Summary
هنا، نقدم بروتوكول لافتعال السقالات electrospun ألياف نانوية مع منظمة على مراحل من الألياف واستكشاف تطبيقاتها في تنظيم التشكل خلية / التوجه. التدرجات فيما يتعلق الخواص الفيزيائية والكيميائية للالسقالات ألياف نانوية تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الطب الحيوي.
Introduction
ألياف النانو هي أداة شعبية لهندسة الأنسجة بسبب قدرتها على تقليد المصفوفة خارج الخلية في هيكلها والحجم النسبي 1. ومع ذلك، بعض واجهات الأنسجة الأم، مثل موقع الإدراج وتر إلى العظم، وتحتوي على ألياف الكولاجين، والتي تظهر على الهيكل التنظيمي المتغير الذي يزيد في محاذاة نحو وتر والنقصان في الموقع العظام 2-5. لذلك، على تجديد الأنسجة فعالة هناك حاجة الى افتعال السقالة التي يمكن أن تحاكي بشكل فعال هذا التدرج الهيكلي.
بحث في السابق، كان هناك أجريت على تغييرات تدريجية في تكوين الألياف، وتحديدا، المحتوى المعدني 6. ومع ذلك، وإعادة العنصر الهيكلي للأنسجة الضامة لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. وتناولت دراسة سابقة التدرجات المورفولوجية من خلال دراسة تأثير السيليكا سطح كثافة الجسيمات على انتشار الخلايا بانية العظم قبي الفئران وجدت في إنفرحد ذاتها العلاقة بين كثافة الجسيمات السيليكا وتكاثر الخلايا 7. ولكن التغييرات الشكلية التي تتوسط تكاثر الخلايا في الأعمال السابقة كانت في معظمها ذات الصلة إلى السطح خشونة تفتقر إلى القدرة في محاكاة التغييرات التنظيمية الألياف 7،8. حاولت إحدى الدراسات الأخيرة إلى افتعال سقالة تحاكي فريدة من نوعها توجهات ألياف الكولاجين باستخدام جامع رواية للغزل كهربائي 9. بينما نجحت هذه الدراسة في إنتاج سقالة مع ألياف كلا الانحياز وعشوائية، فإنه فشل في محاكاة التغيرات التدريجية عرضت في أنسجة الأم. أيضا، في إنتاج مكونات منفصلة، مع تغيير فوري من الانحياز إلى التوجه عشوائي، وخصائص النشاط الحيوي لهذه سقالة انخفضت بشكل ملحوظ. لم يكن هناك عمل سابق قادرة على إنتاج السقالات ألياف نانوية قابلة للتطبيق مع تدرجات المستمرة في توجهات الألياف من الانحياز وعشوائي. وقد أظهرت دراستنا الأخيرة الترفيه الناجح السقالات ألياف نانويةمع التدرج في المؤسسة الألياف التي يمكن أن يحتمل تقليد منظمة الكولاجين الأم في وتر إلى العظام الإدراج 10. ويهدف هذا العمل إلى تقديم البروتوكولات المستخدمة لإنتاج السقالات ألياف نانوية مع الهيكل الذي يشبه أن التنظيم الألياف في واجهة الأم الأنسجة وتر إلى العظام.
هياكل ألياف نانوية التدرج ويحتمل أن تكون التطبيقات عبر مجموعة متنوعة من المجالات بعيدة المدى. ركزنا على تطبيقات لهندسة الأنسجة للموقع الإدراج وتر إلى العظام عن طريق الجمع بين السقالات لدينا مع الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSCs) التي تستخدم بالفعل لتجديد الأنسجة على مختلف ركائز 11-14. وبالإضافة إلى ذلك، ADSCs متشابهة جدا في الطبيعة إلى الخلايا الجذعية نخاع العظام من حيث multipotency ومواردها وفيرة والتي يمكن حصادها باستخدام بسيط 15،16 إجراء شفط الدهون. بذر هذه الخلايا على السقالات على مراحل ألياف نانوية أخرى يعزز تيس بهممقاضاة التطبيقات الهندسية من خلال السماح لتوزيع رقابة من الخلايا التي يحتمل أن تفرق في الأنسجة المختلفة. بالإضافة إلى بذر الخلايا الجذعية، ألياف النانو يمكن أن تكون مغلفة مع الإشارة الجزيئات لتنظيم الاستجابة الخلوية. اقتران nanoencapsulation مع التدرج التنظيمي لهذه السقالات يسمح لدراسة السلوك الخلوي أو التصاميم والطلاء زرع الممكنة. يمكن تغليف جزيئات الوظيفية مثل العظام البروتين المخلق 2 (BMP2)، وهو ما ثبت للحث على بناء العظم التمايز 15،16، تزيد من تعزيز تطبيقات هندسة الأنسجة من هذه السقالات 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحل
- يعد حل من بولي (ε-caprolactone) (PCL) (M ث = 80،000 جم / مول) في تركيز تقريبي من 100 ملغ / مل. حل PCL في خليط من ثنائي كلورو ميثان (DCM) وN، N-dimethlyformamide (DMF) بنسبة 4: 1 (ت / ت) مع تركيز 10٪ (ث / ت).
