppnås ved hjelp av elektrostatisk egen lingen positivt ladet avidin (pI ~ 10.5) er belagt på å negativt ladet nanopartikler som følger 18:- Forberede suspensjoner av PB NPs, GdPB eller MnPB i en ml DI vann. Filter Alexa Fluor 488-merket avidin (A488, rekonstituert i DI vann)gjennom et 0,2 um nylonfilter mikrosentrifuge ved 14.000 x g i 10 min. Legg ≤0.2 mg avidin / mg nanopartikler. Legg hver filtrert delmengde av A488 separat til prøver av PB NPs, GdPB, eller MnPB.
- Ta kontakt med nanopartikler med A488 for 2-4 timer med forsiktig risting eller rotasjon ved 4 ° C. Beskytt prøvene fra lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
MERK: Dette trinnet gir A488 belagt PB NPs (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), og MnPB (MnPB-A488).
- Festing av Biotinylert Antistoffer
Festing av biotinylerte rettet antistoffer mot avidinbelagte nanopartikler er oppnådd ved hjelp av avidinbiotin interaksjoner som følger:- Forberede suspensjoner av de avidinbelagt nanopartikler - PB-A488, GdPB-A488, og MnPB-A488 i 1 ml DI vann. Filtrere biotinylerte antistoff (som leveres av produsenten) gjennom et 0,2 mikrometer nylon mikrofilter på 14.000 × g for 10 min.
MERK: Her bruker denne studien biotinylated anti-neuron-glial-antigen 2 (ANG2) som er rettet mot NG2 overuttrykt i celler og vev fra sentralnervesystemet og biotinylert anti-human eotaksin-3 (Eot3) som er rettet mot reseptorer overuttrykt på eosinofile eller eosinofile cellelinjer. - Legg hver filtrert alikvot av biotinylert antistoff separat til porsjoner av avidinbelagte nanopartikler. Legg ≤0.05 mg biotinylerte antistoff / mg avidinbelagte nanopartikler. Kontakt avidinbelagte nanopartikler med de biotinylerte antistoffer (ANG2 eller Eot3) for 2-4 timer med lett risting eller rotasjon ved 4 ° C. Beskytt prøvene fra lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
MERK: Dette trinnet gir antistoff belagt nanopartikler (f.eks GdPB-A488-Eot3 og MnPB-A488-ANG2).
- Forberede suspensjoner av de avidinbelagt nanopartikler - PB-A488, GdPB-A488, og MnPB-A488 i 1 ml DI vann. Filtrere biotinylerte antistoff (som leveres av produsenten) gjennom et 0,2 mikrometer nylon mikrofilter på 14.000 × g for 10 min.
3. Dimensjonering, Zeta potensial, og Temporal Stabilitet av Nanopartikler
Den størrelsesfordeling, ladning, og stabiliteten av nanopartiklene måles ved hjelp av dynamisklysspredning (DLS) metoder som beskrevet nedenfor:
- Dimensjonering av Nanopartikler
Dimensjonering av nanopartikler er oppnådd ved hjelp av dynamisk lysspredning som følger:- Tilsett 10 pl av nanopartikkelprøve (1 mg / ml) til 990 pl DI vann i en engangs plast kyvette.
MERK: Dette er representativ verdi for en god DLS signal. - Cap kyvetten og virvle å blande godt. Plasser kyvette i et system som brukes til å analysere partikkelstørrelse for å måle størrelsen på nanopartiklene. Gjennomføre partikkelstørrelse analyse på en målevinkel på 173 °.
- Tilsett 10 pl av nanopartikkelprøve (1 mg / ml) til 990 pl DI vann i en engangs plast kyvette.
- Zeta Potensiale Nanopartikler
Zeta-potensialet av nanopartiklene måles ved hjelp av faseanalyse lysspredning som følger:- Tilsett 100 ul av nanopartikkelprøve (1 mg / ml) til 900 pl DI vann i en engangs plast kapillær celle. Denne verdien er representativ for en god zetapotensial måling.
- Plasser capillary celle i et system som brukes til å analysere zeta-potensial for å måle zeta-potensialet av nanopartikler ved hjelp av standardparametrene ved 25 ° C.
- Temporal Stabilitet av Nanopartikler
Temporal stabiliteten av nanopartiklene måles ved hjelp av dynamisk lysspredning som følger:- Vurdere stabiliteten av nanopartikler ved å måle størrelsen på nanopartikler i DI-vann, så vel som Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), som beskrevet i avsnitt 3.1.
