Summary
ここでは、繊維のグラデーション組織とのエレクトロスピンナノファイバー足場を作製し、細胞形態/方向を調節することでアプリケーションを探求するプロトコルを提示する。ナノファイバー足場の物理的および化学的性質に関して勾配が生物医学分野での幅広い用途を提供する。
Introduction
ナノファイバーは、その構造および相対的な大きさ1で、細胞外マトリックスを模倣する能力の組織工学のための人気のユーティリティである。しかし、このような腱から骨挿入部位のようないくつかの天然の組織界面は、腱に向かって整列して増加し、骨部位2-5で減少する可変の組織構造を示すコラーゲン線維を含む。そこで、効果的な組織再生のための効果的な構造勾配を模倣し得る足場を作製する必要がある。
以前は、具体的には、ミネラル含有量6ファイバー組成が徐々に変化に行われた研究があった。しかし、結合組織の構造成分を再現することは、主に未踏のまま。以前の研究は、ラット頭蓋冠骨芽細胞の増殖に対する表面のシリカ粒子密度の効果を研究することによって、形態学的勾配を調べ、インバーを発見シリカ粒子密度及び細胞増殖7とそれの関係。しかし、以前の研究では、細胞増殖を媒介する形態学的変化は、繊維組織変更7,8を模倣で能力を欠いている粗さを表面主に関連していた。最近の研究では、9をエレクトロスピニングするための新規なコレクタを使用して、ユニークなコラーゲン繊維の配向を模倣する足場を作製することを試みた。この研究は、両方の整列とランダム繊維と足場を生産することに成功したが、それはネイティブの組織に展示漸進的な変化を模倣することができなかった。また、ランダムな向きに整列からの即時変更で、個別のコンポーネントを製造する際に、この足場の生体力学的特性が大幅に減少した。以前の仕事は、整列とランダムからの繊維配向で連続階調で適用可能なナノファイバー足場を生成することができなかった。我々の最近の研究では、ナノファイバー足場の成功したレクリエーションを示している潜在的に腱·ツー·ボーンの挿入10で天然コラーゲン組織を模倣することができ、繊維組織内の階調の。この研究は、密接に天然の腱から骨組織界面における繊維組織のそれに似ている構造を有するナノファイバー足場の製造に使用されるプロトコルを提供することを目的とする。
グラデーションナノ構造は、様々な分野での潜在的に遠大な用途がある。我々はすでに様々な基材11-14上の組織再生のために利用されている脂肪由来幹細胞（ADSCを）と私たちの足場を組み合わせることにより、腱·ツー·骨挿入部位の組織工学への応用に焦点を当てた。また、ADSCのは多分化の観点から骨髄幹細胞の性質が非常に類似しており、それらのリソースは、単純な脂肪吸引手順15,16を使用して回収することができる豊富である。さらにぼかしナノファイバー足場にこれらの細胞を播種すると、彼らのTISを強化潜在的に様々な組織に分化できる細胞の分布制御を可能にすることによってエンジニアリングアプリケーションを訴える。幹細胞を播種することに加えて、ナノファイバーは、細胞応答の調節シグナル伝達分子をカプセル化することができる。これらの足場の組織的な勾配とのカップリングナノカプセル化は、細胞挙動または可能なインプラントデザインやコーティングの研究のために可能にする。骨芽細胞分化15,16を誘発することが示された骨形成タンパク質2（BMP2）、のような機能性分子のカプセル化は、さらにこれらの足場10の組織工学アプリケーションを増強できる。
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Protocol
ソリューションの調製
- 100 mg / mlのおおよその濃度で、ポリ（εカプロラクトン）（PCL）（W M =8万グラム/モル）の溶液を調製する。 4の比率でのジクロロメタン（DCM）およびN、N-dimethlyformamide（DMF）の混合物中でPCLを溶解：1（v / v）の10％の濃度（w / v）の。
- 混合を20 mlのガラスチューブ中の溶液を置き。 30分間超音波洗浄器にガラス管を置き、または溶液は半透明になるまで。
