Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.
Introduction
Nanofibers הוא כלי פופולרי להנדסת רקמות בגלל היכולת שלהם לחקות את המטריצה תאית במבנה שלה וגודלה היחסי 1. עם זאת, חלק מממשקים האם של הרקמה, כגון אתר הכנסת גיד לעצם, מכילים סיבי קולגן, אשר מפגינים מבנה ארגוני משתנה שמגדיל ביישור לגיד ופוחת באתר העצם 2-5. אז, לשחזור רקמות יעילות יש צורך לפברק פיגום שיכול ביעילות לחקות שיפוע מבני זו.
מחקר בעבר, חל נערך על שינויים הדרגתיים בהרכב סיבים, במיוחד, תכולת מינרלים 6. עם זאת, יצירה מחדש של המרכיב המבני של רקמות חיבור נשארה נחקרה במידה רבה. מחקר מוקדם יותר בדק הדרגתיים מורפולוגיים על ידי לימוד ההשפעה של צפיפות חלקיקי סיליקה משטח על ההתפשטות של osteoblasts calvarial החולדה ומצא Inverמערכת יחסים בין se צפיפות חלקיקי סיליקה ותא התפשטות 7. אבל השינויים מורפולוגיים שתיווך שגשוג תאים בעבודה קודמת היו בעיקר קשורים למשטח חספוס חסר היכולת במחק שינויים ארגוניים סיבים 7,8. אחד מחקרים אחרונים ניסו לפברק פיגום שחיקה אוריינטציות קולגן סיבים הייחודיות באמצעות אספן חדשני לelectrospinning 9. בעוד מחקר זה הצליח לייצר פיגום עם סיבים שני מיושרים ואקראיים, היא לא הצליחה לחקות את השינויים הדרגתיים שהוצגו ברקמות המקומיות. כמו כן, בייצור רכיבים נפרדים, עם שינוי מיידי ממיושר לכיוון אקראי, המאפיינים ביו-המכאניים של פיגום זה ירד באופן משמעותי. אין עבודה קודמת הצליחה לייצר פיגומי nanofiber ישימים עם דרגות רציפות באורינטציות סיבים ממיושרים ואקראי. המחקר שנערך לאחרונה שלנו הראה בילוי מוצלח של פיגומי nanofiberעם דרגות בארגון סיבים שעלולים לחקות את הארגון האם של קולגן בגיד לעצם ההכנסה 10. עבודה זו מבקשת להציג את הפרוטוקולים המשמשים לייצור פיגומי nanofiber עם מבנה דומה מאוד לזו של ארגון סיבים בממשק רקמת גיד לעצם הילידים.
מבני nanofiber Gradient יש פוטנציאל מרחיק לכת יישומים על פני מגוון רחב של תחומים. אנחנו מתמקדים ביישומים להנדסת רקמות של אתר הכנסת גיד לעצם על ידי שילוב של הפיגומים שלנו עם תאי שמקורם שומן גזע (ADSCs) שכבר מנוצלים לשחזור רקמות על מצעים שונים 11-14. בנוסף, ADSCs דומה מאוד באופיים לתאי גזע של מח עצם במונחים של multipotency והמשאבים שלהם הוא בשפע שניתן לקצור באמצעות 15,16 הליך שאיבת שומן פשוט. זריעת תאים אלה לפיגומי nanofiber מדורגים משפרת עוד יותר את tisלתבוע יישומים הנדסיים כך שהוא מאפשר להפצה מבוקרת של התאים שיכולים להתמיין לרקמות שעלולים להיות שונות. בנוסף לזריעת תאי גזע, יכול להיות במארז nanofibers עם מולקולות איתות לרגולציה של תגובה תאית. צימוד nanoencapsulation עם השיפוע הארגוני של פיגומים אלה מאפשר לחקר התנהגות סלולרית או עיצובי שתל אפשריים וציפויים. Encapsulation של מולקולות חלבון פונקציונליות כמו עצם המוךפו"גנטי 2 (BMP2), אשר הוכח לגרום להתמיינות תא עצם 15,16, עוד יכול לשפר את יישומי הנדסת רקמות של פיגומים אלה 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הפתרון
- הכן פתרון של פולי (ε-caprolactone) (PCL) (M w = 80,000 g / mol) בריכוז של כ 100 מ"ג / מיליליטר. לפזר PCL בתערובת של dichloromethane (DCM) וN, N-dimethlyformamide (DMF) ביחס של 4: 1 (V / V) בריכוז של 10% (w / v).
- מניחים את הפתרון בצינור זכוכית 20 מיליליטר לערבוב. מניחים שפופרת זכוכית לתוך שואב קולי במשך 30 דקות, או עד שהפתרון הוא שקוף.
