Bioengineering

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

Published: April 19, 2015 doi: 10.3791/52626

Karl Khandalavala¹, Jiang Jiang¹, Franklin D. Shuler², Jingwei Xie¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center, ²Department of Orthopedic Surgery, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

Summary

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Introduction

Las nanofibras son una utilidad popular para la ingeniería de tejidos debido a su capacidad para imitar la matriz extracelular en su estructura y tamaño relativo ^1. Sin embargo, algunas interfaces de tejidos nativos, tales como el sitio de inserción del tendón en el hueso, contienen fibras de colágeno, que exhiben una estructura organizativa variable que aumenta en alineación hacia el tendón y disminuye en el sitio de hueso ^2-5. Por lo tanto, para la regeneración de tejidos eficaz hay una necesidad de fabricar un andamio que podrían imitar eficazmente este gradiente estructural.

Anteriormente, ha habido una investigación llevada a cabo sobre los cambios graduales en la composición de la fibra, concretamente, el contenido mineral ^6. Sin embargo, volver a crear el componente estructural de los tejidos conectivos sigue siendo en gran parte inexplorado. Un estudio anterior examinó gradientes morfológicos mediante el estudio del efecto de la densidad de las partículas de sílice superficie sobre la proliferación de los osteoblastos de calota de rata y se encontró un Inverrelación entre la densidad se partícula de sílice y la proliferación celular ^7. Pero los cambios morfológicos que mediaron la proliferación celular en trabajos anteriores fueron en su mayoría relacionados con la rugosidad superficial que carecen de la capacidad en la imitación de los cambios organizativos de fibra de ^7,8. Un estudio reciente intentó fabricar un andamio que imitaba las orientaciones únicas fibras de colágeno mediante el uso de una novela colector para electrospinning ^9. Si bien este estudio logró producir un andamio con fibras tanto alineados y aleatorios, no logró imitar los cambios graduales que se exhiben en los tejidos nativos. También, en la producción de componentes separados, con un cambio inmediato de alineado con orientación aleatoria, las propiedades biomecánicas de este andamio disminuyeron significativamente. Sin el trabajo previo ha sido capaz de producir nanofibras andamios aplicables con gradaciones continuas en orientaciones de las fibras de alineado y al azar. Nuestro estudio reciente ha demostrado la recreación exitosa de nanofibras andamioscon gradaciones en la organización de fibra que potencialmente pueden imitar la organización de colágeno nativo en la inserción del tendón al hueso ^10. Este trabajo tiene como objetivo presentar los protocolos utilizados para la producción de nanofibras andamios con una estructura que se asemeja mucho a la de organización de las fibras en la interfaz nativa del tejido del tendón al hueso.

Estructuras de nanofibras Gradient han potencialmente aplicaciones en una variedad de campos de gran alcance. Nos centramos en las aplicaciones a la ingeniería de tejidos de la zona de inserción del tendón al hueso mediante la combinación de nuestros andamios con células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) que ya se utilizan para la regeneración de tejidos en varios sustratos ^11-14. Además, ADSC son de naturaleza muy similar a las células madre de médula ósea en términos de multipotencia y su recurso es abundante que puede ser cosechada usando un simple ^15,16 procedimiento de liposucción. Siembra de estas células a los andamios nanofibras graduadas mejora aún más su tisdemandar aplicaciones de ingeniería al permitir la distribución controlada de las células que potencialmente pueden diferenciarse en diversos tejidos. Además de la siembra de células madre, las nanofibras se pueden encapsular con moléculas de señalización para la regulación de la respuesta celular. El acoplamiento de nanoencapsulación con el gradiente de la organización de estos andamios permite el estudio del comportamiento celular o posibles diseños de implantes y recubrimientos. La encapsulación de moléculas funcionales como la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), que se ha demostrado que induce la diferenciación de osteoblastos ^15,16, podría mejorar aún más las aplicaciones de ingeniería de tejidos de estos andamios ^10.

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Protocol

1. Preparación de la Solución

Preparar una solución de poli (ε-caprolactona) (PCL) (M _w = 80.000 g / mol) a una concentración aproximada de 100 mg / ml. Disolver PCL en una mezcla de diclorometano (DCM) y N, N-dimethlyformamide (DMF) en una proporción de 4: 1 (v / v) con una concentración de 10% (w / v).
Colocar la solución en un tubo de vidrio de 20 ml para la mezcla. Coloque el tubo de vidrio en limpiador ultrasónico durante 30 minutos, o hasta que la solución es transparente.