- Gjenta størrelsesmålinger i DI vann og en gang DMEM / dag over en periode på 5 dager.
4. Cytotoksisitet av Nanopartikler
Cytotoksisitet av nanopartikler blir målt ved anvendelse av en XTT-celleproliferasjonsanalyse som følger:
- Seed 10.000-15.000 celler / brønn av hver celletype studert (Neuro2a, BSG D10, EOL-1, og OE21) i en 96-brønns plate. Sørg for at det totale volumet av seeded celler ikke eXceed 0,2 ml / brønn. Inkuber seeded celler over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
- Kontakte nanopartikler med cellene:
- Cellene inkuberes med forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler (0,01 til 0,5 mg / ml). Se tabell 1, som en representativ tabell som beskriver mengder av nanopartikler (i 50 ul) tilsatt til cellene etter fjerning av 50 ul av medium / brønn.
- For å ta hensyn til en hvilken som helst forstyrrende absorbans av nanopartikler i analysen, tilføre emnet som består av den passende konsentrasjon av nanopartikler (0-0,5 mg / ml; i ekvivalens til de mengder tilsatt til cellene) til medium uten celler.
- Inkuber cellene med nanopartikler over natten ved 37 ° C og 5% CO2. Sug mediet fra hver brønn og skyll med farging buffer bestående av 5% føtalt bovint serum (FBS) i fosfat-bufret oppløsning (PBS). Tilsett 100 ul av mediet uten fenol rød, og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2for 16-18 hr.
- Cellene inkuberes med forskjellige konsentrasjoner av nanopartikler (0,01 til 0,5 mg / ml). Se tabell 1, som en representativ tabell som beskriver mengder av nanopartikler (i 50 ul) tilsatt til cellene etter fjerning av 50 ul av medium / brønn.
- Forberede XTT celleproliferasjonsmetoden arbeidsløsning ved å blande de kit komponenter (XTT Reagent og XTT Activator) som per produsentens spesifikasjoner. Aspirer media fra brønnene og tilsett 100 mL av RPMI (RPMI w / o fenol rød + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) eller egnet medium for celletype studert. Tilsett 50 pl av XTT arbeidsløsning til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 2-2,5 timer.
- Måle absorbans ved 490 nm, med en referanse bølgelengde på 630 nm for å korrigere for fingeravtrykk eller flekker. Beregne korrigert absorbans for hver brønn (A 490-A 630) og gjennomsnittlig målingene for gjentak.
- Trekk fra de tomme opplesninger fra hver brønn verdi å beregne de endelige korrigerte absorbansverdier. Beregn overlevelsesprosenten for hver prøve ved å normalisere den endelige korrigerte absorbans med den i ubehandlede celler uten nanopartikler. Plot survival prosent som funksjon av nanopartikkelkonsentrasjon.
5. MR Relaksiviteter av PB NPs, GdPB og MnPB
MRI relaksivitet måles ved hjelp av en T - og T 2 -vektede sekvenser ved fremstilling av et MRI "fantom" ved bruk av en 96-brønners plate inneholdende nanopartikler som beskrevet nedenfor:
- Phantom Forberedelse
- Fremstille en 96-brønns plate med hver brønn inneholdende 100 ul nanopartikler (PB NPS, GdPB eller MnPB) ved passende konsentrasjon. Fra og med en konsentrasjon på 0,4 mM for hver type nanopartikkel, serielt fortynnet nanopartiklene 2 x ved hjelp av avionisert vann inntil en konsentrasjon på 2,4 x 10 -5 M er nådd (dette krever 14 fortynninger og 15 brønner).
- Tilsett 100 ul av smeltet 1% agarose-løsning i deionisert vann til hver brønn, og bland godt. La gelen stivne ved 4 ° C i 12 timer.
MERK: Dette gir et fantom som inneholder seriefortynninger avnanopartikler i størknet agarose. - Plasser fantom i en horisontal 3 T klinisk magnet under en solid blokk med 2% agar (150 cm 3). Fest fantom og blokk av agar i sentrum av en 8-kanals HD hjernen coil. Mål relaksasjonstider ved hjelp av 0,5 mm tykke koronale snitt i midthøyde av 96-brønns plate 11.
