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Bioengineering

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

Published: April 19, 2015 doi: 10.3791/52626

Summary

Qui, vi presentiamo un protocollo per fabbricare scaffold elettrofilate nanofibre con organizzazione sfumati di fibre e di esplorare le loro applicazioni nella regolazione della morfologia delle cellule / orientamento. Gradienti per quanto riguarda le proprietà fisiche e chimiche dei ponteggi nanofibre offrono un'ampia varietà di applicazioni in campo biomedico.

Introduction

Nanofibre sono un'utilità popolare per ingegneria tissutale a causa della loro capacità di mimare la matrice extracellulare nella sua struttura e dimensione relativa 1. Tuttavia, alcune interfacce tessuto nativo, come il sito tendine-osso, contengono fibre collagene, che presentano una struttura organizzativa variabile che aumenta in allineamento verso il tendine e diminuisce al sito osseo 2-5. Così, per la rigenerazione tissutale efficace è necessario per fabbricare un ponteggio che potrebbe efficacemente imitare questo gradiente strutturale.

In precedenza, vi è stata una ricerca condotta sui cambiamenti graduali nella composizione delle fibre, in particolare, il contenuto di minerali 6. Tuttavia, ricreando la componente strutturale dei tessuti connettivi rimane in gran parte inesplorato. Uno studio precedente esaminato gradienti morfologiche studiando l'effetto della silice superficie densità di particelle sulla proliferazione degli osteoblasti ratto cranica e trovato un inverrapporto tra la densità se particella di silice e la proliferazione cellulare 7. Ma i cambiamenti morfologici che mediate proliferazione cellulare in lavori precedenti erano per lo più relativi alla rugosità superficiale manca la capacità di mimare fibra cambiamenti organizzativi 7,8. Uno studio recente ha tentato di realizzare un ponteggio che imitava gli orientamenti fibre collagene unici utilizzando un nuovo collettore per electrospinning 9. Anche se questo studio è riuscito a produrre un ponteggio con fibre sia allineate e casuale, non è riuscito a imitare i graduali cambiamenti esposti nei tessuti nativi. Inoltre, nella produzione di componenti separati, con un cambiamento immediato dal allineato all'orientamento casuale, le proprietà biomeccaniche di questa impalcatura è diminuito in modo significativo. Nessun lavoro precedente è stato in grado di produrre applicabili ponteggi nanofibre con continui gradazioni orientamenti fibra di allineato e casuali. Il nostro recente studio ha dimostrato con successo la ricreazione di ponteggi nanofibrecon gradazioni nell'organizzazione fibra che può potenzialmente mimare l'organizzazione collagene nativo all'inserimento di 10 tendine-osso. Questo lavoro si propone di presentare i protocolli utilizzati per la produzione di scaffold nanofibre con una struttura molto simile a quella di organizzazione fibre nell'interfaccia nativa tendine-osso tessuti.

Strutture nanofibre gradiente sono potenzialmente di vasta portata applicazioni attraverso una varietà di campi. Ci siamo concentrati sulle applicazioni per l'ingegneria tissutale del sito di tendine-osso combinando le nostre impalcature con le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) che sono già utilizzate per la rigenerazione dei tessuti su vari substrati 11-14. Inoltre, ADSCs sono molto simili in natura per le cellule staminali del midollo osseo in termini di multipotenza e la loro risorsa è abbondante che può essere raccolto mediante una semplice procedura di liposuzione 15,16. Semina queste cellule per ponteggi nanofibre sfumati aumenta ulteriormente la loro tiscitare applicazioni ingegneristiche consentendo la distribuzione controllata delle cellule che possono potenzialmente differenziarsi in vari tessuti. Oltre a seminare le cellule staminali, nanofibre possono essere incapsulati con molecole di segnalazione per la regolazione della risposta cellulare. Accoppiamento nanoencapsulation con il gradiente organizzativa di tali ponteggi consente lo studio del comportamento cellulare o possibili disegni implantari e rivestimenti. Incapsulamento di molecole funzionali come proteina morfogenetica 2 (BMP2), che ha dimostrato di indurre la differenziazione degli osteoblasti 15,16, potrebbe migliorare ulteriormente le applicazioni di ingegneria tissutale di questi ponteggi 10.

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Protocol

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare una soluzione di poli (ε-caprolattone) (PCL) (M w = 80,000 g / mol) ad una concentrazione approssimativa di 100 mg / ml. Sciogliere PCL in una miscela di diclorometano (DCM) e N, N-dimethlyformamide (DMF) con un rapporto di 4: 1 (v / v) con una concentrazione del 10% (w / v).
  2. Porre la soluzione in un tubo di vetro da 20 ml per la miscelazione. Mettere tubo di vetro in ultrasuoni per 30 minuti, o fino a quando la soluzione è trasparente.

