Summary
Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.
Introduction
Nanovezels zijn een populaire programma voor weefselregeneratie vanwege hun vermogen om de extracellulaire matrix in de structuur en relatieve grootte 1 nabootsen. Sommige natief weefsel interfaces, zoals de pees te bone insertieplaats bevatten collageenvezels, die een variabele organisatiestructuur die toeneemt in aanpassing aan de pees en vermindert de botplaats 2-5 vertonen. Dus, effectieve weefselregeneratie er behoefte aan een scaffold die effectief deze structurele verloop kan nabootsen fabriceren.
Eerder is er onderzoek gedaan naar geleidelijke veranderingen in vezelsamenstelling, specifiek mineraalgehalte 6. Echter, herscheppen van de structurele component van bindweefsel blijft grotendeels onontgonnen. Een eerdere studie onderzocht morfologische verlopen door het bestuderen van het effect van oppervlakte silica deeltjesdichtheid op de proliferatie van rat calvarial osteoblasten en vond een inverse verhouding tussen siliciumoxide deeltjesdichtheid en celproliferatie 7. Maar de morfologische veranderingen die celproliferatie gemedieerde in eerdere werk waren meestal gerelateerd aan oppervlakte-ruwheid ontbreekt het vermogen in het nabootsen van vezels organisatorische 7,8 veranderingen. Een recente studie geprobeerd om een steiger die de unieke collageen vezeloriëntaties nagebootst met behulp van een nieuwe collector voor elektrospinnen 9 fabriceren. Hoewel deze studie geslaagd in het produceren van een steiger met zowel uitgelijnd en willekeurige vezels, is het niet aan de geleidelijke veranderingen tentoongesteld in de inheemse weefsels na te bootsen. Ook in het produceren van afzonderlijke componenten, met een onmiddellijke verandering van afgestemd op willekeurige oriëntatie, de biomechanische eigenschappen van deze steiger aanzienlijk afgenomen. Geen eerdere werk heeft kunnen toepasselijke nanovezel steigers te produceren met continue gradaties in vezeloriëntaties uit uitgelijnd en willekeurige geweest. Onze recente studie heeft aangetoond succesvol recreatie van nanovezel steigersmet gradaties aan vezels organisatie die mogelijk de inheemse collageen organisatie op pees-to-bone inbrengen 10 kan nabootsen. Dit werk beoogt de protocollen voor de productie van nanovezels scaffolds met een structuur die lijkt op die van vezels organisatie in de natieve pees naar botweefsel-interface aanwezig.
Gradiënt nanovezel structuren zijn mogelijk verregaande toepassingen in een verscheidenheid van terreinen. We concentreerden ons op de applicaties om tissue engineering van de pees-to-bone inbrengen site door het combineren van onze steigers met-vet-afgeleide stamcellen (ADSCs) die al worden gebruikt voor weefselregeneratie op diverse ondergronden 11-14. Daarnaast ADSCs zijn zeer vergelijkbaar in de natuur te beenmerg stamcellen in termen van multipotentie en hun bron is er in overvloed die kan worden geoogst met behulp van een eenvoudige liposuctie procedure 15,16. Zaaien deze cellen te gradated nanovezel steigers verder verbetert hun tissue technische toepassingen door de gecontroleerde verdeling van de cellen die potentieel kunnen differentiëren in verschillende weefsels. In aanvulling op het zaaien van stamcellen, kunnen nanovezels worden ingekapseld met signaalstoffen voor de regulatie van cellulaire respons. Koppeling nanoencapsulation de organisatorische verloop van deze scaffolds maakt voor de studie van cellulaire gedrag of mogelijke implantaatontwerpen en coatings. Inkapseling van functionele moleculen zoals bone morphogenetic protein 2 (BMP2), waarvan is aangetoond dat osteoblastdifferentiatie 15,16 induceren, zou verdere versterking van de tissue engineering toepassingen van deze scaffolds 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Oplossing
- Bereid een oplossing van poly (ε-caprolacton) (PCL) (Mw = 80.000 g / mol) bij een concentratie van ongeveer 100 mg / ml. Los PCL in een mengsel van dichloormethaan (DCM) en N, N-dimethlyformamide (DMF) in een verhouding van 4: 1 (v / v) met een concentratie van 10% (w / v).