- T 1 - og T 2 -vektede Sekvenser
Bruk følgende representative innstillinger for å anskaffe sekvensene i den kliniske magnet.
MERK: Disse verdiene er optimalisert for nanopartiklene som benyttes i foreliggende studie:- Erverve T 1 -vektede (T1W) MR-bilder ved hjelp av følgende væske svekket inversjon recovery (FLAIR) sekvens: Echo tog (ET) = 8, Repetisjon tid (TR) = 2300 msek, Echo tid (TE) = 24,4 msek, Matrix størrelse = 512 x 224, Field of view (FOV) = 16 x 16 cm 2.
- Erverve T 2 -vektede (T2W) MR-bilder ved hjelp av følgende rask relaxasjon rask spin ekko (FRFSE) sekvens: ET = 21; TR = 3500 msek; TE = 104 ms; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm2.
- Erverve T1W og T2W MR-bilder på 127 MHz (3 T) på følgende inversjon ganger: 50, 177, 432, 942, 1961, og 4000 msek.
- Måling av MR Relaksiviteter
- Etter å skaffe T1W og T2W bilder ved hjelp av sekvenser som er beskrevet i kapittel 5.2, måle signalstyrken for hver brønn med ImageJ, heretter betegnet som den regionen av interesse (ROI) ved å velge hvert ROI ved bruk av den ovale crop-knappen på hovedverktøylinjen, deretter velge Analyser> Mål.
MERK: En pop-up bør vise gjennomsnittet signalstyrken for hver ROI under kolonnen merket "Mean". - For hver ROI, plotte målt signalintensitet mot sin spesifikke inversjon tid. Hvis nødvendig, snu poeng (opplesninger) som genererer en innledende "boble" eller uteliggere i begynnelsen av tomten (nedre inversjonganger).
MERK: Disse målingene er generert ved lave inversjon ganger fordi MR måler omfanget eller absolutte verdien av bildene snarere enn deres faktiske (negativ) verdi, som må gjøres rede / korrigert for 19. - Forberede en eksponentiell fit for hver tomt på signalintensitet for ROIs (SI) vs. inversjon ganger (T I) som beskrevet i kapittel 5.2. Plot T I på x-aksen, SI på y-aksen; ɑ og Δ er konstanter bestemt av regresjon, og T 1 eller T 2 er den variabelen som skal løses:
hvor t = T 1, T 2. - Løse for en T eller T 2 ved hjelp av ovennevnte ligning, og plotte den inverse av de beregnede verdiene (1 / T 1 og 1 / T 2), mot konsentrasjonen av nanopartiklene som brukes i hvert ROI.
- Beregne helningen av det lineære diagram somgir de relaksiviteter R1 og R2.
MERK: Følgende avsnitt av protokollen beskriver anvendelsen av nanopartikler for fluorescerende merking og generere MR kontrast i målrettede celler.
- Etter å skaffe T1W og T2W bilder ved hjelp av sekvenser som er beskrevet i kapittel 5.2, måle signalstyrken for hver brønn med ImageJ, heretter betegnet som den regionen av interesse (ROI) ved å velge hvert ROI ved bruk av den ovale crop-knappen på hovedverktøylinjen, deretter velge Analyser> Mål.
6. Fluorescent Merking av Målrettede Cells Bruke Nanopartikler - Konfokalmikroskopi
MERK: nanopartikler (PB NPS, GdPB, og MnPB) kan brukes til å fluorescently merke en befolkning på målrettede celler (overvåket av konfokalmikroskopi) som følger:
- Syntese av Fluorescent Nanopartikler
- Syntetisere GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 for fluorescerende merking av en befolkning på målrettede celler ved å følge trinnene som er beskrevet i del 1 og 2.
- Utarbeidelse av celler for fluorescens Targeting
- Coat no. 1,5 mikrodekkglass ved å dyppe dem i en oppløsning av 0,002% poly (L-lysin) hydrobromid i 90 min. Fjerne dekkglass fra løsningen og la dem tørke i 24 timer.
- Frø cellene (f.eks EOL-1, BSG D10, SUDIPG1) på de belagte dekkglass plassert i en 6-brønns plate og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i minst 16 timer. Rens cellene med en 1 x PBS-oppløsning og (valgfritt) feste med 10% formaldehyd i nøytral bufferløsning i 15 min. Beis cellene med 5 uM rød-oransje celle-permeant fargestoff i PBS ved 37 ° C i 30 min. Deretter skylle celler med PBS.
