Abstract
Multimodal, imagiologia molecular permite a visualização de processos biológicos em resoluções celulares, subcelulares, e em nível molecular, utilizando várias técnicas de imagem, complementares. Esses agentes de imagiologia facilitar a avaliação em tempo real das vias e mecanismos in vivo, o que aumenta tanto a eficácia de diagnóstico e terapêutico. Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) - uma nova classe de agentes para a utilização em aplicações de imagem molecular multimodais. As modalidades de imagem incorporados no nanopartículas, imagens de fluorescência e imagem por ressonância magnética (MRI), têm características complementares. As NPs PB possui um desenho de núcleo-invólucro que o gadolínio e iões de manganês incorporados dentro dos espaços intersticiais do retículo PB gerar contraste para IRM, tanto em T 1 e T 2 sequências ponderadas. Os PB NPs são revestidas com avidina fluorescente usando eletrostática auto-comotagem, o que permite imagens de fluorescência. As nanopartículas revestidas com avidina são modificados com ligandos biotinilados que conferem capacidades de segmentação moleculares para as nanopartículas. A estabilidade e a toxicidade das nanopartículas são medidos, bem como os seus relaxividades MRI. Os recursos de imagens multimodais, moleculares destas PB NPs bioativa são então demonstrada, utilizando-os para imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular in vitro.
Introduction
A imagem molecular é a visualização não invasiva e direcionada de processos biológicos no celular, subcelular e níveis moleculares 1. A imagem molecular permite um espécime a permanecer no seu microambiente nativa, enquanto as suas vias e mecanismos endógenos são avaliados em tempo real. Tipicamente, imagiologia molecular envolve a administração de um agente de imagiologia exógeno sob a forma de uma molécula pequena, macromolécula, ou nanopartículas para visualizar, alvo, e rastrear processos fisiológicos relevantes serem estudados 2. As diversas modalidades de imagem que foram exploradas em imagem molecular incluem MRI, CT, PET, SPECT, ultra-som, photoacoustics, espectroscopia Raman, bioluminescência, fluorescência e microscopia intravital 3. Imagiologia multimodal é a combinação de dois ou mais modalidades de imagem em que a combinação aumenta a capacidade de visualizar e caracterizar vários processos e eventos biológicos 4. Multimodal imaging explora os pontos fortes das técnicas de imagem individuais, enquanto compensar suas limitações individuais 3.
Este artigo apresenta o protocolo para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa (PB NPS) - uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares. Os PB NPs são utilizados para geração de imagens de fluorescência e MRI molecular. OP é um pigmento que consiste de ferro (II) e (III) átomos de ferro alterno numa rede cúbica de face centrada (Figura 1). A estrutura é composta de PB ligandos lineares de cianeto de uma liga de Fe II - CN - Fe III ligação que incorpora catiões para equilibrar cargas da sua rede tridimensional 5. A capacidade de PB para incorporar cátions em sua estrutura é explorada por carregar separadamente gadolínio e manganês nas NPs PB para o contraste de ressonância magnética.
A justificativa para perseguir um projeto de nanopartículas para o contraste MRI é por causa deas vantagens deste projeto oferece em relação a agentes de contraste MRI atuais. A grande maioria dos agentes de contraste de MRI e aprovado pelo FDA dos EUA são o gadolínio que são paramagnética na natureza e oferecem contraste positivo pelo spin-estrutura mecanismo de relaxamento 6,7,8. Em comparação com um único gadolínio-quelato que proporciona uma baixa intensidade de sinal por si só, a incorporação de vários iões gadolínio dentro da estrutura PB das nanopartículas proporciona uma maior intensidade de sinal (contraste positivo) 3,9. Além disso, a presença de vários iões gadolínio dentro da rede PB aumenta a densidade geral de rotação e a magnitude do paramagnetismo das nanoparticulas, o que perturba o campo magnético local na sua vizinhança, gerando assim contraste negativo pelo mecanismo de relaxação spin-spin. Assim, as nanopartículas contendo gadolínio funcionar tanto como um T (positivo) e T 2 (agentes de contraste negativo) 10,11.
Num subgrupo de pacientes com insuficiência renal, a administração de agentes de contraste à base de gadolínio tem sido associada ao desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica 8,12, 13. Esta observação levou a investigações sobre a utilização de iões paramagnéticos alternativos como agentes de contraste para MRI. Por conseguinte, o desenho versátil das nanopartículas está adaptado para incorporar os iões de manganês dentro da rede PB. Semelhante a quelatos de gadolínio, manganês quelatos também são paramagnéticos e são normalmente utilizados para proporcionar a intensidade de sinal positivo em MRI 7,14. Tal como acontece com gadolínicos PB PN, os contendo manganês PB PN também funcionar como um T (positivo) e T 2, os agentes de contraste (negativo).
Para incorporar capacidades de imagem de fluorescência, as nanopartículas "núcleos" são revestidas com um invólucro "biofuncional" consistindo de avidina marcada fluorescentemente-glicoproteína (Figura 1). Avidina não apenas permite imagens de fluorescência, mas também serve como uma plataforma de acoplagem para ligandos biotinilados que alvejam as células e tecidos específicos. A ligação de avidina-biotina é uma das mais fortes conhecidas, ligações não-covalentes caracterizados por afinidade de ligação extremamente forte entre a avidina e a biotina 15. A fixação de ligantes bioestanhados ao revestida com avidina PB NPs confere capacidades de segmentação moleculares para os PN PB.
