Elektrospunnede nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organization

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å dikte elektrospunnede nanofiber stillasene med graderte organisering av fiber og utforske sine applikasjoner i å regulere cellemorfologi / orientering. Gradienter med hensyn til fysiske og kjemiske egenskaper av nanofiber stillasene tilbyr et bredt utvalg av applikasjoner i biomedisinske feltet.

Introduction

Nanofibers er populære verktøy for regenerering av vev på grunn av deres evne til å etterligne den ekstracellulære matriks i sin struktur og relative størrelse ^1. Men noen opprinnelige vev-grensesnitt, for eksempel sene-knokkel-innføringssted, inneholde kollagenfibre, som oppviser en variabel organisasjonsstruktur som øker i flukt mot sene og avtar på benet området ^2-5. Så, for effektiv regenerering av vev er det behov for å fremstille et stillas som effektivt kunne etterligne denne strukturelle gradient.

Tidligere har det vært foretatt forskning på gradvise endringer i fibersammensetningen, spesielt mineralinnhold ^6. Imidlertid gjenskape den strukturelle komponenten av bindevev forblir stort sett uutforsket. En tidligere studie undersøkte morfologiske gradienter ved å studere effekten av overflaten silika partikkeltetthet på spredning av rotte calvarial osteoblaster og fant en inverterse sammenhengen mellom silika partikkeltetthet og celleproliferasjon ^7. Men de morfologiske endringer som medierte celleproliferasjon i tidligere arbeid var for det meste relatert til overflaten ruhet mangler evnen i hermet fiberorganisasjonsendringer ^7,8. En fersk studie forsøkt å dikte et stillas som etterlignet den unike kollagen fiber orientering ved hjelp av en roman oppsamler for electro ^9. Selv om denne studien lykkes i å produsere et stillas med både justert og tilfeldige fiber, klarte det å etterligne de gradvise endringer utstilt i de innfødte vev. Også, i å produsere separate komponenter, med en umiddelbar endring fra justert til tilfeldig orientering, biomekaniske egenskapene til dette stillaset sunket betraktelig. Ingen tidligere arbeid har vært i stand til å produsere gjeldende nanofiber stillasene med kontinuerlige graderinger i fiber orienteringer fra aligned og tilfeldig. Vår fersk studie har vist vellykket rekreasjon av nanofiber stillasermed graderinger i fiber organisasjon som potensielt kan etterligne den opprinnelige kollagen organisasjon på sene-til-ben innsetting ^10. Dette arbeidet tar sikte på å presentere de protokollene som brukes til produksjon av nanofiber stillasene med en struktur som minner sterkt om fiber organisasjon i mors sene-til-benvev grensesnitt.

Gradient nanofiber strukturer har potensielt vidtrekkende applikasjoner på tvers av en rekke felt. Vi fokuserte på søknadene til tissue engineering av den sene-til-ben innstikkstedet ved å kombinere våre stillaser med adipose-avledet stamceller (ADSCs) som allerede benyttes for vev regenerering på ulike underlag ^11-14. I tillegg ADSCs er svært like i naturen til benmarg stamceller i form av multipotency og deres ressurs er rikelig som kan høstes ved hjelp av en enkel fettsuging prosedyre ^15,16. Seeding disse cellene til graderte nanofiber stillaser ytterligere forbedrer sin tissaksøke tekniske applikasjoner ved å tillate for kontrollert distribusjon av cellene som potensielt kan differensiere i ulike vev. I tillegg til såing stamceller, kan nanofibers innkapsles med signalmolekyler for regulering av cellulær respons. Kobling nanoencapsulation med organisasjons gradient av disse stillasene åpner for studiet av mobilnettet atferd eller mulige implantat design og belegg. Innkapsling av funksjonelle molekyler som benmorfogenetisk protein 2 (BNIP2), som er blitt vist å indusere osteoblastdifferensierings ^15,16, ytterligere kan forbedre vev tekniske anvendelser av disse stillaser ^10.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsningen

1. Fremstille en løsning av poly (ε-kaprolakton) (PCL) _(Mw = 80000 g / mol) ved en omtrentlig konsentrasjon på 100 mg / ml. Oppløs PCL i en blanding av diklormetan (DCM) og N, N-dimetylformamid (DMF) i et forhold på 4: 1 (v / v) med en konsentrasjon på 10% (w / v).
2. Plassere løsningen i et 20 ml glassrør for blanding. Plasser glassrør inn i ultralydrenser i 30 minutter, eller inntil oppløsningen er gjennomskinnelig.