- > Fluorescent Merking av Målrettede Cells
- Tilsett 1% bovint serumalbumin (BSA; i DI-vann) til cellene for å minimere ikke-spesifikk binding av cellene og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Inkuber cellene med nanopartiklene i 1% BSA i 1 time. For EOL-1: ruge med 0,2 mg / ml GdPB-A488 eller GdPB-A488-Eot3; For BSG D10 og SUDIPG1: inkuber med 0,2 mg / ml MnPB-A488 eller MnPB-A488-ANG2. Skyll cellene med PBS 3 × å fjerne unbound nanopartikler.
- Invertere forsiktig dekselet glass (som inneholder celler og nanopartikler) på et objektglass, slik at det ikke er noen luftbobler. Forsegle kanten mellom dekkglass og objektglass ved forsiktig påføre klar neglelakk. Bilde cellene ved hjelp av et konfokal laser scanning mikroskop.
7. Fluorescent Merking av Målrettede Cells Bruke Nanopartikler - flowcytometrisystemer
Nanopartiklene (PB NPS, GdPB og MnPB) kan brukes til å fluorescensmerket etikett en populasjon av målceller (målt ved flowcytometri) som følger:
- Forbered suspensjoner av cellene blir målrettet i PBS. For rene kulturstudier, suspensjoner består av en enkelt celletype (f.eks BSG D10); resuspendere en cellepellet av BSG D10 celler i PBS ved 100.000 celler / ml (10 ml totalt). For blandede studier kultur, suspensjoner bestå av minst to celletyper (f.eks EOL-en og OE21); lik BSG D10, resuspender cellepelleter av EOL-1 og OE21 i PBS ved 100.000 celler / ml hver (10 ml totalt).
- Forbered varierende forhold av EOL-1: OE21 1: 0 (2 ml EOL-1), 3: 1 (1,5 ml EOL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml hver av EOL-1 og OE21), 1: 3 (0,5 ml EOL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Blokkere celler (rene og blandede suspensjoner) blir målrettet av nanopartikler med 2 ml 5% BSA for å minimere ikke-spesifikk binding.
- Tilsett 1 ml (1 mg / ml) nanopartikler til cellene og inkuberes i 1 time. For BSG D10, inkuber celler med MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (kontroll antistoff), eller MnPB-A488-ANG2). For blandinger av EOL-en og OE21, inkuber blandinger med et fast beløp på GdPB-A488-Eot3.
- Rens cellene fri for ubundet nanopartikler ved å spinne ned prøvene ved 1000 x g i 5 minutter ved minst 3 x for å fjerne ubundne partikler. Resuspender cellene i 1 ml PBS og fest med 10% formaldehyd i PBS. Beis cellene ved inkubering med 10 ug / ml7-Aminoactinomytcin D i PBS på is i 30 min. Skyll med PBS, og deretter analysere 10000 gated celler fra hver prøve ved anvendelse av et flowcytometer.
8. Generering MR kontrast på Målrettede Cells Bruke Nanopartikler
Nanopartiklene (PB NPS, GdPB og MnPB) kan brukes til å generere MRI-kontrast (i begge T 1 - og T 2 vektet sekvenser) i en populasjon av målceller som følger:
- Phantom Forberedelse
- Dyrke celler (f.eks BSG D10) i T75 kolber til ~ 80% samløpet. Bruk passende vekstmedium og betingelser. For BSG D10, dyrke cellene i DMEM + 10% FBS + 1 x Pen-Strep ved 37 ° C og 5% CO2.
- Rens cellene fri for medium med 5 ml PBS og blokkere cellene med 5 ml 1% BSA i PBS i 1 time for å minimere ikke-spesifikk binding. Tilsett 5 ml (0,5 mg / ml) nanopartikler til cellene. For BSG D10, inkuberes cellene med MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (kontroll antistoff), og MNPB-A488-ANG2 for 1 time.
- Rens cellene 3 x med 5 ml PBS for å fjerne ubundet nanopartikler. Trypsineres cellene ved inkubering av cellene med 2 ml trypsin-EDTA 0,25% oppløsning 1 x i 5 min ved 37 ° C og 5% CO2 for å løsne dem fra kolben for fantom preparat. Tilsett 8 ml DMEM å slukke trypsinisering av cellene.