A motivação para a prossecução de fluorescência e imagem latente usando PB NPs é porque estas modalidades de imagem possuem características complementares. Imagens de fluorescência é uma das técnicas de imagem molecular ópticos mais utilizado, e permite a visualização simultânea de vários objetos em altas sensibilidades 1,16,17. Imagens de fluorescência é um cofre, modalidade não-invasivo, mas está associada a baixos profundidades de penetração e resoluções espaciais 1,3,16. Por outro lado, a RM gera uma alta temporaisd resolução espacial de forma não invasiva e sem a necessidade de radiação ionizante 1,3,16. No entanto MRI sofre de baixa sensibilidade. Portanto imagens de fluorescência e RM foram selecionados como as técnicas de imagem molecular, devido às suas características complementares de penetração em profundidade, sensibilidade e resolução espacial.
Este artigo apresenta o protocolo para a síntese e biofunctionalization das NPs PB, PB PN (GdPB), e contendo gadolínio PB PN (MnPB) 10,11 contendo manganês. Os seguintes métodos são descritos: 1) de medição de tamanho, carga, e estabilidade temporal das nanopartículas, 2) avaliação da citotoxicidade das nanopartículas, 3) de medição de relaxamentos MRI, e 4) a utilização de nanopartículas para fluorescência e ressonância magnética molecular de uma população de células alvo in vitro. Estes resultados demonstram o potencial dos PN para utilização como agentes de imagem moleculares multimodais, in vivo.
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Protocol
1. Síntese de PB NPs, GdPB e MnPB
Síntese das nanopartículas (PB NPS GdPB, ou MnPB) é conseguido através de um esquema de síntese de um pote, executando as etapas descritas a seguir:
- Preparar solução 'A' contendo 5 ml de 5 mM de hexacianoferrato de potássio (II) em água desionizada (DI) de água. Dependendo do tipo de nanopartículas ser sintetizado - PB NPs, GdPB, ou MnPB, preparar a solução 'B' como se segue:
- Para PB PN: preparar 10 ml de uma solução contendo 2,5 mM de ferro (III), cloreto de água DI.
- Para GdPB PN: preparar 10 ml de uma solução contendo 2,5 mM de cada um de gadolínio (III) e nitrato de ferro (III), cloreto de água Dl
- Para MnPB PN: preparar 10 ml de uma solução contendo 2,5 mM de cada um de manganês (II) e cloreto de ferro (III), cloreto de água DI.
- Adicionar a solução 'B' para um balão de fundo redondo, e agita-se o conteúdo do balão à temperatura ambiente (RT) e1.000 rpm. Adicionar solução 'A' gota a gota para o round-bottom frasco contendo solução de 'B'. Controlar a taxa de fluxo para a adição de solução 'A' a 'B' por uma bomba peristáltica definido para dispensar aproximadamente 10 ml / h.
- Continuar a agitar a 1000 rpm à temperatura ambiente durante 30 minutos adicionais após a adição de solução 'A' a 'B' é completa. Pare de mexer e recolher a mistura.
- Transferir alíquotas da mistura para tubos de microcentrífuga para enxaguar as nanopartículas isentas de componentes que não reagiram. Adicionar NaCl 5 M (0,2 ml de NaCl a mistura de reacção / ml) a cada alíquota para ajudar na recolha de partículas por centrifugação.
- Centrifugar cada alíquota de nanopartículas durante pelo menos 10 min a 20.000 x g. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender cada pellet de nanopartículas em 1 ml de água DI através de ultra-sons utilizando um microtip (pulso de ultra-sons on / off = 1/1 sec, amplitude = 50%, duração =5 segundos, o poder sonicator rating = 125 W) para quebrar o sedimento.
- Repita os passos 1,4-1,6 pelo menos 3 × para assegurar que as nanopartículas são livres de componentes da reacção e os produtos secundários da reacção inicial. Após a centrifugação final, voltar a suspender as partículas em 1 ml de água Dl.
2. Biofunctionalization de PB NPs, GdPB e MnPB
Biofunctionalization das nanopartículas envolve o revestimento das nanopartículas "núcleos" com avidina e adição de ligandos biotinilados, conforme descrito abaixo:
- O revestimento das nanopartículas com Avidina fluorescente
O revestimento das nanopartículas com avidina fluorescente é conseguida utilizando a auto-montagem onde electrostático de carga positiva da avidina (pI ~ 10.5) é revestido sobre a nanopartículas carregadas negativamente como se segue 18:- Prepare suspensões dos PN PB, GdPB, ou MnPB em 1 ml de água DI. Filtre Alexa Fluor 488 marcado avidina (A488; reconstituída em água DI)através de um filtro de nylon de 0,2 um microcentrífuga a 14000 × g durante 10 min. Adicionar ≤0.2 mg avidina / mg nanopartículas. Juntar as filtrada de A488 separadamente às alíquotas de PB NPs, GdPB, ou MnPB.
- Contactar as nanopartículas com A488 durante 2-4 horas com agitação suave ou de rotação a 4 ° C. Proteja as amostras da luz usando papel alumínio.
NOTA: Este A488 rendimentos passo revestido PB PN (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), e MnPB (MnPB-A488).
- Penhora de Biotinylated Antibodies
A ligação de anticorpos biotinilados dirigidos para as nanopartículas revestidas com avidina é conseguido usando interacções avidina-biotina como se segue:- Prepare as suspensões dos avidina revestido nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, e MnPB-A488 em 1 ml de água DI. Filtro de anticorpo biotinilado (tal como é fornecido pelo fabricante) de microcentrífuga através de um filtro de nylon de 0,2 um a 14000 × g durante 10 min.