- وضع الحل في أنبوب زجاجي 20 مل لخلط. وضع أنبوب زجاجي في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة، أو حتى الحل هو شفافة.
2. جهاز إعداد
- إضافة محلول PCL أعدت في حقنة 5 مل مع إبرة حادة 21 مقياس المرفقة.
- ضع ضخ حقنة في موقف غزل كهربائي العمودي، وفقا لشكل 1.
- استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الفجوة جامع مع فضاء مفتوح 2 سم × 5 سم للألياف الركيزة الانحياز. ضع جامع 12 سم من رأس الإبرة.
- توصيل الجهد العالي التيار المباشر (DC) إمدادات الطاقة إلىالمطحون إبرة وجامع. تأكد من أن جامع يرتكز بشكل فردي مع أي اتصال مع غيرها من المعدات المخبرية.
3. غزل كهربائي
- يتم استبدال مجموعة ضخ حقنة إلى 1.50 مل / ساعة، حتى قطرات تشكيل في طرف الإبرة فورا عند إزالتها. ثم، تعيين معدل تدفق إلى 0.50 مل / ساعة.
- تحويل المشغل الجهد إلى 12 كيلو فولت.
- Electrospin حتى الألياف الانحياز أحادى المحور تغطي تماما الفجوة على جامع.
- تطبيق الغراء على حواف لوحة زجاجية صغيرة ونقل الألياف من جامع الفجوة إلى لوحة زجاج. وضع لوحة زجاجية على رأس قطعة من رقائق الألومنيوم الذي يحتوي على نفس حجم لوحة من الزجاج والارض.
- ضع جامع حقنة الثاني وفقا لالشكل 3.
- إرفاق قناع من البلاستيك لضخ حقنة الثانية وضعه 2 مم فوق جامع.
- إضافة الكومارين 6 في 1٪ (وزن / وزن) إلى PCL حل إذا نانoencapsulation هو desired- وتخلط حتى الحل هو شفافة.
- تحميل PCL أو PCL / الكومارين 6 الحل في إبرة 5 مل مع إبرة حادة 21 قياس. ضبط مضخة عمودية إلى 0.50 مل / ساعة والأفقي لسحب في 9 مل / ساعة أو في سرعة التقريبية من 1 مم / دقيقة.
- انتقلت Electrospin حتى القناع تماما تقريبا قبالة جامع، ولكن مع منطقة حافة تزال تحت القناع.
4. الألياف توصيف
- مكان العينات مع الوجهين شريط موصل إلى مسمار معدني ومعطف مع البلاتين لمدة 40 ثانية باستخدام المغطي تفل في 40 مللي أمبير.
- فحص الألياف من خلال المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وفقا لدراساتنا السابقة 17،18.
- جمع الصور في الجهد المتسارع لل15 كيلو فولت.
- أداء سريع تحويل فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) التحليل على عينة من الألياف منفصلة لقياس محاذاة الألياف. معلومات مفصلة على قياس محاذاة الألياف التي كتبها الاتحاد الفرنسي للتنس يمكن أن يشير رس دراسات سابقة 19،20.
5. الخلايا الجذعية البذر.
- تعقيم العينات الألياف عن طريق نقع في محلول الإيثانول 70٪ لمدة 2 ساعة. ثم يغسل الألياف مع الماء المقطر لإزالة أي ملوثات.
- الحصول ADSCs البشرية وخلايا الثقافة في 25 سم 2 قارورة عند 37 درجة مئوية في جو من 95٪ الهواء / 5٪ CO 2. تغيير مستنبت خلية كل يوم 10.
- يعرض للتريبسين الخلايا وحساب عدد الخلايا. على وجه التحديد، وإزالة جميع مستنبت من قارورة زراعة الخلايا وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين. ثم يضاف 1 م لتر من محلول 0.25٪ التربسين-EDTA (ما قبل الحار في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية) لتغطية أحادي الطبقة الخلية واحتضان القارورة في الحاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-3 دقائق. إضافة 4 مل مستنبت وتغسل جميع الخلايا من السطح قبل pipetting المتوسطة في جميع أنحاء السطح. عشر الطرد المركزي تعليق خلية وإعادة تفريقالبريد بيليه خلية في المتوسط الثقافة. عدد الخلايا عبر عدادة الكريات. البذور حوالي 1 × 10 4 الخلايا إلى سقالة ألياف نانوية وضعها في طبق ğ ثقافة 35 ملم واحتضان لمدة 3 و 7 أيام.