- Utlevering av cellene ved sentrifugering ved 1000 dem x g i 5 min; suge ut supernatanten. Suspender cellene i 1 ml PBS og tilsett 1 ml 10% formaldehyd i PBS å fikse cellene. Tilsett 100 ul av hver prøve til en separat brønn i en 96-brønns plate.
- Tilsett 100 ul av smeltet 1% agarose-løsning i deionisert vann til hver brønn, og bland godt ved å pipettere opp og ned. La gelen stivne ved 4 ° C i 12 timer.
MERK: Dette gir et fantom som inneholder celler med vedlagte nanopartikler i størknet agarose. - Plasser fantom i en horisontal 3 T klinisk magnet ved siden av en solid blokk med 2% agar (150 cm
- T 1 - og T 2 -vektede Sekvenser
Bruk følgende innstillinger for å anskaffe de sekvensene i klinisk MR magnet:- Erverve T1W MR-bilder ved hjelp av følgende spinn ekko sekvens: Echo tog (ET) = 1, Repetisjon tid (TR) = 650 msek, Echo tid (TE) = 11 msek, Matrix size = 320 x 256, Field of view (FOV) = 10 x 10 cm 2.
- Erverve T2W MR-bilder ved hjelp av følgende FRFSE sekvens: ET = 28; TR = 3000 msek; TE = 101 ms; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
- Etter oppkjøpet Processing
- For lettere å lese, konvertere den opprinnelige gråtonebilder i en fargeskala bilde ved hjelp ImageJ: Velg Bilde> type> 8-Bit, for å konvertere bildet til gråtoner.
- Beregn den normaliserte intensiteten for hver prøve etter å subtrahere signalbidrag fra agarosen løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke ett-potten syntese ordningen, nanopartikler av PB NPs (gjennomsnittlig diameter 78,8 nm, polydispersitetsindeksen (PDI) = 0.230, beregnet av dynamisk lysspredning instrument), GdPB (gjennomsnittlig diameter 164,2 nm, PDI = 0.102), eller MnPB ( midlere diameter 122,4 nm, PDI = 0,124) som er monodispers (som målt ved DLS) kan være gjennomgående syntetisert (figur 2A). De målte zeta-potensialer av de syntetiserte nanopartiklene er mindre enn -30 mV (figur 2B), hvilket indikerer moderat stabilitet av partiklene basert på deres overflateladninger. De syntetiserte nanopartikler utviser tilstrekkelig tidsmessig stabilitet over en periode på 5 dager, som vist ved deres ensartede størrelser (hydrodynamiske diametre; Figur 2C).
Når co-inkubert med celler, nanopartikler (PB NPS, GdPB, og MnPB) utviser ubetydelig cytotoksisitet til cellene under visse terskelkonsentrasjoner (figur 3). Cytotoksisitet studør av PB NPs på Neuro2a celler indikerer ubetydelig cytotoksisitet når co-inkubert med Neuro2a ved konsentrasjoner lavere enn 0,67 × 10 -6 mg / celle (figur 3A). Cytotoksisitets studier utført av co-inkubasjon av GdPB med EOL-en og OE21 celler indikerer ubetydelig cytotoksisitet av GdPB på begge celletyper i konsentrasjoner lavere enn 0,25 × 10 -6 mg / celle (figur 3B). Lignende, cytotoksisitets studier indikerer ubetydelig cytotoksisitet av MnPB når co-inkubert med BSG D10 ved konsentrasjoner lavere enn 0,25 × 10 -6 mg / celle (Figur 3C). Den ytterligere cytotoksisitet av MnPB og GdPB kan tilskrives tilstedeværelsen av ytterligere ioner (Mn 2+ for MnPB og Gd 3+ for GdPB) inne i nanopartikkelkjernen.
MRI relaksiviteten studier ble utført med fantomer består av varierende konsentrasjoner av PB NPs, GdPB, og MnPB. Studiene viser nytten av nanoparpartikler som MR kontrastmidler i både T1W og T2W sekvenser (figur 4). Dette er demonstrert av den økte hyperintensities (positiv kontrast) i T en vektet sekvenser og økte hypointensities (negativ kontrast) i T 2 -vektede sekvenser med økende konsentrasjoner av både GdPB (Figur 4A) og MnPB (Figur 4B). Basert på relaksiviteten målinger, er MnPB en moderat T 1 middel og en sterk T 2 middel mens GdPB er en sterk T en agent og en moderat T 2 middel (Figur 4C). De målte relaksiviteter av GdPB og MnPB sammenligne gunstig med de av kontrastmidler 10, 11 klinisk godkjent.