NOTA: Aqui, o presente estudo utiliza Biotinylated-anti-glial neurónio antigénio 2 (ANG2) que tem como alvo NG2 overexpressed dentro de células e tecidos do sistema nervoso central e biotinilado eotaxina-3 anti-humano (Eot3) que tem como alvo receptores sobre-expressos em linhas de células de eosinófilos ou eosinofílicos. - Adicionar cada alíquota filtrado do anticorpo biotinilado separadamente para as aliquotas das nanopartículas revestidas com avidina. Adicionar ≤0.05 mg nanopartículas de anticorpos / mg avidina-revestido biotinilado. Contactar as nanopartículas revestidas com avidina com os anticorpos biotinilados (Ang 2) ou Eot3 para 2-4 horas com agitação suave ou de rotação a 4 ° C. Proteja as amostras da luz usando papel alumínio.
NOTA: Este anticorpo rendimentos passo nanopartículas revestidas (por exemplo GdPB-A488-Eot3 e MnPB-A488-Ang2).
- Prepare as suspensões dos avidina revestido nanopartículas - PB-A488, GdPB-A488, e MnPB-A488 em 1 ml de água DI. Filtro de anticorpo biotinilado (tal como é fornecido pelo fabricante) de microcentrífuga através de um filtro de nylon de 0,2 um a 14000 × g durante 10 min.
3. Dimensionamento, Potencial Zeta, e Temporal Estabilidade das nanopartículas
A distribuição de tamanho, carga, e a estabilidade das nanopartículas são medidos usando dinâmicoespalhamento de luz (DLS) métodos conforme descrito abaixo:
- Dimensionamento das nanopartículas
O dimensionamento das nanopartículas é conseguido usando dispersão dinâmica de luz como se segue:- Adicionam-se 10 ul da amostra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 ul de água desionizada numa cuvete de plástico descartável.
NOTA: Este é um valor representativo para um sinal de DLS bom. - Tapar o cuvete e vortex para misturar bem. Coloque a cuvete num sistema utilizado para analisar o tamanho das partículas, a fim de medir o tamanho das nanopartículas. Realizar análise de tamanho de partícula em um ângulo de medição de 173 °.
- Adicionam-se 10 ul da amostra de nanopartículas (1 mg / ml) a 990 ul de água desionizada numa cuvete de plástico descartável.
- Potencial Zeta do Nanopartículas
Potencial Zeta de nanopartículas é medido usando análise de fase de dispersão de luz como se segue:- Adicionar 100 ul da amostra de nanopartículas (1 mg / ml) a 900 ul de água desionizada numa célula capilar de plástico descartável. Este valor é representativo para uma boa medição do potencial zeta.
- Coloque o capilary de células em um sistema utilizado para analisar o potencial zeta, a fim de medir o potencial zeta das nanopartículas utilizando parâmetros padrão a 25 ° C.
- Temporal Estabilidade do Nanopartículas
A estabilidade temporal das nanopartículas é medida usando dispersão dinâmica de luz como se segue:- Avaliar a estabilidade das nanopartículas por medição dos tamanhos das nanopartículas em água Dl, bem como meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) como descrito na secção 3.1.
- Repita as medições de tamanho em água Dl e DMEM uma vez / dia, durante um período de 5 dias.
4. A citotoxicidade das nanopartículas
A citotoxicidade das nanopartículas é medida usando um ensaio de proliferação celular XTT como se segue:
- Semente 10.000-15.000 células / poço de cada tipo de célula estudada (Neuro2A, BSG D10, EoL-1, e OE21) em uma placa de 96 poços. Certifique-se de que o volume total de células inoculadas não é um eXceed 0,2 ml / poço. Incubar as células semeadas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Entrando em contato com nanopartículas com as células:
- Incubar as células com concentrações variáveis de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte a Tabela 1 como uma tabela representativa que descreve as quantidades de nanopartículas (em 50 ul) foi adicionado às células após a remoção de 50 mL de meio / poço.
- Para ter em conta qualquer absorvância de interferência das nanopartículas dentro do ensaio, adicionar um espaço em branco que consiste em uma concentração adequada de nanopartículas (0-0,5 mg / ml; em equivalência às quantidades adicionadas às células) para meio sem células.
- Incubar as células com nanopartículas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. Meios de Aspirar cada cavidade e lavar com tampão de coloração composta por 5% de soro fetal bovino (FBS) em solução tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 100 ul de meio sem vermelho de fenol e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2para 16-18 hr.
- Incubar as células com concentrações variáveis de nanopartículas (0,01-0,5 mg / ml). Consulte a Tabela 1 como uma tabela representativa que descreve as quantidades de nanopartículas (em 50 ul) foi adicionado às células após a remoção de 50 mL de meio / poço.
- Preparar a solução de trabalho de XTT celular Ensaio de Proliferação por mistura dos componentes do kit de reagente XTT (XTT e Activator) conforme as especificações do fabricante. Aspirar a mídia a partir dos poços e adicionar 100 ml de RPMI (RPMI w / o vermelho de fenol + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) ou meio apropriado para o tipo de célula estudado. Adicionar 50 ul de solução de trabalho de XTT a cada poço e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2-2,5 h.
- Medir a absorvância a 490 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm para corrigir impressões digitais ou manchas. Calcule a absorção corrigido para cada poço (A 490 -A 630) e, em média, as leituras de repetições.