- خلايا وصمة عار باستخدام ثنائي الأسيتات فلوريسئين (5 ملغ / مل في الأسيتون) (FDA) ثم صورة العينات باستخدام المجهر الفلورسنت. على وجه التحديد، إضافة 100 ميكرولتر من حل FDA إلى الطبق الثقافة واحتضان لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات قبل التصوير الفلورسنت. تحليل التوجه خلية باستخدام برنامج حصيرة-مختبر مخصص بناء على دراساتنا السابقة (10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، تم تشكيل حصيرة الألياف مع التدرج التنظيمي. ويبين الشكل 3 صور SEM التي اتخذت في مواقع مختلفة على منصة الاعدام ألياف نانوية. نوعيا، فإنه يمكن تحديد أن هناك تطور من الألياف الانحياز أحادى المحور في 0 مم (الشكل 3A) إلى الألياف متنوعة عشوائية في 6 ملم (الشكل 3D). الاتحاد الفرنسي للتنس يعطي قيمة الكمية إلى محاذاة الألياف، تفاصيل عن العمليات الكمية هي مفصلة هنا 19. الألياف في 0 مم المعرض والاتحاد الفرنسي للتنس التي تشير إلى محاذاة الألياف، وعند 6 مم نمط الاتحاد الفرنسي للتنس يدل على التوجه عشوائي. هناك تطور واضح في الصور SEM (الشكل 3) من منظمة الألياف الانحياز إلى ترسب ألياف عشوائي على نحو متزايد (الشكل 3B - C).
خضع ADSCs تغيرات شكلية تقوم على موقعها في سقالة ألياف نانوية الشكل 4 (الشكل 4A - D) و 7 أيام (الشكل 4E - H). تم تقييم توزيع زاوية الخلايا الجذعية كميا باستخدام برنامج MATLAB مخصصة وتحليلها باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف على مسافات مختلفة الشكل يظهر 4I توزيع زاوية الخلية في مواقع مختلفة. عند 0 ملم، أو منطقة من الألياف الانحياز، ظهرت 70٪ من الخلايا في غضون 20 درجة من محور ألياف نانوية تلفيق. في المقابل، المصنف في ADSCs على أجزاء عشوائية من السقالات الألياف تفتقر إلى هذا الهيكل التنظيمي، مع 20٪ فقط من الخلايا التي تظهر في غضون 20 درجة. وأخيرا، وتشكيل التدرج الكيميائية باستخدام الكومارين 6 - تمت دراسة الألياف PCL تحميلها باستخدام المجهر مضان. وأكد التدرج الكيميائية نوعيا باستخدام صورة المجهري (الشكل 5A). وتؤكد صورة كيماوية زيادةتركيز كال عبر السقالة التي أظهرتها الكثافة المتزايدة باطراد للصورة الفلورسنت. الرسم البياني للكثافة الفلورسنت (صورة J) (الشكل 5B) يؤكد التدرج من تركيز المواد الكيميائية التي كتبها اظهار النمو الخطي عبر منصة الاعدام.
الشكل 1: يبين التخطيطي من الإعداد التجريبية لإعداد الألياف الركيزة الانحياز أحادى المحور.
الشكل 2: (A) معارض وضع ضخ حقنة الثانية لتصنيع السقالة التدرج. (B) الموضع من القناع فوق جامع. وقد طبع هذا الرقم من [10] Macromol. Biosci.، 12 عاما، شيه، J.، ما، B.، مايكل، PL & شولر، FD فابريالموجبة من ألياف نانوية السقالات مع التدريجات في منظمة الألياف والتطبيقات المحتملة. 1336-1341، حقوق الطبع والنشر 2012، بإذن من وايلي-VCH.
الشكل 3: صور SEM من سقالة ألياف نانوية PCL على مراحل عند 0 ملم (A)، 2 مم (B)، 4 ملم (C)، و 6 ملم (D). الصور الثانوية فورييه أنماط نقل سريع (الاتحاد الفرنسي للتنس). نموذج عند (A) هو أن من الألياف الانحياز، (D) إلى ترسب ألياف عشوائي. وقد طبع هذا الرقم من [10] Macromol. Biosci.، 12 عاما، شيه، J.، ما، B.، مايكل، PL & شولر، FD تصنيع ألياف نانوية من السقالات مع التدريجات في منظمة الألياف والتطبيقات المحتملة. 1336-1341، حقوق الطبع والنشر 2012، بإذن من وايلي-VCH.
فيقوإعادة 5: (A) الإسفار المجهري صورة من الألياف الكومارين 6 مغلفة. (B) الرسم البياني يسلك كثافة الفلورسنت عبر منصة الاعدام. الزيادة الخطية تعني تغيير تدريجي في تركيز المواد الكيميائية من خلال منصة الاعدام. وقد طبع هذا الرقم من [10] Macromol. Biosci.، 12 عاما، شيه، J.، ما، B.، مايكل، PL & شولر، FD تصنيع ألياف نانوية من السقالات مع التدريجات في منظمة الألياف والتطبيقات المحتملة. 1336-1341، حقوق الطبع والنشر 2012، بإذن من وايلي-VCH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من أموال بدء التشغيل من جامعة نبراسكا المركز الطبي والمعهد الوطني للصحة (عدد المنح 1R15 AR063901-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