De biofunctionalized PB NPs er i stand til å fluorescently merke en befolkning på målrettede celler in vitro (Figur 5). Når biofunctionalized med både fluorescerende avidin (A488) og biotinylated anti-human eotaxin-3 antistoff (Eot3), kan GdPB fluorescently målrette en befolkning på EOL-1 celler (Figur 5B). Kontroll GdPB nanopartikler uten Eot3 utstillings ubetydelig binding (Figur 5A) Tilsvarende når GdPB er biofunctionalized med både fluorescerende avidin (A488) og biotinylated anti-nevronale glial antigen-2 (ANG2), nanopartikler kan fluorescently målrette bestander av BSG D10 og SUDIPG1 neurosfærer (Tall 5D og F), mens kontrollnanopartikler uten målretting antistoff ikke klarer å fluorescently merke celler (Tall 5C og E). Således effektiv målretting og fluorescerende merking krever nærvær av både fluorescerende avidin og biotinylert målrettende ligand.
Evnen til de biofunctionalized nanopartikler til fluorescently merke en populasjon av celler, som kvantifisert ved flowcytometri, bekrefter behovet for både fluorescerende avidin og biotinylated målretting ligand for effektiv fluorescerende merking (figur 6). BSG D10 celler i kontakt med MnPB inneholder både A488 og ANG2 (MnPB-A488-ANG2) viser økt fluorescens (figur 6A), og prosentandel av fluoresceinmerkede celler (figur 6B) når sammenlignet med kontroll fluorescerende nanopartikler med et kontrollantistoff (MnPB-A488 -AbC) og uten et antistoff (MnPB-A488). De biofunctionalized nanopartikler er i stand til å fluorescently målrette en bestemt sub-populasjon av celler i en celleblanding (figur 6C). Dette vises som anleggs mengder EOL-1-targeting, er fluorescerende GdPB (GdPB-A488-Eot3) i kontakt med målrettede celler (EOL-1) og kontrollceller (OE21). Fluorescens øker etter hvert som andelen av EOL-1 er forhøyet (økt Alexa Fluor 488 signalintensitet, figur 6C) i blandingen. Dette indikerer spesifisiteten av nanopartiklene for sub-populasjon av celler i cell blanding.
De biofunctionalized PB NPs øke MR kontrast i en populasjon av målrettede celler (figur 7). Når BSG D10 celler blir kontaktet med tilsvarende konsentrasjoner av eksperimentell (MnPB-A488-ANG2) og kontroll (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler, fantomer utstillings økt hyperintensity for celler i kontakt med MnPB-A488-ANG2 sammenlignet med kontroller i T1W sekvenser og økt hypointensity for celler i kontakt med MnPB-A488-ANG2 sammenlignet med kontroller i T2W sekvenser (figur 7A). Bildeanalyse av ROIs innenfor stiplede linjer bekrefte denne trenden der cellene i kontakt med forsøks partikler utviser signifikant øket intensitet sammenlignet med kontroller i T1W sekvenser og betydelig redusert intensitet i forhold til kontrollene i T2W sekvenser (figur 7b).
Figur 1: Kjernen-shell design av PB NPs. Kjernen består av en PB gitter, som består av lineære cyanid ligander i en Fe II - CN -. Fe III binding Disse bindinger aktivere PB NPS å innlemme kationer innenfor sin tre-dimensjonalt nettverk som et middel for å balansere avgifter 5. Dette kation bindende evne prøyssisk blå utnyttes til å laste gadolinium og mangan ioner innenfor gitteret, som gir MR kontrast. Kjernen er belagt med et skall, biofunksjonell består av fluorescerende avidin for å muliggjøre fluorescens-avbildning og biotinylerte ligander for å aktivere molekyl målretting.
Figur 2:. Størrelse, kostnad, og stabiliteten i PB NPs (A) Størrelse distribusjoner av PB (blå), GdPB (rød) og MnPB (svart) nanopartikler målt ved DLS. (B (C) Temporal stabilitet PB (blått), GdPB (rød) og MnPB (sort) nanopartikler i vann (faststoff) og DMEM (prikket) i fem dager etter deres syntese, målt ved DLS.