- Subtraia as leituras em branco de cada valor bem para calcular os valores de absorção corrigidos finais. Calcula-se a percentagem de sobrevivência para cada amostra através da normalização da absorvância final corrigido para a de células não tratadas, sem nanoparticulas. Plot survival percentagem em função da concentração de nanopartículas.
5. MRI relaxividades dos PN PB, GdPB e MnPB
Relaxividade RM é medida usando T 1 - T 2 e sequências ponderadas por preparação de um "fantasma" MRI utilizando uma placa de 96 poços contendo nanopartículas, tal como descrito abaixo:
- Preparação Fantasma
- Prepara-se uma placa de 96 poços com cada poço contendo nanopartículas 100 ul (PB NPs, ou GdPB MnPB) na concentração adequada. Começando com uma concentração de 0,4 mM para cada tipo de nanopartículas, diluir em série as nanopartículas 2 × utilizando água desionizada até uma concentração de 2,4 x 10 -5 M foi alcançada (o que requer 14 e diluições de 15 poços).
- Adicionar 100 ul de solução de agarose fundida a 1% em água desionizada a cada poço e misture bem. Deixar o gel solidificar a 4 ° C durante 12 h.
NOTA: Isso produz um fantasma contendo diluições em série deas nanopartículas em agarose solidificada. - Coloque o fantasma em um 3 ímã clínico horizontal T sob um bloco sólido de 2% agar (150 cm 3). Prenda o fantasma e bloco de agar no centro de um 8-channel HD bobina cérebro. Medir tempos de relaxação utilizando 0,5 milímetros cortes coronais de espessura na meia altura da placa de 96 poços 11.
- T 1 - e T 2 ponderadas Sequências
Use as seguintes configurações representativas para a aquisição das seqüências no ímã clínica.
NOTA: Estes valores são otimizados para as nanopartículas utilizadas no presente estudo:- Adquirir T 1 imagens ponderadas (T1W) Senhor usando o seguinte recuperação fluido inversão atenuada (DOM) sequência: Echo trem (ET) = 8, tempo de repetição (TR) = 2.300 ms, tempo de eco (TE) = 24,4 ms, tamanho Matrix = 512 x 224, Campo de visão (FOV) = 16 x 16 cm2.
- Adquirir T 2 imagens ponderadas (T2W) Senhor com a seguinte Relaxa rápidoção rápida sequência spin-echo (FRFSE): ET = 21; TR = 3500 mseg; TE = 104 ms; Tamanho da matriz = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm2.
- Adquira imagens T1W e T2W MR em 127 MHz (3 T) com os seguintes tempos de inversão: 50, 177, 432, 942, 1.961 e 4.000 ms.
- Medindo os relaxamentos de ressonância magnética
- Depois de adquirir T1W e em T2 imagens usando as sequências descritas na seção 5.2, medir a intensidade de sinal para cada poço usando ImageJ, doravante designada como a região de interesse (ROI), selecionando cada ROI utilizando o botão colheita oval localizado na barra de ferramentas principal, em seguida, selecionando Analisar> Medida.
NOTA: Um pop-up deve exibir a intensidade do sinal média de cada ROI na coluna denominada "Média". - Para cada ROI, plotar a intensidade do sinal medida contra o seu tempo de inversão específica. Se necessário, pontos invertidos (leituras) que geram uma "bolha" inicial ou discrepantes no início da trama (inversão menorvezes).
NOTA: Estas leituras são gerados em períodos de baixa inversão porque MRI mede o valor magnitude ou absoluto das imagens, em vez de seu valor real (negativo), que precisa ser contabilizada / corrigido para 19. - Prepare um ajuste exponencial para cada lote de intensidade de sinal para o ROI (SI) vs. tempos de inversão (T I), conforme descrito no item 5.2. Lote T I no eixo-x, SI no eixo-y; ɑ e Δ são constantes determinadas por regressão, e T 1, T 2 é a variável a ser resolvido:
em que t = T 1, T 2. - Resolver para T 1, T 2, utilizando a equação acima e traçar o inverso dos valores calculados (1 / T 1 e 1 / T 2) contra as concentrações das nanopartículas utilizadas em cada ROI.
- Calcular o declive do gráfico linear queproduz os relaxamentos de r 1 e r 2.
NOTA: A secção do protocolo seguinte descreve a aplicação das nanoparticulas de marcação fluorescente e a geração de contraste para IRM, em células alvo.
- Depois de adquirir T1W e em T2 imagens usando as sequências descritas na seção 5.2, medir a intensidade de sinal para cada poço usando ImageJ, doravante designada como a região de interesse (ROI), selecionando cada ROI utilizando o botão colheita oval localizado na barra de ferramentas principal, em seguida, selecionando Analisar> Medida.
6. etiquetagem fluorescente de células alvo Usando o Nanopartículas - Microscopia Confocal
NOTA: As nanopartículas (PB NPs, GdPB, e MnPB) pode ser utilizado para marcar por fluorescência de uma população de células alvo (monitorizadas por microscopia confocal) como se segue:
- Síntese do Nanopartículas fluorescente
- Sintetizar GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 para marcação fluorescente de uma população de células-alvo, seguindo os passos detalhados nas seções 1 e 2.
- Preparação de células por fluorescência Segmentação
- Brasão não. 1,5 vidros de cobertura por micro mergulhando-os numa solução de 0.002% de poli (L-lisina) bromidrato durante 90 min. Remover os óculos de cobertura da solução e deixe secar por 24 horas.
