Summary
Burada, biz liflerin Basamaklandırılmış organizasyonu ile electrospun nanolif iskeleleri imal ve hücre morfolojisi / yönünü düzenleyen kendi uygulamalarını keşfetmek için bir protokol mevcut. Nanolif iskelelerinin fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından Degrade'ler biyomedikal alanındaki uygulamalar geniş bir yelpazede sunuyoruz.
Introduction
Nanofiberler nedeniyle yapısı ve göreceli büyüklüğü 1 hücre dışı matriks taklit etme yeteneği doku mühendisliği için popüler bir yarar vardır. Bununla birlikte, örneğin, tendon-kemik girme mevkisi olarak bazı yerel doku arayüzler, tendon karşı uyum artar ve kemik yerinde 2-5 azalmakta değişken bir organizasyon yapısı sergileyen kollajen lifleri içerir. Bu nedenle, etkin bir doku rejenerasyonu için etkili bir yapısal gradyanı taklit ederek, bir iskele imal etmek için bir gereksinim vardır.
Lif kompozisyonu kademeli değişiklikler üzerinde yapılan Önceleri, orada bir araştırma, özellikle, mineral içeriği 6. Ancak, bağ dokularının yapısal bileşeni yeniden büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Daha önceki bir çalışmada sıçan Kalvaryal osteoblast çoğalması yüzey silika parçacık yoğunluğu etkisi inceleyerek morfolojik geçişlerini incelemiş ve bir Inver bulundusilika parçacığı yoğunluğu ve hücre çoğalması 7 ila se ilişkisi. Ama daha önceki çalışmalarında hücre çoğalmasını aracılı morfolojik değişiklikler lif organizasyonel değişiklikler 7,8 taklit kabiliyeti eksik pürüzleri yüzey çoğunlukla ilgili idi. Bir son çalışmada 9 elektrospinning için yeni bir toplayıcı kullanarak benzersiz kollajen lif yönelimleri taklit bir iskele türettiğini. Bu çalışmada hem hizalanmış ve rastgele lifleri ile bir iskele üretiminde başarılı iken, doğal dokuların sergilenen kademeli değişiklikleri taklit etmek başarısız oldu. Aynı şekilde, rasgele yönlendirmeye hizalanmış bir ani değişim ile, ayrı bileşenlerin üretiminde, bu skafold biyomekanik özelliklerini önemli ölçüde azalmıştır. Hiçbir önceki çalışmaları hizalanmış ve rastgele fiber yönelimleri sürekli geçişler ile geçerli nanolif iskeleleri üretmek mümkün olmuştur. Bizim son çalışmada Nanolif iskelelerinin başarılı rekreasyon göstermiştirpotansiyel tendon-kemik ekleme 10 de yerli kollajen organizasyonu taklit fiber organizasyonunda geçişleri ile. Bu çalışma yakından yerli tendon-kemik doku arayüzü lif örgüt andıran bir yapıya sahip Nanolif iskelelerinin üretimi için kullanılan protokoller sunmayı amaçlamaktadır.
Degrade nanolif yapıları potansiyel alanlarda çeşitli genelinde uygulamaları geniş kapsamlı oylandı. Biz zaten çeşitli yüzeylerde 11-14 doku rejenerasyonu için kullanılmaktadır adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSCs) ile iskeleleri birleştirerek tendon-kemik ekleme sitenin doku mühendisliği uygulamaları üzerinde duruldu. Buna ek olarak, ADSCs multipotency açısından, kemik iliği kök hücreleri, doğada çok benzerdir ve kaynak basit bir yağ emme işlemi 15,16 kullanılarak hasat edilebilir boldur. Daha gradated nanolif iskeleleri bu hücrelerin ekim kendi tis artırırPotansiyel çeşitli dokulara ayırt edebilir hücrelerin kontrollü dağıtımı için izin vererek mühendislik uygulamaları dava. Kök hücre ekim ek olarak, nanolifler hücre tepkisinin düzenlenmesi için sinyal molekülleri ile kapsüllenebilmektedir. Bu iskelelerinin örgütsel gradyan ile nanoencapsulation bağlanması hücresel davranış veya olası implant tasarımları ve kaplamaların çalışma için izin verir. Osteoblast farklılaşmasını 15,16 indüklediği gösterilmiştir kemik morfogenetik protein 2 (BMP2), gibi fonksiyonel moleküllerin Kapsülleme ayrıca bu iskeleler 10 arasında doku mühendisliği uygulamaları geliştirmek olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çözüm 1. Hazırlık
- 100 mg / ml'lik uygun bir konsantrasyonda Poli (ε-kaprolakton) (PCL), (a, M = 80,000 g / mol) içindeki bir çözeltisi hazırlandı. 4 bir oranda, diklorometan (DCM) ve N, N-dimethlyformamide (DMF) içindeki bir karışımı içinde PCL çözülür: 1 (v / v)% 10 bir konsantrasyona sahip (ağırlık / hacim).
