Summary
여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.
Introduction
나노 섬유는 때문에 구조와 상대적 크기 1의 세포 외 기질을 모방 할 수있는 능력의 조직 공학에 대한 인기 유틸리티입니다. 그러나, 이러한 힘줄 투 뼈 삽입 부위의 조직 일부 원시 인터페이스, 힘줄을 향해 정렬 증가 뼈 사이트 2-5로 감소 변수 조직 구조를 나타낸다 콜라겐 섬유를 함유한다. 따라서, 효과적인 조직 재생이 효과적으로 구조 구배를 모방 할 수 지지체를 제조 할 필요가있다.
섬유 조성물의 점진적인 변화를 실시 이전 연구되고있다, 즉, 미네랄 함량 6. 그러나, 결합 조직의 구조 부품을 다시하면 크게 비경 남아있다. 이전 연구는 쥐의 두 개관 골 모세포의 증식 표면 실리카 입자 밀도의 효과를 연구함으로써 형태학 그라디언트 검사하고 인버 발견실리카 입자 밀도, 세포 증식 (7) 사이 SE 관계. 그러나 이전의 연구에서 세포 증식을 매개 형태 학적 변화는 섬유 조직 변경 7, 8을 흉내 낸의 능력을 결여 표면 거칠기에 주로 관련이 있었다. 최근의 한 연구는 9 전기 방사에 대한 새로운 컬렉터를 사용하여 고유의 콜라겐 섬유 방향을 모방 발판을 제작하려고했습니다. 이 연구는 모두 정렬 랜덤 섬유와 발판을 생산하는 데 성공하지만, 네이티브 조직에 전시 점진적인 변화를 모방하는 데 실패했습니다. 또한, 임의의 방향에 정렬에서 즉각적인 변화, 별도의 부품을 생산,이 지지체의 생체 역학적 특성은 유의하게 감소 하였다. 아니 이전의 작품은 정렬 된 임의의 섬유 방향에 연속 계조로 적용 나노 섬유 지지체를 생산할 수 없었다. 우리의 최근의 연구는 나노 섬유 지지체의 성공적인 휴양을 보여 주었다잠재적 건 - 투 - 뼈 삽입 (10)에서 네이티브 콜라겐 조직을 모방 할 수 섬유 조직의 계조와. 이 작업은 밀접 네이티브 힘줄 투 뼈 조직 인터페이스에서 섬유 조직이 유사한 구조를 갖는 나노 섬유 지지체의 제조에 사용되는 프로토콜을 제공하는 것을 목적으로한다.
그라데이션 나노 섬유 구조는 잠재적으로 다양한 분야에서 응용 프로그램을 광범위한했다. 우리는 이미 다양한 기판 11-14 조직 재생을 위해 사용된다 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs) 우리의 발판을 결합하여 건 - 투 - 뼈 삽입 부위의 조직 공학에 응용 프로그램에 초점을 맞추었다. 또한, 다 능성 ADSCs는 측면에서 골수 줄기 세포를 본질적으로 매우 유사하며, 이들 자원은 지방 흡입 간단한 절차 (15, 16)를 사용하여 수거 할 수있는 풍부하다. 더 계조 나노 섬유 지지체에 이들 세포를 심는 것은 자신의 TIS을 향상잠재적으로 다양한 조직으로 분화 할 수있는 세포의 제어 배포 허용함으로써 엔지니어링 응용 프로그램을 고소. 줄기 세포를 시딩 외에 나노 파이버는 세포 반응의 조절에 신호 분자로 캡슐화 될 수있다. 이러한 비계의 조직 그라데이션 nanoencapsulation 커플 링은 세포 행동이나 가능한 임플란트 디자인과 코팅의 연구 수 있습니다. 조골 세포 분화를 유도 15,16 도시 된 뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP2), 작용 성 분자의 캡슐화는 또한 이들 지지체 (10)의 조직 공학 응용 프로그램을 향상 할 수있다.
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Protocol
해결 방법 1. 준비
- 100 ㎎ / ㎖의 대략적인 농도 폴리 (ε 카프로 락톤) (PCL) (w M = 80,000g / 몰)의 용액을 준비합니다. (4)의 비율로 디클로로 메탄 (DCM)과 N, N-dimethlyformamide (DMF)의 혼합물에 녹이고 PCL : 1 (v / v)로 10 %의 농도를 갖는 (W / V).
- 혼합하는 20 ㎖ 유리 튜브에서 용액을 놓는다. 30 분 동안 초음파 세척기에 유리 튜브를 배치, 또는 솔루션은 반투명 때까지.
2. 장치 준비
- 부착 된 21 게이지 무딘 바늘로 5 ML의 주사기에 준비 PCL 솔루션을 추가합니다.
- 그림 1 항에있어서, 수직 전기 방사 위치에 주사기 펌프를 놓습니다.
- 2cm x를 정렬 섬유 기판 5cm의 열린 공간을 스테인리스 갭 수집기를 사용합니다. 컬렉터에게 바늘 끝에서 12cm를 놓습니다.
- 에 직류 (DC) 고전압 전원을 접속바늘과 콜렉터 접지. 집이 개별적으로 다른 실험실 장비없이 연락처와 접지되어 있는지 확인합니다.