- Sementes das células (por exemplo, EoL-1, BSG D10, SUDIPG1) sobre os vidros de cobertura revestidas colocados numa placa de 6 poços e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante pelo menos 16 horas. Lavar as células com uma solução a 1 × PBS e (opcional) fixar com 10% de formaldeído em solução tampão neutro durante 15 min. Células mancha com 5 uM de corante célula-permeante vermelho-laranja em PBS a 37 ° C durante 30 min. Subsequentemente, lavar as células com PBS.
- > Labeling fluorescentes de células-alvo
- Adicionar 1% de albumina de soro bovino (BSA; em água Dl) para as células para minimizar a ligação não específica sobre as células, e incuba-se a 37 ° C durante 1 h.
- Incubar as células com as nanopartículas em BSA a 1% durante 1 h. Para EoL-1: incubar com 0,2 mg / ml ou GdPB-A488-A488-GdPB Eot3; Para BSG D10 e SUDIPG1: incubar com 0,2 mg / ml MnPB-A488 ou MnPB-A488-ANG2. Lavar as células com PBS 3 × remover unbounanopartículas nd.
- Cuidadosamente, inverta a tampa de vidro (contendo células e nanopartículas) numa lâmina de microscópio, garantindo que não há bolhas de ar aprisionadas. Selar a borda entre a tampa de vidro e lâmina de microscópio, aplicando cuidadosamente clara unha polonês. Imagem as células usando um microscópio de varredura a laser confocal.
7. etiquetagem fluorescente de células alvo Usando o Nanopartículas - Citometria de Fluxo
As nanopartículas (PB NPs, GdPB e MnPB) pode ser utilizado para rótulo fluorescente uma população de células alvo (monitorizada por citometria de fluxo) como se segue:
- Preparar suspensões de células a ser orientada em PBS. Para os estudos de culturas puras, as suspensões consistem de um único tipo de células (por exemplo, BSG D10); ressuspender um sedimento celular de células D10 BSG em PBS a 100.000 células / ml (10 ml total). Para os estudos de cultura mistas, as suspensões de composto de pelo menos dois tipos de células (por exemplo, EoL-1 e OE21); semelhante a D10 BSG, os sedimentos celulares ressuspender de EoL-1 e OE21 em PBS a 100.000 células / ml cada (10 mL no total).
- Prepare razões variáveis de EoL-1: OE21 1: 0 (2 ml EoL-1), 3: 1 (1,5 ml EoL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 mL de cada um de EoL-1 e OE21), 1: 3 (0,5 mL EoL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Bloquear as células (suspensões puros e mistos) a ser alvejado por as nanopartículas com 2 ml de BSA a 5% para minimizar a ligação não específica.
- Adicionar 1 ml (1 mg / ml) para as nanopartículas de células e incubar durante 1 h. Para BSG D10, incubar células com MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo controle), ou MnPB-A488-ANG2). Para as misturas de EoL-1 e OE21, incubar as misturas com uma quantidade fixa de GdPB-A488-Eot3.
- Lavar as células livres de nanopartículas não ligadas por fiação para baixo as amostras a 1000 x g durante 5 minutos, pelo menos, 3 × para remover as partículas não ligadas. Ressuspender as células em 1 ml de PBS e fixar com 10% de formaldeído em PBS. Stain células por incubação com 10 ug / ml7-Aminoactinomytcin D em PBS em gelo durante 30 min. Lavar com PBS, em seguida, analisar 10.000 células fechadas a partir de cada amostra utilizando um citómetro de fluxo.
8. Generating MRI Contrast em células-alvo Usando nanopartículas
As nanopartículas (PB NPs, GdPB e MnPB) pode ser usado para gerar contraste para IRM (em ambos os T 1 - T 2 e sequências ponderadas) de uma população de células alvo como se segue:
- Preparação Fantasma
- Cultivar células (por exemplo, BSG D10) em balões T75 até ~ 80% de confluência. Use médio e condições de crescimento adequado. Para BSG D10, crescer as células em DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Lavar as células livres do meio com 5 ml de PBS e bloquear as células com 5 ml de 1% de BSA em PBS durante 1 h para minimizar a ligação não específica. Adicionam-se 5 ml (0,5 mg / ml) para as nanopartículas de células. Para BSG D10, incubar as células com MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (anticorpo controle), e MnPB-A488-ANG2 durante 1 h.
- Lavar as células 3 x com 5 ml de PBS para remover as nanopartículas não ligados. Tripsinizar as células por incubação das células com 2 ml de tripsina a 0,25% EDTA 1 × solução durante 5 minutos a 37 ° C e 5% de CO 2 destacá-las a partir do frasco para a preparação fantasma. Adicione 8 ml de DMEM para saciar a tripsinização das células.
- Recolher as células por centrifugação a 1000 × g durante 5 min; Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de PBS e adicionar 1 ml de 10% de formaldeído em PBS, para fixar as células. Adicionar 100 uL de cada amostra a um poço separado de uma placa de 96 poços.
- Adicionar 100 ul de solução de agarose fundida a 1% em água desionizada a cada poço e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo. Deixar o gel solidificar a 4 ° C durante 12 h.