2. מכשירי הכנה
- מוסיף את פתרון PCL הכין לתוך מזרק 5 מיליליטר עם מחט קהה 21 מד המצורף.
- מניחים משאבת מזרק בעמדת electrospinning אנכית, על פי איור 1.
- השתמש אספן הפלדה אל-חלד עם פער חלל פתוח של 2 x סנטימטר 5 סנטימטרים למצע סיבים מיושרים. הנח את האספן 12 סנטימטר מקצה המחט.
- חבר את הזרם ישר (DC) אספקת חשמל מתח הגבוה למחט וקרקע האספן. ודא שהאספן מעוגן בנפרד ללא קשר לציוד מעבדה האחר.
3. Electrospinning
- משאבת Set מזרק ל1.50 מיליליטר / שעה, עד שהטיפין יוצרות בקצה המחט מוחלפות מייד כשהוסר. ואז, להגדיר את קצב הזרימה עד 0.50 מיליליטר / שעה.
- הפעל מפעיל מתח kV 12.
- Electrospin עד הסיבים מיושרים uniaxially לכסות לחלוטין את הפער באספן.
- החל דבק לקצוות של צלחת זכוכית קטנה ולהעביר את הסיבים מאספן הפער לצלחת הזכוכית. מניחים את צלחת הזכוכית בחלק העליון של פיסת נייר אלומיניום שיש באותו גודל כמו צלחת הזכוכית ומעוגנת.
- מקם את אספן המזרק השני על פי איור 3.
- צרף את מסכת הפלסטיק למשאבה השנייה מזרק וזה 2 מ"מ מעל עמדת האספן.
- להוסיף Coumarin 6 ב 1% (w / w) לפתרון-אם נאן PCLoencapsulation הוא desired- ולערבב עד הפתרון הוא שקוף.
- טען את PCL או פתרון PCL / Coumarin 6 למחט 5 מיליליטר עם מחט 21 מד בוטה. הגדר משאבה אנכית עד 0.50 מיליליטר / שעה ואופקית למשוך בשעה 9 מיליליטר / שעה או במהירות משוערת של 1 מ"מ / דקה.
- Electrospin עד המסכה עבר כמעט לחלוטין את האספן, אבל עם אזור הקצה עדיין מתחת למסכה.
4. סיבי אפיון
- דגימות מקום עם קלטת מוליך דו-צדדית להרבעה מתכתית ומעיל עם פלטינה במשך 40 שניות באמצעות coater גמגום בגיל 40 mA.
- לבחון סיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) על פי המחקרים הקודמים שלנו 17,18.
- לאסוף תמונות במתח מאיץ של 15 קילו וולט.
- לבצע ניתוח מהיר התמרה (FFT) על מדגם סיבים נפרד למדוד יישור סיבים. המידע מפורט על יישור סיבי מדידה על ידי FFT יכול להתייחס to מחקרים קודמים 19,20.
5. בתאי גזע זריעה.
- לעקר את דגימות סיבים על ידי שריה בתמיסת אתנול 70% עבור שעה 2. לאחר מכן לשטוף את הסיבים עם מים מזוקקים כדי להסיר כל מזהמים.
- להשיג ADSCs אנושי ותאי תרבות בבקבוק 2 25 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 95% CO אוויר / 5% 2. לשנות את מדיום תרבית תאים בכל יום אחר 10.
- Trypsinize התאים ולספור את מספר התאים. באופן ספציפי, להסיר את כל מדיום התרבות מהבקבוק תרבית תאים ולשטוף את התאים עם ופר פוספט (PBS) פעמיים. לאחר מכן להוסיף l 1 מ 'של פתרון 0.25% טריפסין EDTA (טרום חם באמבט מים עד 37 ° C) כדי לכסות את monolayer תא דגירה הבקבוק בתרבית תאי החממה במשך 2-3 דקות. הוסף בינוני תרבות 4 מיליליטר ולשטוף את כל התאים מפני השטח על ידי pipetting הבינוני בכל רחבי השטח. ה צנטריפוגה ההשעיה התא ומחדש להתפזרתא גלולה דואר במדיום התרבות. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. זרע סביב 1 × 10 4 תאים לפיגום nanofiber הניח בצלחת -culture 35 מ"מ ודגירה של 3 ו -7 ימים.
