Summary
Her præsenterer vi en protokol til at fabrikere elektrospundet nanofiber stilladser med fordelte toner organisering af fibre og udforske deres ansøgninger i regulering cellemorfologi / orientering. Forløb med hensyn til fysiske og kemiske egenskaber af nanofiber stilladser tilbyder en bred vifte af applikationer inden for det biomedicinske område.
Introduction
Nanofibre er et populært værktøj til vævsmanipulering grund af deres evne til at efterligne den ekstracellulære matrix i sin struktur og relative størrelse 1. Men nogle native vævsgrænseflader, såsom sene-til-knogle insertionssted, indeholder collagenfibre, som udviser en variabel organisationsstruktur, der øger i tilpasning til senen og falder ved knoglen stedet 2-5. Så for effektiv vævsregeneration der er behov for at fremstille et stillads, der effektivt kunne efterligne denne strukturelle gradient.
Tidligere har der været forskning udført på gradvise ændringer i fibersammensætning, specifikt indhold af mineraler 6. Men genskabe den strukturelle komponent af bindevæv stort set uudforsket. En tidligere undersøgelse undersøgte morfologiske gradienter ved at studere effekten af overfladen silica partikeldensitet om spredning af rotte calvariale osteoblaster og fandt en InverSE forholdet mellem silica partikeldensitet og celleproliferation 7. Men de morfologiske ændringer, medieret celleproliferation i tidligere arbejde var for det meste relateret til overfladen ruhed mangler kapacitet i efterligne fiber organisationsændringer 7,8. En nylig undersøgelse har forsøgt at fremstille et stillads, som efterlignede de unikke collagen fiberorienteringer ved hjælp af en hidtil ukendt kollektor til elektrospinding 9. Selv om denne undersøgelse lykkedes at fremstille et stillads med både linie og tilfældige fibre, undlod at efterligne gradvise ændringer udstillet i de indfødte væv. Også i produktion separate komponenter, med en øjeblikkelig ændring fra linie til tilfældig orientering, de biomekaniske egenskaber af denne stillads faldt betydeligt. Ingen tidligere arbejde har været i stand til at producere gældende nanofiber stilladser med kontinuerlige overgange i fiberorienteringer fra aligned og tilfældig. Vores seneste undersøgelse har vist vellykket genskabelse af nanofiber stilladsermed inddeling i fiber organisation, der kan potentielt efterligner native collagen organisation sene-til-bone indsættelse 10. Dette arbejde har til formål at præsentere de protokoller, der anvendes til produktion af nanofiber stilladser med en struktur, der ligner den, fiber organisation i native sene-til-knoglevæv interface.
Gradient nanofiber strukturer potentielt vidtrækkende applikationer på tværs af en række forskellige områder. Vi fokuserede på de ansøgninger til tissue engineering af senen-til-bone insertionssted ved at kombinere vores stilladser med adipøst afledte stamceller (ADSCs), der allerede anvendes til vævsregeneration på forskellige substrater 11-14. Desuden ADSCs er meget ens i naturen til knoglemarv stamceller i form af multipotency og deres ressourcer er rigeligt der kan høstes ved hjælp af en simpel fedtsugning 15,16. Seeding disse celler til nuancerede nanofiber stilladser yderligere øger deres tissagsøge ingeniørmæssige anvendelser ved at tillade kontrolleret distribution af de celler, der potentielt kan differentiere til forskellige væv. Ud over at podning stamceller kan nanofibre være indkapslet med signalmolekyler for regulering af cellulær reaktion. Kobling nanoencapsulation med den organisatoriske gradient af disse scaffolds muliggør studiet af cellulære adfærd eller mulige implantat design og belægninger. Indkapsling af funktionelle molekyler som knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2), som er blevet vist at inducere osteoblastdifferentiering 15,16, yderligere forbedre vævsdyrkningsapplikationer disse scaffolds 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsningen
- Der fremstilles en opløsning af poly (ε-caprolacton) (PCL) (Mw = 80.000 g / mol) ved en omtrentlig koncentration på 100 mg / ml. Opløs PCL i en blanding af dichlormethan (DCM) og N, N-dimethlyformamide (DMF) i et forhold på 4: 1 (v / v) med en koncentration på 10% (w / v).