NOTA: Isso produz um fantasma contendo células com nanopartículas anexados em agarose solidificada. - Coloque o fantasma em um 3 ímã clínico horizontal T ao lado de um bloco sólido de 2% agar (150 cm
- T 1 - e T 2 ponderadas Sequências
Utilize as seguintes definições para a aquisição das sequências no ímã clínica MRI:- Adquira imagens T1W MR com a seguinte rotação seqüência eco: Echo trem (ET) = 1, tempo de repetição (TR) = 650 ms, tempo de eco (TE) = 11 ms, tamanho Matrix = 320 x 256, Campo de visão (FOV) = 10 x 10 cm2.
- Adquira imagens T2W MR utilizando a seguinte sequência FRFSE: ET = 28; TR = 3000 mseg; TE = 101 ms; Tamanho da matriz = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm2.
- Processamento pós-aquisição
- Para facilitar a leitura, converter as imagens originais em escala de cinza em uma imagem de escala de cores usando ImageJ: Selecione Imagem> Tipo> 8-Bit, para converter a imagem em escala de cinza.
- Calcular a intensidade normalizada para cada amostra após subtracção da contribuição de sinal a partir da solução de agarose.
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Representative Results
Usando o esquema de síntese de um pote, nanopartículas de PB PN (diâmetro médio de 78,8 nm, índice de polidispersão (PDI) = 0,230; calculado pelo instrumento de espalhamento de luz dinâmico), GdPB (diâmetro médio de 164,2 nm, PDI = 0,102), ou MnPB ( diâmetro médio de 122,4 nm, PDI = 0,124) que são monodispersas (como medido por DLS) pode ser sintetizado de forma consistente (Figura 2A). Os potenciais zeta medidos das partículas sintetizadas são menos do que -30 mV (Figura 2B), indicando estabilidade moderada das partículas com base nas suas cargas de superfície. As nanopartículas sintetizados exibem estabilidade temporal adequada ao longo de um período de 5 dias, como indicado pelos seus tamanhos consistentes (diâmetro hidrodinâmico; Figura 2C).
Quando co-incubados com células, as nanopartículas (PB NPs, GdPB, e MnPB) exibiu citotoxicidade desprezável para as células abaixo certos limiares de concentração (Figura 3). Cytotoxicity stufieiras de NPs PB sobre células Neuro2A indicam citotoxicidade desprezável quando co-incubados com Neuro2A em concentrações mais baixas do que 0,67 x 10 -6 mg / célula (Figura 3A). Estudos de citotoxicidade realizados por co-incubação de células com GdPB eol-1 e OE21 indicam citotoxicidade desprezável de GdPB em ambos os tipos de células a concentrações mais baixas do que 0,25 x 10 -6 mg / célula (Figura 3B). Semelhante, estudos de citotoxicidade indicam citotoxicidade desprezável de MnPB quando co-incubados com BSG D10 em concentrações mais baixas do que 0,25 x 10 -6 mg / célula (Figura 3C). A citotoxicidade adicional de MnPB GdPB e pode ser atribuída à presença de iões adicionais (Mn 2+ para MnPB e Gd 3+ para GdPB) no interior do núcleo de nanopartículas.
Relaxação estudos de ressonância magnética foram realizados utilizando fantasmas composta de várias concentrações de PB NPs, GdPB e MnPB. Os estudos indicam a utilidade da nanopartigos como agentes de contraste de MRI em ambos T1W e sequências em T2 (Figura 4). Isto é demonstrado pelo aumento da hipersinais (contraste positivo) em T 1 e sequências ponderadas hypointensities aumento de contraste negativo) (T 2 em sequências ponderadas com concentrações crescentes tanto de GdPB (Figura 4A) e MnPB (Figura 4B). Com base nas medições de relaxação, MnPB é um agente moderada T 1 e T um forte agente 2 enquanto GdPB é um forte agente de T 1 e T 2, um agente moderada (Figura 4C). Os relaxamentos medidos GdPB e MnPB comparam favoravelmente com as de agentes de contraste clinicamente aprovados 10, 11.
As NPs bioativa de PB são capazes de marcar por fluorescência de uma população de células-alvo in vitro (Figura 5). Quando ambos bioativa com avidina fluorescente (A488) e biotinilado e anti-humanootaxin 3-anticorpo (Eot3), GdPB fluorescente pode visar uma população de células EoL-1 (Figura 5B). Controlo sem nanopartículas GdPB Eot3 exibem ligação desprezável (Figura 5A) Do mesmo modo, quando é GdPB bioativa com tanto avidina fluorescente (A488) e biotinilado anti-glial neuronal antigénio-2 (ANG2), as nanopartículas podem fluorescentemente alvo populações de BSG e D10 neuroesferas SUDIPG1 (Figuras 5D e F), enquanto que as nanopartículas de controlo sem o anticorpo alvo não são capazes de marcar as células por fluorescência (Figuras 5C e E). Assim, a segmentação eficiente e marcação fluorescente requerem a presença de tanto a avidina fluorescente e o ligando alvo biotinilado.
A capacidade das nanopartículas bioativa de fluorescência para rotular uma população de células, tal como quantificado por citometria de fluxo, confirma a necessidade de ambos fluorescente avidina e biotinaylated ligando-alvo para marcação fluorescente eficaz (Figura 6). Células D10 BSG contactado com MnPB contendo ambos A488 e ANG2 (MnPB-A488-ANG2) apresentam aumento de fluorescência (Figura 6A) e a percentagem de células marcadas com fluorescência (Figura 6B), quando comparado com o controlo nanopartículas fluorescentes com um anticorpo de controlo (MnPB-A488 -abc) e sem um anticorpo (MnPB-A488). As nanopartículas bioativa são capazes de atingir fluorescentemente uma sub-população específica de células dentro de uma mistura de células (Figura 6C). Isto é demonstrado como quantidades fixas de EoL-1-direccionamento, GdPB fluorescente (GdPB-A488-Eot3) são postos em contacto com células alvo (EOL-1) e células de controlo (OE21). Aumentos de fluorescência como proporções de EoL-1 são aumentadas (aumento da intensidade do sinal Alexa Fluor 488; Figura 6C) dentro da mistura. Isto indica a especificidade das nanopartículas para esta sub-população de células dentro do cemistura ll.