2.装置の準備
- 付属の21ゲージ鈍針で5ミリリットル注射器に準備されたPCL溶液を加える。
- 図1によれば、垂直電界紡糸位置にシリンジポンプを配置する。
- 2cmのX整列繊維基材のための5cmのオープンスペースでステンレス鋼ギャップコレクタを使用してください。針の先端からコレクター12センチメートルを置きます。
- 直流（DC）に高電圧電源を接続し針とコレクタを接地してください。コレクタが個別に他のラボ機器に非接触で接地されていることを確認してください。
3.エレクトロ
- 取り外したときに、針の先端に形成滴まで1.50ミリリットル/時間に設定したシリンジポンプは、直ちに交換されている。その後、0.50ミリリットル/時に流量を設定。
- 12 kVのに電圧演算子を回します。
- エレクトロスピニングは、一軸整列繊維が完全にコレクタ上のギャップをカバーするまで。
- 小さなガラス板の縁部に接着剤を適用し、ガラス板にギャップコレクタから繊維を転送する。ガラスプレートと同じ大きさを有しており、接地されたアルミニウム箔片の上にガラス板を置き。
- 図3に係る第2のシリンジコレクターを配置します。
- 第2のシリンジポンプにプラスチック製のマスクを取り付け、2ミリメートルコレクタの上にそれを配置する。
- （w / w）のPCLソリューション-IF NaNに1％のクマリン6を追加します。oencapsulationはdesired-あり、溶液が半透明になるまで混ぜる。
- ブラント21ゲージ針で5ミリリットルの針にPCLまたはPCL /クマリン6溶液をロードします。 9ミリリットル/時間で、または1ミリメートル/分のおおよその速度で引っ張って0.50ミリリットル/時、水平垂直ポンプを設定します。
- エレクトロスピニングは、マスクまでほぼ完全にコレクタオフ、それでもマスクの下のエッジ領域に移動した。
4.ファイバー特性評価
- 両面導電性テープと場所サンプル40ミリアンペアでスパッタコーターを使用して40秒間白金と金属スタッドとを被覆する。
- 私たちのこれまでの研究17,18に係る走査型電子顕微鏡（SEM）を介して繊維を調べます。
- 加速電圧15kVで画像を収集します。
- 繊維配向を測定するために別々の繊維試料に高速フーリエ変換（FFT）解析を行う。 FFTにより、繊維アラインメントを測定に関する詳細情報は、Tを参照することができますこれまでの研究19,20 O。
5.幹細胞を播種する。
- 2時間、70％エタノール溶液に浸漬することによって繊維試料を滅菌する。その後、任意の汚染物質を除去するために蒸留水で繊維を洗浄する。
- 95％空気/ 5％CO 2の雰囲気中、37℃で、25cm 2のフラスコ中に人間のADSC培養細胞を得る。一日おきに10細胞培養培地を変更します。
- 細胞をトリプシン処理し、細胞数をカウントします。具体的には、細胞培養フラスコから全ての培地を除去し、二リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄する。その後、細胞単層を覆い、2~3分間、細胞培養インキュベーター中でフラスコをインキュベートする（37℃の水浴中で前加温）、0.25％トリプシン-EDTA溶液1のm リットルを加える。 4ミリリットル培地を追加し、全面にメディアをピペッティングすることにより、表面からすべてのセルを洗い流す。細胞懸濁液を遠心し、再分散番目培養培地中の電子の細胞ペレット。血球計を介して細胞を数える。ナノファイバー足場に1×10 4個の細胞の周りの種子は、35ミリメートルの-culture皿に置かれ、3と7日間インキュベートする。