- Placer opløsning i et 20 ml glasrør for at blande. Placer glasrør i ultralydsrenser i 30 minutter, eller indtil opløsningen er gennemskinnelig.
2. Apparatur Forberedelse
- Tilsæt fremstillet PCL opløsning i en 5 ml sprøjte med en 21 gauge stump nål.
- Placer sprøjtepumpe i en lodret electrospinning stilling ifølge figur 1.
- Brug en rustfri stål-hul solfanger med en åben plads på 2 cm x 5 cm for linie fiber substrat. Placer samleren 12 cm fra nålespidsen.
- Slut jævnstrøm (DC) High Voltage strømforsyningen tilnål og jorde samler. Sørg for, at opsamleren er individuelt jordet uden kontakt til det andet laboratorieudstyr.
3. Electrospinning
- Sæt sprøjten pumpe til 1,50 ml / time, indtil dråberne danner på nålens spids straks udskiftes, når fjernet. Indstil derefter strømningshastigheden til 0,50 ml / time.
- Drej spænding operatør til 12 kV.
- Electrospin indtil uniaksialt justeret fibre dækker helt hullet på solfangeren.
- Påfør lim til kanten af en lille glasplade og overføre fibrene fra spalten kollektor til glaspladen. Placer glaspladen på toppen af et stykke aluminiumsfolie, der har samme størrelse som glasplade og er jordet.
- Anbring den anden sprøjte solfanger ifølge figur 3.
- Fastgør plastik maske til den anden sprøjte pumpe og placer det 2 mm over solfangeren.
- Tilføj Coumarin 6 ved 1% (w / w) til PCL opløsning-hvis nanoencapsulation er desired- og bland indtil opløsningen er gennemsigtig.
- Læg PCL eller PCL / Coumarin 6 opløsning i en 5 ml nål med en stump 21 gauge nål. Sæt vertikal pumpe til 0,50 ml / time og vandret til at trække på 9 ml / time eller ved en omtrentlig hastighed på 1 mm / min.
- Electrospin indtil masken er flyttet næsten fuldstændigt fra samleren, men med kantområdet stadig under masken.
4. Fiber Karakterisering
- Prøveemner med dobbeltsidet ledende tape til den metalliske stud og pels med platin i 40 sek ved hjælp af en pådampningsbelægningsmaskine ved 40 mA.
- Undersøg fibrene gennem scanningselektronmikroskop (SEM) i henhold til vores tidligere undersøgelser 17,18.
- Saml billeder på en accelererende spænding på 15 kV.
- Udfør hurtig Fourier transformation (FFT) analyse på et separat fiber prøve at måle fiber tilpasning. De detaljerede oplysninger om måling af fiber tilpasning af FFT kan henvise to tidligere undersøgelser 19,20.
5. Seeding stamceller.
- Steriliser fiber prøver ved neddypning i en 70% ethanol-opløsning i 2 timer. Derefter vaskes fibrene med destilleret vand for at fjerne eventuelle urenheder.
- Opnå humane ADSCs og dyrkede celler i en 25 cm2 kolbe ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft / 5% CO 2. Skift celledyrkningsmediet hver anden dag 10.
- Trypsinisér cellerne, og tælle antallet af celler. Specifikt fjerne alle dyrkningsmedium fra cellekulturen kolben og vask af cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS) to gange. Derefter tilsættes 1 m l af en 0,25% trypsin-EDTA-opløsning (præ-varme i vandbad til 37 ° C) for at dække cellemonolaget og inkuberes kolben i cellekultur inkubator i 2-3 minutter. Tilsæt 4 ml dyrkningsmedium og udvaske alle celler fra overfladen ved pipettering af mediet over hele overfladen. Centrifugeres cellesuspensionen og re-dispers the cellepelleten i dyrkningsmediet. Tæl celler via hæmacytometer. Seed omkring 1 x 10 4 celler til nanofiber stilladset anbringes i en 35 mm -Kultur skål og inkuberes i 3 og 7 dage.