- Karıştırma için 20 ml'lik bir cam tüp içinde çözelti yerleştirin. 30 dakika ultrasonik süpürge içine cam tüp koyun ya da çözelti berrak hale gelene kadar.
2. İstem hazırlanması
- Bağlı bir 21 numara kör iğne ile 5 ml'lik bir şırınga içine hazırlanan PCL solüsyonu ekleyin.
- Şekil 1'e göre, bir dikey elektro pozisyonda şırınga pompası yerleştirin.
- 2 cm x hizalanmış elyaf alt-tabaka için 5 cm arasında bir açık alana sahip bir paslanmaz çelik boşluğu toplayıcı kullanın. Kolektör iğne ucundan 12 cm yerleştirin.
- Doğrudan Akım (DC) Yüksek Gerilim güç kaynağı bağlayınİğne ve kollektör topraklayın. Toplayıcı ayrı ayrı diğer laboratuvar ekipmanı hiçbir temas topraklı emin olun.
3. Elektrospinning
- Çıkartıldığında iğne ucunda oluşturan damlacıklar kadar 1.50 ml / saat Set şırınga pompası, hemen değiştirilir. Sonra, 0.50 ml / saat akış hızını ayarlamak.
- 12 kV gerilim operatörü çevirin.
- Electrospin tek eksenli hizalanmış lifler tamamen kolektör üzerindeki boşluğu kapatmak kadar.
- Küçük bir cam plaka kenarlarına yapıştırıcı uygulanır ve cam plaka boşluk kolektöründen lifleri aktarın. Cam levha ile aynı boyuta sahiptir ve topraklanmış bir alüminyum folyo parçasının üzerine cam levha yerleştirin.
- Şekil 3'e göre ikinci şırınga toplayıcı yerleştirin.
- Kollektör yukarıdaki ikinci şırınga pompası ve pozisyon 2 mm plastik maske takın.
- (A / a), PCL çözelti halinde nan için% 1 kumarin 6 eklemeoencapsulation desired- ve çözelti berrak hale gelene kadar karıştırın.
- Künt 21 gauge iğne ile 5 ml iğne içine PCL veya PCL / Kumarin 6 çözüm yükleyin. 0.50 ml / saat dikey Pompayı ve 9 ml / sa oranında ve 1 mm / dak hızla, yaklaşık çekmek için yatay.
- Maske kadar Electrospin kolektör kapalı neredeyse tamamen taşınmış, ancak maskenin altında hala kenar alanı vardır.
4. Fiber Karakterizasyonu
- 40 mA bir püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak 40 saniye platin metalik damızlık ve kaplamak için çift taraflı iletken bant ile yerleştirin örnekleri.
- Daha önceki çalışmalarda 17,18 uyarınca taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile lifleri inceleyin.
- 15 kV bir hızlandırma voltajı görüntüleri toplayın.
- Fiber hizalama ölçmek için ayrı bir elyaf numunesi üzerinde hızlı Fourier dönüşümü (FFT) analizi yapın. FFT ile ölçüm lif uyum konusunda detaylı bilgiler t başvurabilirsinizönceki çalışmalar 19,20 o.
5. Seeding Kök Hücre.
- 2 saat süre ile,% 70 etanol çözeltisi içinde ıslatılmasıyla elyaf örnekleri sterilize edin. Daha sonra herhangi bir kirletici maddelerin ayrılması için damıtılmış su ile liflerin yıkayın.
- % 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 25 cm2 şişeye insan ADSCs kültür hücreleri elde edilir. Hücre kültür ortamı her geçen gün 10 değiştirin.
- Hücreleri Trypsinize ve hücrelerin sayısını. Spesifik olarak, hücre kültürü şişesine tüm kültür ortamı çıkarın ve iki kez fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücrelerin yıkayın. Daha sonra, hücre tekli tabakası kapak ve 2-3 dakika için bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe bir balon (37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma)% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1 M L ilave edin. 4 ml kültür ortamı ekleyin ve her yüzey üzerinde orta pipetleme yüzeyinden tüm hücreleri yıkayın. Hücre süspansiyonu Santrifüj ve yeniden dağıtılması inciKültür ortamı içinde, e hücre topağı. Hemasitometre yoluyla hücreleri saymak. Ve 35 mm'lik bir -kültür tabağına yerleştirilir nano yapı iskelesi için 1 x 10 4 hücrelerin etrafında Tohum 3 ve 7 gün için inkübe edilir.