- フルオレセインジアセテート（アセトン中5mg / ml）の（FDA）、画像、蛍光顕微鏡を用いて試料を用いて染色細胞。具体的には、培養皿にFDA溶液100μlを添加し、30分間インキュベートする。三回蛍光イメージング前にPBSで細胞を洗浄。私たちのこれまでの研究10に基づいてカスタマイズされたマット·ラボプログラムによってセルの向きを分析します。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、組織的な勾配を有する繊維マットを形成した。 図3は、ナノファイバー足場上の様々な位置で撮影したSEM像を示す。定性的には、これは6mmで（ 図3D）でのランダム繊維品揃え0ミリメートル（ 図3A）で一軸整列した繊維からの進行があると判断することができる。 FFTは繊維配列に定量値を与え、定量的なプロセスに関する詳細はこちらを19詳述されている。 0ミリメートル呈する繊維アライメントを示し、6 mmにFFTパターンがランダムな配向を意味FFTにおける繊維。ますますランダム繊維堆積（ - C図3B）に整列繊維組織からSEM像の明確な進行（ 図3）があります。
ADSCをナノファイバー足場内の位置に基づいて形態学的変化を受けた。 図4 図4E - H） - G>は3日間（D図4A）での蛍光顕微鏡（Zeiss）で撮影した画像を示している。幹細胞の角度の分布を定量的にカスタマイズされたMATLABプログラムによって評価様々な距離コルモゴロフ-スミルノフ検定を用いて分析した。 図4Iは、異なる場所での細胞角度の分布を示す。 0ミリメートル、または整列繊維の領域において、細胞の70％がナノファイバー製造の軸の20°以内に現れた。これとは対照的に、ADSCを、20°以内出現する細胞の20％のみで、この組織構造を欠いていた繊維足場のランダム部分に播種した。最後に、クマリン6を用いて化学的勾配の形成 - ロードPCL繊維は、蛍光顕微鏡を用いて検討した。化学勾配を定性的顕微鏡画像（ 図5A）を用いて確認した。イメージは増加ケミコンを確認蛍光画像の着実に増加して強度によって発揮される足場、全体のCAL濃度。蛍光強度（画像J）（ 図5B）のグラフは、足場にわたって線形成長を示すことにより、化学的濃度勾配を確認する。
図1：一軸整列繊維基材を製造するための実験装置の概略図を示す。
図2：（A）は、勾配足場の製造のための第2のシリンジポンプの配置を示します。コレクター上記マスクの（B）の配置。この図は、[10] Macromolから転載されています。 Biosci。、12、謝、J.、馬、B。、マイケル、PL＆シュラー、FDファブリ繊維組織とその潜在的なアプリケーションでの階調のナノファイバー足場のカチオン。 1336-1341、著作権2012、ワイリー-VCHの許可を。
図3：0ミリメートル（A）は2mm（B）、4ミリメートル（C）、及び図6ミリメートル（D）におけるPCLぼかしナノファイバー足場のSEM像。二次画像は、フーリエ高速転送パターン（FFT）である。 （A）のパターンは、整列された繊維、（D）のランダム繊維堆積を示唆していることである。この図は、[10] Macromolから転載されています。 Biosci。、12、謝、J.、馬、B。、マイケル、PL＆シュラー、繊維組織とその潜在的なアプリケーションでの階調のナノファイバー足場のFD製作。 1336-1341、著作権2012、ワイリー-VCHの許可を。
ふぃぎゅ5再：クマリン6、カプセル化された繊維の（A）蛍光顕微鏡画像。 （B）のグラフは、足場全体で蛍光強度を示す。直線的な増加は、足場を介して化学物質濃度の緩やかな変化を意味する。この図は、[10] Macromolから転載されています。 Biosci。、12、謝、J.、馬、B。、マイケル、PL＆シュラー、繊維組織とその潜在的なアプリケーションでの階調のナノファイバー足場のFD製作。 1336-1341、著作権2012、ワイリー-VCHの許可を。
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Acknowledgments
この作品は、ネブラスカ大学医療センターと国立衛生研究所（助成金番号1R15 AR063901-01）からスタートアップ資金から部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
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