2. Apparecchiatura Preparazione

  1. Aggiungere la soluzione PCL preparata in una siringa da 5 ml con un ago senza punta 21 gauge collegato.
  2. Inserire pompa a siringa in posizione electrospinning verticale di figura 1.
  3. Utilizzare un collettore in acciaio inox-gap con uno spazio aperto di 2 cm x 5 cm per il substrato di fibre allineate. Posizionare il collettore 12 centimetri dalla punta dell'ago.
  4. Collegare la corrente continua (DC) ad alta tensione di alimentazione alago e terra il collettore. Assicurarsi che il collettore è individualmente a terra senza contatto per le altre apparecchiature di laboratorio.

3. Electrospinning

  1. Set pompa a siringa a 1.50 ml / h, fino a quando le goccioline che formano sulla punta dell'ago vengono immediatamente sostituiti quando viene rimosso. Quindi, impostare la portata di 0,50 ml / h.
  2. Girare l'operatore tensione di 12 kV.
  3. Electrospin fino a quando le fibre uniaxially allineate coprire completamente il gap sul collettore.
  4. Applicare la colla ai bordi di una piccola lastra di vetro e trasferire le fibre dal collettore gap alla lastra di vetro. Posizionare la lastra di vetro nella parte superiore di un pezzo di foglio di alluminio che ha la stessa dimensione della lastra di vetro ed è messo a terra.
  5. Posizionare il secondo collettore siringa secondo la figura 3.
  6. Fissare la maschera di plastica per la seconda pompa siringa e posizione it 2 mm sopra il collettore.
  7. Aggiungi cumarina 6 a 1% (w / w) per il PCL soluzione se nanoencapsulation è desired- e mescolare fino a quando la soluzione è trasparente.
  8. Caricare il PCL o PCL / cumarina 6 soluzione in un ago 5 ml con un ottuso ago 21 gauge. Impostare pompa verticale a 0,50 ml / hr e orizzontale per tirare 9 ml / hr o ad una velocità di circa 1 mm / min.
  9. Electrospin finché la maschera è spostato quasi completamente fuori dal collettore, ma con la zona di bordo ancora sotto la maschera.

4. Fiber Caratterizzazione

  1. I campioni con nastro adesivo conduttivo biadesivo al perno metallico e il cappotto con platino per 40 sec con una verniciatura polverizzazione a 40 mA.
    1. Esaminare fibre attraverso microscopio elettronico a scansione (SEM) secondo i nostri studi precedenti 17,18.
    2. Raccogliere immagini ad una tensione di accelerazione di 15 kV.
  2. Eseguire l'analisi rapida di Fourier (FFT) su un campione di fibra separato per misurare l'allineamento fibra. Le informazioni dettagliate su allineamento delle fibre di misura da FFT può riferirsi to studi precedenti 19,20.

5. Cellule staminali Seeding.

  1. Sterilizzare i campioni di fibre immergendola in una soluzione di etanolo al 70% per 2 ore. Quindi lavare le fibre con acqua distillata per rimuovere eventuali contaminanti.
  2. Ottenere ADSCs umane e cellule di coltura in una beuta da 25 cm 2 a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO 2. Modificare il terreno di coltura cellulare a giorni 10.
  3. Trypsinize cellule e contare il numero di cellule. Specificamente, rimuovere tutto terreno di coltura dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) due volte. Poi aggiungere 1 m l di una soluzione 0,25% tripsina-EDTA (pre-caldo in bagno d'acqua a 37 ° C) per coprire il monostrato cellulare e incubare la beuta nell'incubatrice coltura cellulare per 2-3 minuti. Aggiungere 4 ml terreno di coltura e lavare tutte le cellule dalla superficie pipettando il mezzo su tutta la superficie. Centrifugare la sospensione cellulare e ri-disperse esimoe pellet di cellule nel mezzo di coltura. Contare le celle tramite emocitometro. Seed circa 1 × 10 4 celle al patibolo nanofibre collocato in un piatto -Cultura 35 millimetri e incubare per 3 e 7 giorni.
  4. Cellule macchia con fluoresceina diacetato (5 mg / ml in acetone) (FDA) allora l'immagine dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza. In particolare, aggiungere 100 ml di soluzione FDA al piatto cultura e incubare per 30 min. Lavare le cellule con PBS per tre volte prima di imaging fluorescente. Analizzare l'orientamento delle cellule da un programma personalizzato mat-lab in base alle nostre precedenti studi 10.

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Representative Results

Usando questo protocollo, si è formata una stuoia in fibra con pendenza organizzativa. La figura 3 mostra le immagini SEM scattate in varie posizioni sul patibolo nanofibre. Qualitativamente, si può determinare che esiste una progressione da fibre uniaxially allineate a 0 mm (Figura 3A) ad una fibra assortimento casuale a 6 mm (Figura 3D). La FFT dà un valore quantitativo per l'allineamento delle fibre, specifiche sui processi quantitativi sono dettagliate qui 19. Fibre a 0 millimetri mostrano una FFT che indica l'allineamento delle fibre, ed a 6 mm, il modello FFT significa un orientamento casuale. Vi è una chiara progressione nelle immagini SEM (Figura 3) da un'organizzazione fibra allineato ad una deposizione fibra sempre casuale (Figura 3B - C).