- Plaats de oplossing in een 20 ml glazen buis voor het mengen. Plaats glazen buis in ultrasone reiniger voor 30 minuten, of tot de oplossing is doorzichtig.
2. Inrichting Voorbereiding
- Voeg de bereide PCL-oplossing in een 5 ml spuit met een 21 gauge stompe naald.
- Plaats spuitpomp verticaal electrospinning positie volgens figuur 1.
- Gebruik een RVS-gap collector met een open ruimte van 2 cm x 5 cm voor de lijn vezelsubstraat. Plaats de collector 12 cm vanaf de punt van de naald.
- Sluit de gelijkstroom (DC) High Voltage stroomtoevoer naar denaald en aard de verzamelaar. Zorg ervoor dat de collector individueel geaard is met geen contact met de andere lab-apparatuur.
3. Electrospinning
- Set injectiepomp tot 1,50 ml / uur, totdat de druppels die aan de naaldtip worden onmiddellijk vervangen bij het verwijderen. Stel vervolgens het debiet tot 0,50 ml / uur.
- Draai de spanning operator 12 kV.
- Electrospin totdat de eenassig uitgelijnde vezels volledig bedekken de kloof op de collector.
- Breng lijm op de randen van een kleine glazen plaat en breng de vezels uit de spleet collector naar de glasplaat. Plaats de glasplaat boven op een stuk aluminiumfolie die dezelfde grootte als de glazen plaat en is geaard.
- Plaats de tweede spuit collector volgens figuur 3.
- Bevestig de plastic masker om de tweede spuit pomp en plaats het 2 mm boven de collector.
- Voeg cumarine 6 1% (w / w) om de PCL-oplossing als nanoencapsulation is gewenst- en meng tot de oplossing doorzichtig.
- Laad de PCL of PCL / Coumarine 6 oplossing in een 5 ml naald met een stompe naald van 21 gauge. Stel verticale pomp 0,50 ml / uur en horizontaal trekken aan 9 ml / uur of bij een snelheid van ongeveer 1 mm / min.
- Electrospin totdat het masker bijna volledig verplaatst buiten de collector, maar het randgebied nog onder het masker.
4. karakteriseren van glasvezels
- Leg monsters met dubbelzijdige geleidende tape om de metalen stud en jas met platina voor 40 sec met een sputter coater op 40 mA.
- Onderzoek vezels door scanning elektronenmicroscoop (SEM) volgens onze eerdere studies 17,18.
- Verzamel beelden met een versnellingsspanning van 15 kV.
- Voer fast Fourier transformatie (FFT) -analyse op een afzonderlijke vezel monster vezel uitlijning te meten. De gedetailleerde informatie over het meten van glasvezel uitlijning door FFT kan t verwijzeno eerdere studies 19,20.
5. Seeding Stem Cells.
- Steriliseer de vezel monsters in een bad met 70% ethanol oplossing gedurende 2 uur. Was daarna de vezels met gedestilleerd water om eventuele verontreinigingen te verwijderen.
- Verkrijgen menselijke ADSCs en cultuur cellen in een 25 cm2 kolf bij 37 ° C in een atmosfeer van 95% lucht / 5% CO2. Verander het celkweekmedium om de andere dag 10.
- Trypsinize de cellen en tel het aantal cellen. Specifiek, verwijder alle kweekmedium uit de celkweek kolf en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal. Voeg dan 1 m l een 0,25% trypsine-EDTA-oplossing (vooraf warm waterbad tot 37 ° C) tot de cel monolaag bedekken en incubeer de kolf in de celkweek incubator gedurende 2-3 minuten. Voeg 4 ml kweekmedium en was alle cellen van het oppervlak door pipetteren het medium in het oppervlak. Centrifugeer de celsuspensie en opnieuw dispergeren the celpellet in het kweekmedium. Tellen cellen via hemacytometer. Zaad ongeveer 1 × 10 4 cellen naar de nanovezel schavot geplaatst in een 35 mm -cultuur schotel en incubeer gedurende 3 en 7 dagen.