- Stain celler under anvendelse af fluorescein-diacetat (5 mg / ml i acetone) (FDA) og derefter billede prøverne ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Specifikt tilsættes 100 pi FDA løsning dyrkningsskålen og inkuberes i 30 min. Vask cellerne med PBS tre gange, før fluorescerende billeddannelse. Analyser celle orientering ved en tilpasset mat-lab program baseret på vores tidligere undersøgelser 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af denne protokol blev en fibermåtte med en organisatorisk gradient dannet. Figur 3 viser SEM billeder taget på forskellige steder på nanofiber stilladset. Kvalitativt kan det bestemmes, at der er en progression fra uniaksialt aligned fibre ved 0 mm (figur 3A) til en tilfældig fiber sortiment på 6 mm (figur 3D). FFT giver en kvantitativ værdi for fiber justering detaljerne om kvantitative fremgangsmåder er detaljeret her 19. Fibre ved 0 mm udviser en FFT, der angiver fiber justering og ved 6 mm FFT mønster betyder en tilfældig orientering. Der er en klar progression i SEM-billeder (figur 3) fra en linie fiber organisation til en stadig tilfældig fiber deposition (figur 3B - C).
ADSCs undergik morfologiske ændringer baseret på deres placering i nanofiber stilladset. Figur 4 (Figur 4A - D) og 7 dage (Figur 4E - H). Fordelingen af stamceller vinkel blev kvantitativt vurderet af en tilpasset MATLAB program og analyseret ved anvendelse af Kolmogorov-Smirnov test ved forskellige afstande. Figur 4I viser fordelingen af celle vinkel på forskellige steder. Ved 0 mm eller regionen linie fibre, 70% af cellerne viste sig inden for 20 ° af akse nanofiber fabrikation. I modsætning hertil ADSCs podet på de tilfældige dele af fiberen scaffolds manglede denne organisationsstruktur, med kun 20% af cellerne er anført inden for 20 °. Endelig dannelsen af den kemiske gradient hjælp Coumarin 6 - blev fyldt PCL fibre undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Den kemiske gradient kvalitativt bekræftes ved hjælp af mikroskopi billede (figur 5A). Billedet bekræfter den stigende Chemical koncentration over stilladset, som udvises af den stadigt stigende intensitet af det fluorescerende billede. Grafen af fluorescensintensiteten (Image J) (figur 5B) bekræfter gradient af den kemiske koncentration ved at udvise en lineær vækst i hele stilladset.
Figur 1: Viser den skematiske af forsøgsopstillingen for udarbejdelsen af uniaksialt justeret fiber substrat.
Figur 2: (A) viser placeringen af den anden sprøjte pumpe til fremstilling af gradient stilladset. (B) Placering af masken over opsamleren. Dette tal er blevet genoptrykt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikation af nanofiber Stilladser Med inddeling i Fiber Organisation og deres anvendelsesmuligheder. 1336-1341, Copyright 2012, med tilladelse fra Wiley-VCH.
Figur 3: SEM billeder af PCL trinvise nanofiber stillads ved 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C) og 6 mm (D). De sekundære billeder er Fourier hurtig overførsel mønstre (FFT). Mønster ved (A) er, at linie fibre, (d) antyder tilfældig fiber deposition. Dette tal er blevet genoptrykt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikation af nanofiber Stilladser Med inddeling i Fiber Organisation og deres anvendelsesmuligheder. 1336-1341, Copyright 2012, med tilladelse fra Wiley-VCH.
FiguAd 5: (A) Fluorescensmikroskopi billede af cumarin 6-indkapslede fibre. (B) Grafen viser fluorescensintensiteten over stilladset. Den lineære stigning betyder en gradvis ændring i den kemiske koncentration gennem stilladset. Dette tal er blevet genoptrykt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikation af nanofiber Stilladser Med inddeling i Fiber Organisation og deres anvendelsesmuligheder. 1336-1341, Copyright 2012, med tilladelse fra Wiley-VCH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af startup midler fra University of Nebraska Medical Center og National Institute of Health (tilskud nummer 1R15 AR063901-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