Os PB NPs bioativa de aumentar o contraste MRI em uma população de células-alvo (Figura 7). Quando as células D10 BSG são contatados com concentrações equivalentes de experimental (MnPB-A488-ANG2) e controle (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanopartículas, fantasmas apresentam aumento hiperintensidade para células em contacto com MnPB-A488-ANG2 comparados aos controles sequências T1W e aumento hipointensidade para células em contacto com MnPB-A488-ANG2 comparação com os controlos nas seqüências em T2 (Figura 7a). A análise das imagens das ROIs dentro do fantasma confirmam esta tendência onde as células em contacto com partículas experimentais apresentam maior intensidade significativamente quando comparados aos controles em seqüências T1W e intensidade diminuiu significativamente em relação aos controlos nas seqüências em T2 (Figura 7b).
Figura 1: O projeto core-shell das NPs PB. O núcleo é constituído por uma estrutura de PB, o qual é constituído por ligandos de cianeto lineares num Fe II - CN -. Fe III ligação Estas ligações permitir PB PN para incorporar catiões dentro da sua rede tridimensional como um meio de taxas de compensação 5. Esta capacidade de ligação de cação azul da Prússia é utilizada para carregar gadolínio e manganês dentro da rede, o que proporciona um contraste de ressonância magnética. O núcleo é revestido com um invólucro constituído por avidina biofuncional fluorescente para permitir a imagiologia por fluorescência e ligandos biotinilados para permitir direccionamento molecular.
Figura 2:. Tamanho, carga e estabilidade das NPs PB (A) distribuições de tamanho de PB (azul), GdPB (vermelho) e MnPB (preto) nanopartículas medido por DLS. (B (C) A estabilidade temporal de PB (azul), GdPB nanopartículas em água (vermelho) e MnPB (preto) (sólido) e DMEM (pontilhada) por cinco dias após a sua síntese, medido por DLS.
Figura 3:. A citotoxicidade das NPs PB estudos de citotoxicidade, utilizando várias concentrações de (A) PB NPs adicionado a um número fixo de células Neuro2A (B) GdPB adicionado a uma quantidade fixa de EoL-1 e OE-21 e células, respectivamente ( C) MnPB adicionado a um número fixo de células D10 BSG. Taxa de sobrevivência das células foi calculada às 24 e 48 h. Reproduzido com permissão de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society; Ref 10 com a permissão da Dove Press Ltd; e Ref 21 com a permissão da The Royal Society of Chemistry.
Figura 4: As imagens de RM e relaxamentos de GdPB e MnPB em 3 T. hiperintensidade em T 1 ponderadas sequências e hipointensidade em T 2 ponderadas seqüências de (A) GdPB e (B) MnPB como uma função da concentração das nanopartículas. (C) Tabulação dos relaxitivies de PB NPs, GdPB e MnPB medidos a 3 T. Reproduzido com permissão de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society.
Figura 5: A microscopia por fluorescência de células alvo utilizando os PB NPs bioativa, como medido por microscopia confocal de varrimento laser de imagens de Eol-1 células tratadas com (A) controlo (GdPB-A488) e (B) experimental (GdPB-A488-Eot3. nanopartículas).Imagens de neurospheres BSG tratados com controle (C) (MnPB-A488) e (D) experimentais (MnPB-A488-Ang2) nanopartículas. Imagens de neurospheres SUDIPG1 tratados com (E) controle (MnPB-A488) e (F) experimentais (MnPB-A488-Ang2) nanopartículas. Reproduzido com permissão de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A microscopia por fluorescência de células-alvo utilizar o PB NPs bioativa, medida por citometria de fluxo (A) A citometria de fluxo histogramas de células D10 BSG tratados com experimental (MnPB-A488-ANG2) e controle (MnPB-A488-ABC e MnPB. -A488 nanopartículas). (B) Percentage de células D10 BSG a partir do painel (A) que são fluorescentes (% do Alexa-Fluor positivo) no tratamento com experimental (MnPB-A488-ANG2) e controle (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanopartículas, ** p <0,05. (C) A citometria de fluxo gráficos de dispersão de uma mistura de células contendo quantidades variáveis de EoL-1 (células-alvo) e OE21 (células de controlo) alvo das nanopartículas (GdPB-A488-Eot3). Reproduzido com permissão de Ref 11, copyright 2014 American Chemical Society e da referência 10, com a permissão de Dove Press Ltd. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7:. Aumentar contraste MRI em células-alvo utilizar o PB NPs bioativa de (A) T 1 ponderadas e T <sub> 2 ponderadas realce de contraste em fantasmas composta por um número fixo de células D10 BSG tratados com experimental (MnPB-A488-ANG2) e controle (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanopartículas. (B) a intensidade do sinal normalizado para as células tratadas com BSG D10 experimental (MnPB-A488-ANG2) e controle (MnPB-A488-ABC e MnPB-A488) nanopartículas, ** p <0,05. Reproduzido de Ref 10 com a permissão da Dove Press Ltd.