- Floresein sonra diasetat (aseton içinde 5 mg / ml) (FDA), görüntüyü bir flüoresan mikroskop kullanılarak numuneleri kullanılarak Leke hücreleri. Spesifik olarak, kültür kabı FDA çözeltisi 100 ul ilave edildi ve 30 dakika inkübe edilir. Üç kez floresan görüntüleme önce PBS ile hücreleri yıkayın. Bizim daha önceki çalışmalarda 10 dayalı bir özelleştirilmiş mat-laboratuar programı ile hücre yönünü analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak, bir kuruluş gradyanı ile, bir elyaf matın oluşturulmuştur. Şekil 3, nano yapı iskelesi üzerinde farklı yerlerde alındığı SEM görüntülerini göstermektedir. Kalitatif olarak, bu 6 mm (Şekil 3D), rasgele bir lif karışımı göz 0 mm (Şekil 3A) tek eksenli olarak yerleştirilen fiberlerin bir ilerleme olduğu tespit edilebilir. FFT elyaf hizalama bir nicel değer verir, sayısal süreçlere özelliklerini 19 burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 0 mm sergileyen fiber hizalama gösterir ve 6 mm FFT model rastgele yönünü işaret FFT de lifler. Giderek rastgele lif birikimi (- C Şekil 3B) bir hizaya lif örgütten SEM görüntüleri net bir ilerleme (Şekil 3) vardır.
ADSCs nanolif iskele onların yere göre morfolojik değişiklikler yapıldı. Şekil 4 (Şekil 4E - H) - g> 3 gün (D Şekil 4A) floresan mikroskop (Zeiss) ile çekilen görüntüleri gösterir. kök hücre açısı dağılımı kantitatif özelleştirilmiş MATLAB programı tarafından değerlendirilir ve çeşitli mesafelerde Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak analiz edilmiştir. 4I farklı yerlerde hücre açısı dağılımı göstermektedir. 0 mm veya sıralanmış liflerden oluşan bölge içinde, hücrelerin% 70 nano üretim eksenine 20 ° içinde ortaya çıktı. Buna karşılık, ADSCs 20 ° içinde görünen hücrelerin sadece% 20 ile, bu organizasyon yapısını yoksun lif iskelelerinin rastgele bölümleri numaralı seribaşı. Son olarak, Kumarin 6 kullanılarak kimyasal degrade oluşumu - yüklü PCL lifleri floresan mikroskopi kullanılarak incelenmiştir. Kimyasal degrade niteliksel mikroskopi görüntü (Şekil 5A) kullanılarak teyit edildi. Görüntü artan Chemi doğruladıFloresan görüntünün giderek artan yoğunluğu ile sergilenir iskele karşısında cal konsantrasyon. Floresan yoğunluğunun (Resim J) (Şekil 5B) grafik iskele boyunca doğrusal büyüme sergileyen kimyasal konsantrasyon gradyanı teyit etmektedir.
Şekil 1: tek eksenli hizalanmış elyaf yüzey hazırlanması için deney düzeneği şematik gösterir.
Şekil 2 (A) gradyan iskele imalatı için ikinci bir şırınga pompası yerleştirilmesini gösterir. Kolektör üzerindeki maske (B) Yerleştirme. Bu rakam [10] Macromol yeniden basıldı olmuştur. Biosci., 12, Xie, J., anne, B., Michael, PL & Shuler, FD FabriFiber Örgütü ve Onların Potansiyel Uygulamaları bölmeli Nanolif iskelelerinin katyon. 1336-1341, Copyright 2012, Wiley-VCH izni ile.
Şekil 3: 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C) ve 6 mm (D), PCL sönmeyen nano iskele SEM görüntüleri. ikincil görüntüler Fourier hızlı aktarım desenleri (FFT) vardır. (A) 'Desen sıralanmış liflerden, (D) rasgele fiber birikmesini göstermektedir olmasıdır. Bu rakam [10] Macromol yeniden basıldı olmuştur. Biosci., 12, Xie, J., anne, B., Michael, PL & Shuler, Fiber Teşkilatı'nda geçişleri ve Onların Potansiyel Uygulamaları Nanolif iskelelerinin FD Fabrikasyon. 1336-1341, Copyright 2012, Wiley-VCH izni ile.
Figu5 re: Kumarin 6-alınmış bir lifler (A), floresan mikroskobu görüntüsü. (B), grafik iskele boyunca floresan yoğunluğunu gösterir. doğrusal bir artış iskele ile kimyasal konsantrasyonu kademeli değişim anlamına gelir. Bu rakam [10] Macromol yeniden basıldı olmuştur. Biosci., 12, Xie, J., anne, B., Michael, PL & Shuler, Fiber Teşkilatı'nda geçişleri ve Onların Potansiyel Uygulamaları Nanolif iskelelerinin FD Fabrikasyon. 1336-1341, Copyright 2012, Wiley-VCH izni ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Nebraska Medical Center ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (hibe sayısı 1R15 AR063901-01) Üniversitesi başlangıç fonlarından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