2. Innretning Forberedelse

1. Tilsett fremstilt PCL-løsning i en 5 ml sprøyte med en 21 måler stump kanyle.
2. Plasser sprøyten pumpen i vertikal electro stilling, i henhold til figur 1.
3. Bruk en rustfritt stål-gap samler med en åpen plass på 2 cm x 5 cm for den justert fiber underlaget. Plasser samleren 12 cm fra nålespissen.
4. Koble likespenning (DC) High Voltage strømforsyningen tilnål og jorde kollektoren. Sikre at kollektoren er individuelt jordet uten kontakt til den andre laboratorieutstyr.

3. electro

1. Sett sprøytepumpe til 1,50 ml / time, inntil dråpene danner på nålespissen er umiddelbart erstattet når den fjernes. Deretter stiller strømningshastigheten til 0,50 ml / time.
2. Dreies spennings operatør til 12 kV.
3. Electrospin inntil de uniaksialt orienterte fibre fullstendig å dekke åpningen på kollektor.
4. Påføre lim på kantene av en liten glassplate og overføre fibrene fra spalten kollektoren til glassplaten. Plasser glassplate på toppen av et stykke av aluminiumfolie som har samme størrelse som den glassplate og er jordet.
5. Plassere det andre sprøytesamleren i henhold til figur 3.
6. Fest plast masken til andre sprøytepumpen og plasser den 2 mm over samleren.
7. Legg Kumarin 6 ved 1% (w / w) til PCL-oppløsning hvis nanoencapsulation er desired- og blandes inntil løsningen er gjennomskinnelig.
8. Laste PCL eller PCL / Kumarin seks løsning i en 5 ml nål med en stump 21 gauge nål. Sett vertikal pumpe til 0,50 ml / time og horisontale å trekke på 9 ml / time, eller ved en omtrentlig hastighet på 1 mm / min.
9. Electrospin før masken har beveget seg nesten helt av kollektoren, men med kantområdet fremdeles under masken.

4. Fiber Karakterisering

1. Plasser prøver med dobbeltsidig ledende tape til den metalliske stud og frakk med platina i 40 sekunder ved hjelp av en frese belegger ved 40 mA.
   1. Undersøke fibre gjennom scanning elektronmikroskop (SEM) i henhold til vår tidligere studier ^17,18.
   2. Samle bilder ved en akselererende spenning på 15 kV.
2. Utføre hurtig Fourier-transformasjon (FFT) analyse på en separat fiberprøve for å måle fiber innretting. Detaljert informasjon om måling av fiber justering av FFT kan referere to tidligere studier ^19,20.

5. Seeding stamceller.

1. Steril ble fiberprøvene ved bløtlegging i en 70% etanolløsning i 2 timer. Deretter vaskes fibrene med destillert vann for å fjerne eventuelle forurensninger.
2. Skaffe humane ADSCs og kulturcellene i en 25 ^cm2 kolbe ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft / 5% _CO2. Endre celledyrkingsmedium annenhver dag ^10.
3. Trypsineres cellene, og telle antall celler. Nærmere bestemt, fjerne alle kulturmedium fra cellekulturkolbe og vaske cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) to ganger. Deretter tilsett 1 m ^l av en 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning (pre-varme i vannbad til 37 ° C) for å dekke cellemonolaget og inkuber i kolben i cellekulturinkubator i 2-3 minutter. Tilsett 4 ml kulturmedium og vaske ut alle cellene fra overflaten ved pipettering av mediet over overflaten. Sentrifuger cellesuspensjonen og re-spre the cellepelleten i kulturmediet. Telle celler via hemacytometer. Frø rundt 1 × 10 ⁴ celler til nanofiber stillaset plassert i en 35 mm -Kultur fatet og inkuberes i 3 og 7 dager.
4. Beis cellene ved hjelp av fluorescein-diacetat (5 mg / ml i aceton) (FDA) og deretter bilde prøvene ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Nærmere bestemt, tilsett 100 ul av FDA løsning på kulturskål og inkuberes i 30 min. Vask celler med PBS tre ganger før fluorescerende bildebehandling. Analysere celle orientering av en tilpasset matte-lab program basert på våre tidligere studier ^10.