2. Aparato Preparación

Añadir la solución de PCL preparado en una jeringa de 5 ml con una aguja roma de calibre 21 adjunta.
Coloque bomba de jeringa en una posición electrospinning vertical, según la figura 1.
Utilice un colector de acero inoxidable hueco con un espacio abierto de 2 cm x 5 cm para el sustrato de fibra alineados. Coloque el colector de 12 cm desde la punta de la aguja.
Conecte la fuente de la corriente continua (DC) de suministro de alta tensión a laaguja y tierra el colector. Asegúrese de que el colector está conectado a tierra de forma individual, sin contacto con el otro equipo de laboratorio.

3. electrospinning

Conjunto bomba de jeringa a 1,50 ml / hora, hasta que las gotas que forman en la punta de la aguja se reemplazan inmediatamente cuando se retiran. A continuación, establezca el caudal de 0,50 ml / hr.
Gire el operador de tensión a 12 kV.
Electrospin hasta que las fibras uniaxialmente alineadas cubrir completamente la brecha en el colector.
Aplique el pegamento a los bordes de una placa de vidrio pequeño y transferir las fibras desde el colector de vacío a la placa de vidrio. Coloque la placa de vidrio en la parte superior de una pieza de papel de aluminio que tiene el mismo tamaño que la placa de vidrio y se pone a tierra.
Coloque el segundo colector de jeringa de acuerdo con la Figura 3.
Coloque la máscara de plástico a la segunda bomba de jeringa y colocarla 2 mm por encima del colector.
Añadir cumarina 6 al 1% (w / w) a la solución de PCL-nan sioencapsulation es desear, y mezclar hasta que la solución esté transparente.
Cargue el PCL o PCL / cumarina solución 6 en una aguja de 5 ml con una aguja roma de calibre 21. Establecer bomba vertical a 0,50 ml / hr y horizontal para tirar a las 9 ml / ho a una velocidad aproximada de 1 mm / min.
Electrospin hasta que la máscara se ha movido casi completamente fuera del colector, pero con la zona de borde todavía bajo la máscara.

4. Caracterización de fibra

Colocar las muestras de cinta conductora de doble cara para el perno metálico y la capa de platino durante 40 segundos usando un revestidor por bombardeo iónico a 40 mA.
1. Examinar fibras a través de microscopio electrónico de barrido (SEM) de acuerdo con nuestros estudios anteriores ^17,18.
2. Recoger imágenes a un voltaje de aceleración de 15 kV.
Realizar un análisis rápido transformada de Fourier (FFT) en una muestra de fibra separada para medir la alineación de la fibra. La información detallada sobre la medición de alineación de la fibra por FFT puede referirse to estudios previos ^19,20.

5. Las células madre de la siembra.

Esterilizar las muestras de fibras por inmersión en una solución de etanol al 70% durante 2 horas. A continuación, lavar las fibras con agua destilada para eliminar cualquier contaminante.
Obtener ADSC humanos y células de cultivo en un matraz de 25 ^cm2 a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire / 5% de CO _2. Cambiar el medio de cultivo celular cada otro día ^10.
Tripsinizar las células y contar el número de células. Específicamente, eliminar todo el medio de cultivo del matraz de cultivo celular y se lavan las células con tampón fosfato salino (PBS) dos veces. A continuación, añadir 1 m ^l de una solución 0,25% de tripsina-EDTA (pre-calentamiento en baño de agua a 37 ° C) para cubrir la monocapa de células y se incuba el matraz en la incubadora de cultivo celular durante 2-3 minutos. Añadir 4 ml de medio de cultivo y lavar todas las células de la superficie pipeteando el medio en toda la superficie. º Centrifugar la suspensión de células y re-dispersasedimento celular e en el medio de cultivo. Contar las células a través de hemocitómetro. Semilla de alrededor de 1 × 10 ⁴ células a la estructura de nanofibras se coloca en un plato -cultura 35 mm e incubar durante 3 y 7 días.
Células manchas usando diacetato de fluoresceína (5 mg / ml en acetona) (FDA), entonces la imagen de las muestras usando un microscopio de fluorescencia. Específicamente, añadir 100 l de solución de la FDA para la placa de cultivo y se incuba durante 30 min. Lavar las células con PBS tres veces antes de imágenes fluorescentes. Analizar la orientación celular mediante un programa mat-laboratorio personalizado basado en nuestros estudios previos ^10.