Fig. 3: Cytotoksisitet av PB NPS Cytotoksisitetsdata studier ved hjelp av forskjellige konsentrasjoner av (A) PB NPS tilsatt til et fast antall av Neuro2a-celler (B) GdPB tilsatt til en fast mengde av EOL-1 og OE-21 celler, henholdsvis, og ( C) MnPB tilsatt til et fast antall av BSG D10 celler. Celleoverlevelse ble beregnet ved 24 og 48 timer. Gjengitt med tillatelse fra Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society; Ref 10 med tillatelse fra Dove Press Ltd; og Ref 21 med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry.
Figur 4: MR-bilder og relaksiviteter av GdPB og MnPB på 3 T. Hyperintensity i T en vektet sekvenser og hypointensity i T 2 -vektede sekvenser av (A) GdPB og (B) MnPB som en funksjon av konsentrasjonen av nanopartikler. (C) Tabulering av relaxitivies av PB NPs, GdPB og MnPB målt til 3 T. gjengitt med tillatelse fra Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society.
Figur 5: Fluorescent merking av målrettede celler ved hjelp av biofunctionalized PB NPs, målt ved laserskanning konfokalmikroskopi Bilder av EOL-1 celler behandlet med (A) kontroll (GdPB-A488) og (B) eksperimentell (GdPB-A488-Eot3. ) nanopartikler.Bilder av BSG neurosfærer behandlet med (C) kontroll (MnPB-A488) og (D) eksperimentelle (MnPB-A488-ANG2) nanopartikler. Bilder av SUDIPG1 neurosfærer behandlet med (E) kontroll (MnPB-A488) og (F) eksperimentelle (MnPB-A488-ANG2) nanopartikler. Gjengitt med tillatelse fra Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Fluorescent merking av målrettede celler ved hjelp av biofunctionalized PB NPs, målt ved flowcytometri (A) Flowcytometri histogrammer av BSG D10 celler behandlet med eksperimentell (MnPB-A488-ANG2) og kontroll (MnPB-A488-ABC og MnPB. -A488) nanopartikler. (B) Percentage av BSG D10 celler fra panel (A) som er fluorescerende (% av Alexa-Fluor positiv) ved behandling med eksperimentell (MnPB-A488-ANG2) og kontroll (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler, ** p <0,05. (C) Flowcytometri spredningsplott av en celleblanding som inneholder varierende mengder av EOL-1 (målrettede celler) og OE21 (kontrollceller) målrettet av nanopartikler (GdPB-A488-Eot3). Gjengitt med tillatelse fra Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society og fra Ref 10 med tillatelse fra Dove Press Ltd. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7:. Økende MR kontrast i målrettede celler ved hjelp av biofunctionalized PB NPs (A) T en vektet og T <sub> 2 -vektede kontrastforsterkning i fantomer som består av et fast antall BSG D10 celler behandlet med eksperimentell (MnPB-A488-ANG2) og kontroll (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler. (B) Normalisert signalintensitet for BSG D10 celler behandlet med eksperimentell (MnPB-A488-ANG2) og kontroll (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler, ** p <0,05. Gjengitt fra Ref 10 med tillatelse fra Dove Press Ltd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen har presentert metoder for syntese av en ny klasse av multimodale, molekylær avbildning agenter basert på biofunctionalized prøyssiske blå nanopartikler. De molekylære avbildningsmodaliteter innlemmet i nanopartikler er fluorescens bildebehandling og molekylær MR, på grunn av deres komplementære egenskaper. De biofunctionalized prøyssiske blå nanopartikler har en kjerne-shell design. De viktigste trinn i syntesen av disse nanopartiklene er: 1) en-kolbesyntese som gir kjernene som er omfattet av Preussen blå nanopartikler (PB NPS), som inneholder gadolinium Preussen blå nanopartikler (GdPB), eller mangan-holdige prøysser blå nanopartikler (MnPB), 2) biofunctionalization av nanopartikler ved hjelp av fluorescerende avidin ved elektro selv-sammenstillingen, og 3) festing av biotinylerte ligander (antistoffer) til nanopartikler ved hjelp av robuste avidin-biotin interaksjon. Både fluorescerende avidin og biotinylerte ligander utgjør biofunctional skall av nanopartiklene.