ADSCs hanno subito cambiamenti morfologici in base alla loro posizione nel ponteggio nanofibre. Figura 4 (Figura 4A - D) e 7 giorni (Figura 4E - H). La distribuzione dell'angolo cellule staminali è stata valutata quantitativamente da un programma MATLAB area analizzata utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov a varie distanze. Figura 4I mostra la distribuzione dell'angolo cellulare in luoghi diversi. A 0 mm o regione di fibre allineate, 70% delle cellule apparso entro 20 ° rispetto all'asse di nanofibre fabbricazione. Al contrario, le ADSCs seminate sulle porzioni casuali di scaffold fibre mancava tale struttura organizzativa, con solo il 20% delle cellule contenute entro 20 °. Infine, la formazione del gradiente chimica utilizzando cumarina 6 - fibre PCL caricati stata studiata mediante microscopia a fluorescenza. Il gradiente sostanza chimica è stata confermata qualitativamente usando l'immagine microscopio (Figura 5A). L'immagine conferma la crescente Chemiconcentrazione cal tutta l'impalcatura, che è esposto dal sempre crescente intensità dell'immagine fluorescente. Il grafico dell'intensità fluorescente (figura J) (Figura 5B) conferma la pendenza della concentrazione chimica esibendo una crescita lineare attraverso il ponteggio.

Figura 1
Figura 1: mostra lo schema di configurazione sperimentale per la preparazione del substrato in fibra uniaxially allineati.

Figura 2
Figura 2: (A) mostra il posizionamento della seconda pompa a siringa per la fabbricazione del ponteggio gradiente. (B) Posizionamento della maschera sopra il collettore. Questo dato è stato ristampato dalla [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL e Shuler, FD Fabricazione di nanofibre Ponteggi Con gradazioni Fiber Organizzazione e le loro potenziali applicazioni. 1336-1341, Copyright 2012, con il permesso di Wiley-VCH.

Figura 3
Figura 3: immagini SEM di ponteggio nanofibre PCL graduata a 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C), e 6 mm (D). Le immagini secondarie sono Fourier modelli di trasferimento veloce (FFT). Pattern a (A) è quella di fibre allineate, (D) suggerisce deposizione fibra casuale. Questo dato è stato ristampato dalla [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL e Shuler, FD Fabbricazione di nanofibre Ponteggi Con gradazioni Organizzazione Fiber e loro potenziali applicazioni. 1336-1341, Copyright 2012, con il permesso di Wiley-VCH.

Figura 4: le immagini al microscopio a fluorescenza che mostra ADSCs dopo incubazione per 3 giorni (A - D) e 7 giorni (E - H). Immagini mostrano le diverse morfologie di ADSCs in diverse località del patibolo sfumato. (I): La distribuzione di angoli di cellule in diverse posizioni di ponteggi. Le cellule sono state molto più concentrate tra 20 ° rispetto all'asse di allineamento nanofibre su fibre allineate (da 0 mm). Questo dato è stato ristampato dalla [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL e Shuler, FD Fabbricazione di nanofibre Ponteggi Con gradazioni Organizzazione Fiber e loro potenziali applicazioni. 1336-1341, Copyright 2012, con il permesso di Wiley-VCH.

Figura 5
Figure 5: (A) la microscopia a fluorescenza immagine di fibre cumarina 6-incapsulati. (B) Il grafico mostra l'intensità fluorescente attraverso il ponteggio. L'aumento lineare significa un graduale cambiamento della concentrazione chimica attraverso l'impalcatura. Questo dato è stato ristampato dalla [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL e Shuler, FD Fabbricazione di nanofibre Ponteggi Con gradazioni Organizzazione Fiber e loro potenziali applicazioni. 1336-1341, Copyright 2012, con il permesso di Wiley-VCH.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai fondi di avvio della University of Nebraska Medical Center e National Institute of Health (codice di autorizzazione 1R15 AR063901-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone Sigma-Aldrich 440744
N,N-Dimethlyformamide Fisher Chemical D-119-1
Dichloromethane Fisher Chemical AC61093-1000
Coumarin 6 Sigma-Aldrich 546283
Adipose Derived Stem Cells Cellular engineering Technologies HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054
α-Modified Eagle's Medium Invitrogen a10490-01
Acetone Fisher Scientific s25120a
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 10010023
Glass Slides VWR international, LLC 101412-842
Syringe Pump Fisher Scientific 14-831-200 Single syringe
Ultrasonic Cleaner Branson 1510
High Voltage DC Power Supply Gamma High Voltage Research ES30
Scanning Electron Microscope FEI Nova 2300
Fluorescence Microscope Zeiss Axio Imager 2

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References

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Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. J. Vis. Exp. (98), e52626, doi:10.3791/52626 (2015).

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