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Discussion
Este artigo apresentou os métodos para a síntese de uma nova classe de agentes de imagem multimodais, moleculares baseados em nanopartículas bioativa de azul da Prússia. As modalidades de imagem molecular incorporados nas nanopartículas são imagens de fluorescência e ressonância magnética molecular, devido às suas características complementares. As nanopartículas azuis cobalto bioativa de ter um design core-shell. As principais etapas da síntese destas nanopartículas são: 1) one-pot síntese, que dá os núcleos que são compostos por nanopartículas azul da Prússia (PB PN), prussianos nanopartículas azuis contendo gadolínio (GdPB), ou azul da Prússia contendo manganês nanopartículas (MnPB), 2) biofunctionalization das nanopartículas utilizando avidina fluorescente por auto-montagem electrostático, e 3) ligação dos ligandos biotinilados (anticorpos) para as nanopartículas utilizando interacções avidina-biotina robustos. Tanto a avidina fluorescente e os ligandos biotinilados constituem o BIOFshell unctional das nanopartículas.
A síntese de um só recipiente produz PB NPs, ou MnPB GdPB, que funcionam tanto como T 1 e T 2, os agentes de contraste para IRM. As quantidades dos iões paramagnéticos (gadolínio ou manganês) carregados no núcleo de nanopartículas pode ser alterada (aumentada ou diminuída) por variação das quantidades dos sais contendo iões paramagnéticos (gadolínio (III) e nitrato de manganês (II), cloreto) na síntese de um só recipiente (Passo 1.2). Isto resulta em alteração (aumento ou diminuição) a intensidade do sinal de RM. No entanto, estas modificações para o esquema de síntese pode resultar em instabilidade, nanopartículas agregados. Para atenuar os problemas associados com agregação, a síntese de um só recipiente podem ser modificados para incorporar os agentes de controlo de tamanho, tais como citrato de nivelamento durante a síntese de 20.
Biofunctionalization dos núcleos de nanopartículas é conseguido através de automontagem eletrostática com avidina fluorescente, que enables de imagens por fluorescência. Auto-montagem electrostática requer cargas opostas sobre a superfície das nanopartículas e o polímero de revestimento (neste artigo, avidina fluorescente). Para alterar a funcionalidade da superfície das nanopartículas, avidina podem ser substituídos por polímeros com carga positiva (por exemplo, polilisina ou um grupo amina contendo polietileno glicol) durante a síntese. No entanto, as proporções relativas das nanopartículas e polímero de revestimento terão de ser optimizados para manter tamanho das nanopartículas e a estabilidade e para evitar a agregação.
A adição dos anticorpos biotinilados para a nanopartículas revestidas com avidina confere capacidades de segmentação moleculares para as nanopartículas à base de PB. Este passo é baseado na interacção forte entre avidina e biotina (constante de dissociação em equilíbrio, Kd ~ 10 -15). Tal como acontece com os passos anteriores, as proporções relativas das nanopartículas revestidas com avidina e ligandos biotinilados precisa ser optimized de modo a impedir a ligação biotinilado de ligação simultaneamente dois nanopartículas revestidas com avidina, resultando em agregação de nanopartículas. Para direccionamento molecular, os anticorpos podem ser substituídos por outros ligandos alvo tais como fragmentos de anticorpos (Fab), fragmento variável de cadeia única (scFv), péptidos, ou aptâmeros.
As principais vantagens deste método para a síntese de nanopartículas bioativa como multimodal, agentes de imagem molecular são: 1) facile one-pot (1 etapa) síntese dos núcleos de nanopartículas, e 2) passos contatar seqüencial (self-assembly eletrostática e avidina interações biotina) para revestir o núcleo de nanopartículas com uma concha biofuncional. Outras vantagens das nanopartículas incluem o facto de que o azul da Prússia (vendido como Radiogardase) é já aprovados pela FDA para uso humano e que as nanopartículas que resultado do esquema de síntese de um só recipiente podem ser utilizados como um agente de contraste para IRM, tanto em T 1 ( positivo) e T 2 </ Sub> sequências ponderadas (negativos), que não é facilmente alcançado através de outros agentes de contraste ou plataformas de nanopartículas sem esquemas de síntese complicados ou produtos químicos especializados para síntese dos agentes de contraste. Uma limitação da técnica é que a síntese pode levar a nanoparticulas polidispersos com agregados se as proporções relativas dos reagentes na síntese tanto do núcleo e de revestimento de nanopartículas concha biofuncional passos não são rigorosamente optimizado para os reagentes utilizados nestes passos particulares. Por exemplo, as proporções relativas para revestir os núcleos de nanopartículas com avidina não pode ser estendida para revestir as nanopartículas com polilisina sem estudos de optimização anteriores.
Depois de dominar a técnica para a síntese de nanopartículas azuis cobalto bioativa descritos aqui, este design versátil pode ser modificada para estudos de imagem molecular in vivo. Isto irá exigir PEGuilação das nanopartículas para baixo imunogenicity e tempos de circulação in vivo mais prolongada. Semelhante à concepção descrita aqui, os PN PB pode ser bioativa com anticorpos antes da administração in vivo. Outros estudos incluem a utilização das NPs bioativa de PB para aplicações in vivo theranostic (diagnóstico terapia simultânea +). Os estudos investigando o uso de nanopartículas azuis cobalto para a terapia fototérmica (com base em suas características de absorbância em comprimentos de onda infravermelho próximo) estão em andamento 21.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
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