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Representative Results

Usando este protocolo, se formó una estera de fibra con un gradiente de organización. La Figura 3 muestra las imágenes SEM tomadas en varios lugares de la estructura de nanofibras. Cualitativamente, se puede determinar que hay una progresión de las fibras uniaxialmente alineadas en 0 mm (Figura 3A) para una variedad de fibra al azar en 6 mm (Figura 3D). La FFT da un valor cuantitativo a la alineación de la fibra, detalles sobre los procesos cuantitativos se detallan aquí ^19. Las fibras a 0 mm exhiben una FFT que indica la alineación de la fibra, ya los 6 mm el patrón FFT significa una orientación aleatoria. Hay una clara progresión en las imágenes SEM (figura 3) de una organización de fibra alineado a una deposición de fibras cada vez más al azar (Figura 3B - C).

ADSC sufrieron cambios morfológicos en función de su ubicación en la estructura de nanofibras. Figura 4 (Figura 4A - D) y 7 días (Figura 4E - H). La distribución del ángulo de células madre se evaluó cuantitativamente por un programa MATLAB personalizada y se analizó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov a varias distancias. Figura 4I muestra la distribución del ángulo de células en diferentes lugares. A 0 mm, o la región de fibras alineadas, el 70% de las células apareció dentro de los 20 ° del eje de la fabricación de nanofibras. En contraste, las ADSC sembraron en las partes aleatorias de los andamios de fibra carecido de esta estructura organizativa, con sólo el 20% de las células que aparecen dentro de los 20 °. Por último, la formación del gradiente químico utilizando cumarina 6 - Se estudió fibras PCL cargados mediante microscopía de fluorescencia. El gradiente químico se confirmó cualitativamente utilizando la imagen de microscopía (Figura 5A). La imagen confirma la creciente químicoconcentración de cal través del armazón, que se exhibe por la cada vez mayor intensidad de la imagen fluorescente. La gráfica de la intensidad de fluorescencia (Image J) (Figura 5B) confirma el gradiente de la concentración química al mostrar un crecimiento lineal a través del andamio.

Figura 1: Muestra el esquema de la configuración experimental para la preparación del sustrato de fibra uniaxialmente alineadas.

Figura 2: (A) muestra la colocación de la segunda bomba de jeringa para la fabricación del andamio gradiente. (B) La colocación de la máscara sobre el colector. Esta cifra ha sido reimpreso de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL y Shuler, FD Fabricación de nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra y sus aplicaciones potenciales. 1336-1341 Copyright 2012, con permiso de Wiley-VCH.

Figura 3: Imágenes de SEM de la estructura de nanofibras PCL gradated a 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C), y 6 mm (D). Las imágenes secundarias son patrones de transferencia de Fourier rápida (FFT). Patrón en (A) es el de fibras alineadas, (D) sugiere la deposición de fibras al azar. Esta cifra ha sido reimpreso de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL y Shuler, FD fabricación de nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra y sus aplicaciones potenciales. 1336-1341 Copyright 2012, con permiso de Wiley-VCH.

Figura 4: Imágenes de microscopía de fluorescencia que muestra ADSC después de la incubación durante 3 días (A - D) y 7 días (E - H). Imágenes muestran las distintas morfologías de ADSC en diferentes lugares del andamio de tono. (I): La distribución de los ángulos de células en diferentes lugares de andamios. Las células fueron mucho más concentrados entre 20 ° del eje de alineación de nanofibras de fibras alineadas (0 mm). Esta cifra ha sido reimpreso de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL y Shuler, FD fabricación de nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra y sus aplicaciones potenciales. 1336-1341 Copyright 2012, con permiso de Wiley-VCH.

Figura 5
Figure 5: (A) Imagen de microscopía de fluorescencia de fibras de cumarina 6 encapsulados. (B) El gráfico muestra la intensidad de fluorescencia a través del andamio. El aumento lineal significa un cambio gradual en la concentración química a través del andamio. Esta cifra ha sido reimpreso de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL y Shuler, FD fabricación de nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra y sus aplicaciones potenciales. 1336-1341 Copyright 2012, con permiso de Wiley-VCH.

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Acknowledgments

Esta obra fue financiada en parte con fondos de puesta en marcha de la Universidad de Nebraska Medical Center y el Instituto Nacional de Salud (número de concesión 1R15 AR063901-01).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2