- Stain cellen met fluoresceïne diacetaat (5 mg / ml in aceton) (FDA) dan beeld de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Specifiek, voeg 100 ul FDA oplossing van de kweekschaal en incubeer gedurende 30 minuten. Was de cellen met PBS drie keer voordat fluorescerende beeldvorming. Analyseer cel oriëntatie door een aangepaste mat-lab-programma op basis van onze eerdere studies 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met dit protocol, een vezelmat met een organisatorische gradiënt werd gevormd. Figuur 3 toont de SEM beelden die op verschillende locaties op de nanovezel schavot. Kwalitatief kan worden vastgesteld dat er een overgang van het uniaxiaal uitgelijnde vezels bij 0 mm (figuur 3A) om een willekeurige vezel assortiment 6 mm (Figuur 3D). De FFT geeft een kwantitatieve waarde voor de vezel uitlijning details over de kwantitatieve processen gedetailleerd hier 19. Vezels bij 0 mm vertonen een FFT dat glasvezel uitlijning aangeeft, en op 6 mm van de FFT patroon betekent een willekeurige oriëntatie. Er is een duidelijke vooruitgang in de SEM beelden (figuur 3) van een uitgelijnde vezelorganisatie een steeds willekeurige vezeldepositie (Figuur 3B - C).
ADSCs onderging morfologische veranderingen op basis van hun locatie in het nanovezel schavot. Figuur 4 (Figuur 4A - D) en 7 dagen (Figuur 4E - H). De verdeling van de stamcellen hoek werd kwantitatief bepaald door een aangepaste MATLAB programma en met de Kolmogorov-Smirnov-test op verschillende afstanden geanalyseerd. Figuur 4I toont de verdeling van cel hoek op verschillende locaties. Bij 0 mm of regio uitgelijnde vezels, 70% van de cellen zich binnen 20 ° van de as van nanovezel fabricage. In tegenstelling, de ADSCs geënt op willekeurige gedeelten van de vezel steigers ontbrak dit organisatiestructuur, met slechts 20% van de cellen opgenomen in 20 °. Tenslotte, de vorming van de chemische gradiënt coumarine 6 - loaded PCL vezels werd bestudeerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. De chemische gradiënt werd kwalitatief bevestigd met behulp van de microscopie afbeelding (figuur 5A). Het beeld bevestigt de toenemende Chemical concentratie over de steiger, die wordt tentoongesteld door de gestaag toenemende intensiteit van de tl-afbeelding. De grafiek van de fluorescentie-intensiteit (Afbeelding J) (Figuur 5B) bevestigt het verloop van de chemische concentratie vertoont een lineaire groei in de scaffold.
Figuur 1: toont het schema van experimentele opstelling voor de bereiding van de uniaxiaal uitgelijnd vezelsubstraat.
Figuur 2: (A) toont de plaatsing van de tweede spuit pomp voor de vervaardiging van het verloop steiger. (B) Plaatsing van het masker boven de collector. Dit cijfer is overgenomen uit [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabricatie van Nanovezel Steigers Met gradaties in Fiber Organisatie en hun mogelijke toepassingen. 1336-1341, Copyright 2012, met toestemming van Wiley-VCH.
Figuur 3: SEM beelden van de PCL gradated nanovezel steiger op 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C), en 6 mm (D). De secundaire beelden zijn Fourier snelle overdracht patronen (FFT). Patroon in (A) is die van uitgelijnde vezels, (D) geeft willekeurige vezeldepositie. Dit cijfer is overgenomen uit [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabricage van Nanovezel Steigers Met gradaties in Fiber Organisatie en hun mogelijke toepassingen. 1336-1341, Copyright 2012, met toestemming van Wiley-VCH.
FiguAd 5: (A) Fluorescentie microscopie beeld van Coumarin 6-ingekapselde vezels. (B) De grafiek toont de fluorescentie-intensiteit over het schavot. De lineaire toename betekent een geleidelijke verandering in de chemische concentratie door het schavot. Dit cijfer is overgenomen uit [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabricage van Nanovezel Steigers Met gradaties in Fiber Organisatie en hun mogelijke toepassingen. 1336-1341, Copyright 2012, met toestemming van Wiley-VCH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het opstarten van fondsen van de Universiteit van Nebraska Medical Center en het National Institute of Health (subsidie aantal 1R15 AR063901-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