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen, ble en fibermatte med en organisatorisk gradient dannet. Figur 3 viser SEM bilder tatt på forskjellige steder på nanofiber stillaset. Kvalitativt, kan det bestemmes at det er en progresjon fra de uniaksialt orienterte fibre ved 0 mm (figur 3A) til en tilfeldig fiber sortiment på 6 mm (figur 3D). FFT gir en kvantitativ verdi for den fiberinnrettings, detaljene på de kvantitative fremgangsmåter er beskrevet her ^19. Fibrene ved 0 mm utstillings en FFT som indikerer fiber justering og 6 mm FFT mønster innebærer en tilfeldig orientering. Det er en klar progresjon i SEM-bilder (Figur 3) fra et orientert fiber organisering til en mer tilfeldig fiberavsetning (figur 3B - C).

ADSCs gikk morfologiske endringer basert på deres plassering i nanofiber stillaset. Figur 4 (Figur 4A - D) og 7 dager (Figur 4E - H). Fordelingen av stamcellevinkelen ble kvantitativt vurdert av en tilpasset MATLAB program og analysert ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov test på ulike avstander. Figur 4I viser fordelingen av celle vinkel på forskjellige steder. Ved 0 mm, eller området av innrettede fibre, 70% av cellene viste seg innen 20 ° til aksen av nanofiber fabrikasjon. I motsetning til dette ADSCs podet på de tilfeldige partier av fiberstillasene manglet denne organisasjonsstruktur, med bare 20% av cellene som opptrer i løpet av 20 °. Endelig, dannelsen av den kjemiske gradient ved hjelp Kumarin 6 - ble ladet PCL fibre studert ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Kjemisk gradient ble kvalitativt bekreftet ved hjelp av mikroskopi bilde (Figur 5A). Bildet bekrefter den økende kjemical konsentrasjon på tvers av stillaset, som oppvises av den stadig økende intensitet av det fluoriserende bilde. Grafen til den fluorescerende intensitet (Bilde J) (figur 5B) bekrefter gradient av den kjemiske konsentrasjon ved oppviser en lineær vekst over hele stillaset.

Figur 1: Viser skjematisk av eksperimentelle oppsettet for fremstilling av uniaksialt orientert fiber substrat.

Figur 2 (a) viser plassering av den andre sprøytepumpe for fabrikasjon av gradienten stillaset. (B) Plassering av masken over kollektoren. Dette tallet har blitt gjengitt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikasjon av nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organisering og deres potensielle Applications. 1336-1341, Copyright 2012, med tillatelse fra Wiley-VCH.

Figur 3: SEM bilder av PCL graderte nanofiber stillaset ved 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C), og 6 mm (D). De sekundære bilder er Fourier rask overføring mønstre (FFT). Mønsteret ved (A) er det av innrettede fibre, (D) antyder tilfeldig fiberavsetning. Dette tallet har blitt gjengitt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikasjon av nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organisasjon og deres potensielle bruksområder. 1336-1341, Copyright 2012, med tillatelse fra Wiley-VCH.

Figur 4: fluorescensmikroskopi bilder som viser ADSCs etter inkubering i 3 dager (A - D) og 7 dager (E - H). Bilder utviser de ulike morfologi av ADSCs på forskjellige steder i den graderte stillaset. (I): Fordelingen av celle vinkler på forskjellige steder av stillaser. Celler ble mye mer konsentrert mellom 20 ° til aksen av nanofiber innretting på innrettede fibre (0 mm). Dette tallet har blitt gjengitt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikasjon av nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organisasjon og deres potensielle bruksområder. 1336-1341, Copyright 2012, med tillatelse fra Wiley-VCH.

Figure 5: (A) Fluorescensmikroskopi bilde av Kumarin 6-innkapslede fibre. (B) Grafen viser den fluorescerende intensitet over hele stillaset. Den lineære økning betegner en gradvis forandring i den kjemiske konsentrasjonen gjennom stillaset. Dette tallet har blitt gjengitt fra [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrikasjon av nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organisasjon og deres potensielle bruksområder. 1336-1341, Copyright 2012, med tillatelse fra Wiley-VCH.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2