Den ene-pott syntese gir PB NPs, GdPB eller MnPB som fungerer både som T 1 og T 2 kontrastmidler for MRI. Mengdene av de paramagnetiske ioner (gadolinium eller mangan) som er lastet inn i nanopartikkelkjernen kan endres (øker eller reduseres) ved å variere mengdene av de paramagnetiske ion-inneholdende salter (gadolinium (III) nitrat og mangan (II) klorid) i en-kolbesyntese (trinn 1.2). Dette resulterer i forandret (økt eller redusert) MR signalintensitet. Imidlertid kan disse modifikasjoner i synteseskjema resultere i ustabile, aggregerte nanopartikler. For å dempe bekymringer knyttet til aggregering, kan den one-pot syntese modifiseres for å innlemme størrelse-kontrollerende capping agenter som citrate under syntese 20.
Biofunctionalization av nanopartikkel kjerner oppnås ved elektroselvbygging med fluorescerende avidin, som enables fluorescens bildebehandling. Elektroselvbygging krever motsatte ladninger på overflaten av nanopartikler og belegget polymer (i denne artikkelen, fluorescerende avidin). For å endre overflatefunksjonalitet av nanopartikler, kan avidin bli erstattet av positivt ladede polymerer (for eksempel polylysin, eller en amingruppe som inneholder polyetylenglykol) i løpet av syntesen. Men de relative andeler av nanopartiklene og polymerbelegget vil måtte bli optimalisert for å opprettholde nanopartikkelstørrelse og stabilitet og for å hindre aggregering.
Tilsetting av de biotinylerte antistoffer mot avidinbelagt nanopartikler overfører molekylære målretting evner til PB-baserte nanopartikler. Dette trinn er basert på den robuste interaksjon mellom avidin og biotin (likevekts-dissosiasjonskonstanten, K d ~ 10 -15). Som ved foregående trinn, de relative andeler av de avidinbelagte nanopartikler og biotinylerte ligander må være optimized for derved å hindre den biotinylerte ligand fra samtidig å binde to avidinbelagt nanopartikler resulterer i nanopartikkel aggregering. For molekyl målretting, kan antistoffene bli erstattet av andre målretting ligander som antistoff-fragmenter (Fab), enkelt-kjede variable fragment (scFv), peptider, eller aptamerer.
De viktigste fordelene ved denne metode for syntese av nanopartikler som biofunctionalized multimodalt, molekylavbildningsmidler er: 1) lettvinte one-pot (1-trinn) syntese av nanopartikkelkjerner, og 2) sekvensiell kontakt-trinn (elektroselvbygging og avidin biotin interaksjoner) for belegg på nanopartikkel kjerne med en biofunksjonell skall. Andre fordeler med nanopartiklene omfatter det faktum at Preussen blå (solgt som Radiogardase) allerede er FDA-godkjent for bruk på mennesker, og at de nanopartikler som resulterer fra one-pot synteseskjema kan brukes som et MRI-kontrastmiddel både i T 1 ( positive) og T 2 </ Sub> (negative) -vektede sekvenser, som ikke er lett oppnås ved hjelp av andre kontrastmidler eller nanopartikkel plattformer uten kompliserte synteseskjemaer eller spesialiserte kjemikalier til syntese av kontrastmidlene. En begrensning av teknikken er at syntesen kan føre til polydisperse nanopartikler med aggregater hvis de relative andeler av reaktantene i både nanopartikkelkjernen syntese og biofunksjonell skall beleggtrinn ikke er nøye optimalisert for reaktantene som benyttes i de aktuelle trinn. For eksempel, kan de relative mengdeforhold for belegning av nanopartikler kjerner med avidin ikke utvides til belegging av nanopartikler med polylysin uten forutgående optimaliseringsstudier.
Etter å mestre teknikken for å syntetisere biofunctionalized prøyssisk blå nanopartikler som er beskrevet her, kan dette allsidig design endres for molekylær imaging studier in vivo. Dette vil kreve PEGylering av nanopartikler for lavere Immunogenicity og lengre sirkulasjonstid in vivo. Lik utforming beskrevet her, kan PB NPs bli biofunctionalized med antistoffer før in vivo administrasjon. Andre studier inkluderer bruk av biofunctionalized PB NPs for theranostic (samtidig terapi + diagnostiske) applikasjoner in vivo. Undersøkelser om bruk av prøyssiske blå nanopartikler for fototermiske terapi (basert på deres absorbans kjennetegn på nær infrarøde bølgelengder) er for tiden i gang 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