- תאי כתם באמצעות diacetate והעמסת (5 מ"ג / מיליליטר באצטון) (FDA) ואז תמונה הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באופן ספציפי, להוסיף של פתרון ה- FDA 100 μl למנת התרבות ודגירה למשך 30 דקות. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לפני ההדמיה ניאון. לנתח כיוון תא על ידי תכנית מעבדה-מחצלת מותאמת אישית המבוססת על המחקרים הקודמים שלנו 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש בפרוטוקול זה, מחצלת סיבים עם שיפוע ארגוני הוקמה. איור 3 מציג את התמונות שצולמו SEM במקומות שונים על פיגום nanofiber. איכותי, שניתן לקבוע שיש התקדמות מהסיבים מיושרים uniaxially ב0 מ"מ (איור 3 א) למגוון סיבים אקראי בשעה 6 מ"מ (איור 3D). FFT נותן ערך כמותי ליישור הסיבים, פרטים על התהליכים כמותיים מפורטים כאן 19. סיבים ב0 תערוכת מ"מ FFT שמציין יישור סיבים, ובגיל 6 מ"מ דפוס FFT מסמן כיוון אקראי. יש התקדמות ברורה בתמונות SEM (איור 3) מארגון סיבים מיושר לתצהיר סיבים אקראי יותר ויותר (איור 3 ב - C).
ADSCs עבר שינויים מורפולוגיים המבוססים על מיקומם בפיגום nanofiber. איור 4 (איור 4 א - ד) ו- 7 ימים (איור 4E - H). חלוקת זווית תאי גזע הוערכה כמותית על ידי תכנית MATLAB מותאמת אישית ונותחה באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב במרחקים שונים. איור 4I מציג את התפלגות זווית תא במקומות שונים. ב0 מ"מ, או האזור של סיבים מיושרים, 70% מהתאים הופיעו בתוך 20 ° של ציר ייצור nanofiber. בניגוד לכך, ADSCs זורעים על החלקים מפיגומי הסיבים אקראיים חסר מבנה ארגוני זה, עם רק 20% מהתאים המופיעים בתוך 20 °. לבסוף, ההיווצרות של השיפוע הכימי באמצעות Coumarin 6 - סיבי PCL טעונים נחקרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השיפוע הכימי היה איכותי אישר שימוש בתמונה מיקרוסקופית (איור 5 א). התמונה מאשרת את חמי הגדלתריכוז קלוריות על פני הפיגום, אשר הוצג על ידי העצמה הולכות וגדלה של תמונת הניאון. הגרף של עוצמת הניאון (תמונה J) (איור 5) מאשר את השיפוע של הריכוז הכימי על ידי הפגנת צמיחה ליניארית בפיגום.
איור 1: מציג את סכמטי של התקנה ניסיונית להכנת מצע הסיבים מיושר uniaxially.
איור 2: (א) מראה מיקום של משאבת המזרק השנייה עבור הייצור של פיגום השיפוע. מיקום (B) של המסכה מעל האספן. נתון זה כבר נדפס מ[ 10] Macromol. Biosci., 12, שי, ג ', מא, ב', מיכאל, PL וולר, FD פאבריקטיון של פיגומים nanofiber עם דרגות בארגון סיבים ויישומים הפוטנציאליים שלהם. 1336-1341, כל הזכויות שמורות 2012, באישור Wiley-VCH.
איור 3: תמונות SEM של פיגום nanofiber PCL המדורג ב0 מ"מ (), 2 מ"מ (B), 4 מ"מ (C), ו- 6 מ"מ (D). התמונות המשניות הן דפוסים פורייה העברה מהירה (FFT). דפוס ב() הוא זו של סיבים מיושרים, (D) מרמז בתצהיר סיבים אקראי. נתון זה כבר נדפס מ[ 10] Macromol. Biosci., 12, שי, ג ', מא, ב', מיכאל, PL וולר, ייצור FD של פיגומים nanofiber עם דרגות בארגון סיבים ויישומים הפוטנציאליים שלהם. 1336-1341, כל הזכויות שמורות 2012, באישור Wiley-VCH.
Figuמחדש 5: (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי תמונה של סיבי Coumarin 6 במארז. (ב) הגרף מציג את עוצמת הניאון פני הפיגום. הגידול ליניארי מסמל שינוי הדרגתי בריכוז הכימי באמצעות הפיגום. נתון זה כבר נדפס מ[ 10] Macromol. Biosci., 12, שי, ג ', מא, ב', מיכאל, PL וולר, ייצור FD של פיגומים nanofiber עם דרגות בארגון סיבים ויישומים הפוטנציאליים שלהם. 1336-1341, כל הזכויות שמורות 2012, באישור Wiley-VCH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה באופן חלקי מקופות הפעלה ממרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה ומכון הלאומי לבריאות (מספר מענק 1R15 AR063901-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