3. 전기 방사
- 제거 할 때 바늘 끝에서 형성 방울까지 1.50 ㎖ / 시간으로 설정 주사기 펌프는 즉시 대체됩니다. 그런 다음, 0.50 ㎖ / 시간에 유량을 설정합니다.
- 12 kV의에 전압 연산자를 돌립니다.
- Electrospin는 일축 정렬 섬유는 완전히 집에 격차를 커버 할 때까지.
- 작은 유리판의 가장자리에 접착제를 적용하고, 유리판에 갭 수집기로부터 섬유를 옮긴다. 유리판과 같은 크기를 가지며 접지 된 알루미늄 호일 조각 위에 유리판을 놓고.
- 그림 3에 따른 제 2 주사기 수집기를 배치합니다.
- 집 위의 두 번째 주사기 펌프 및 위치는 2 mm의 플라스틱 마스크를 연결합니다.
- (W / W) PCL 솔루션의 경우 할머니 1 %에서 쿠마린 추가 6oencapsulation는 desired-하고, 용액이 투명해질 때까지 혼합한다.
- 무딘 21 게이지 바늘로 5 ml의 바늘에 PCL 또는 PCL / 쿠마린 (6) 솔루션을로드합니다. 0.50 ㎖ / 시간으로 수직 펌프를 설정하고 9 ㎖ / 시간 또는 1mm / 분의 대략적인 속도로 당길 수평.
- 마스크까지 Electrospin 콜렉터 거의 완전히 떨어져 이동하지만, 아직 마스크 엣지 영역으로하고있다.
4. 섬유 특성
- 40mA에서 스퍼터 코터를 이용하여 40 초 동안 백금과 금속 스터드와 코트에 양면 전도성 테이프와 장소 샘플.
- 우리의 이전 연구 17, 18에 따른 주 사형 전자 현미경 (SEM)을 통해 섬유를 조사한다.
- 15 kV로의 가속 전압에서 이미지를 수집합니다.
- 섬유 배향을 측정하는 별도의 섬유 샘플을 고속 푸리에 변환 (FFT) 분석을 수행한다. FFT에 의한 측정 섬유 정렬에 대한 자세한 내용은 t 참조 할 수 있습니다이전의 연구 (19, 20) 오.
5. 시드 줄기 세포.
- 2 시간 동안 70 % 에탄올 용액에 담가 섬유 샘플을 소독. 그런 다음, 오염물을 제거하고 증류수로 세척 섬유.
- 95 % 공기 / 5 % CO 2의 분위기에 37 ° C에서 25cm 2 플라스크에 인간 ADSCs과 문화 세포를 얻습니다. 세포 배양 배지를 매일 10을 변경합니다.
- 세포를 Trypsinize 세포의 개수를 카운트. 구체적으로, 세포 배양 플라스크에서 모든 배지를 제거하고 인산 완충 식염수 회 (PBS)으로 세포를 세척 하였다. 그런 다음 세포 단층을 포함 2 ~ 3 분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플라스크를 부화 (37 ° C에 물을 욕조에 미리 따뜻한) 0.25 % 트립신 - EDTA 용액의 1m 리터를 추가합니다. 4 ml의 배지를 추가하고 모든 표면에 매체를 피펫 팅에 의해 표면에서 모든 세포를 씻어. 세포 현탁액을 원심 분리 재 분산 번째배양액 E 세포 펠릿. hemacytometer를 통해 세포를 계산합니다. 와 35mm의 - 문화 접시에 배치 된 나노 섬유 지지체에 1 × 104 세포 주위에 씨는 3, 7 일 동안 배양한다.
- 형광 다음 디 아세테이트 (아세톤 5 ㎎ / ㎖) (FDA) 이미지 형광 현미경을 이용하여 샘플을 사용하여 얼룩 세포. 구체적으로, 배양 접시에 FDA 용액 100 ㎕를 추가하고 30 분 동안 배양한다. 세 번 형광 이미징 전에 PBS로 세포를 씻으십시오. 우리의 이전 연구 (10)에 따라 사용자 정의 매트 실험실 프로그램에 의해 세포의 방향을 분석합니다.
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Representative Results
이 프로토콜을 이용하여, 조직 그라데이션 섬유 매트를 형성 하였다.도 3은 나노 섬유 지지체상의 다양한 위치에서 찍은 SEM 이미지를 도시한다. 질적으로, 그것은 6mm (도 3d)에서 랜덤 섬유 구색 0mm (도 3A)에서 일축 정렬 된 섬유에서 진행이 있는지 판단 할 수있다. FFT는 섬유 정렬을 정량적 가치를 제공, 정량적 프로세스에 대한 세부 사항은 (19)는 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 0mm 전시 섬유 배향을 나타내고, 6mm에서 FFT 패턴은 무작위 배향을 의미 FFT에서 섬유. 점점 임의 섬유 증착 (- C 그림 3B)에 정렬 된 섬유 조직의 SEM 이미지에서 명확한 진행 (그림 3)이 있습니다.
ADSCs는 나노 섬유 지지체에서의 위치에 따라 형태 변경을 시행 하였다. 그림 4 (그림 4E - H) - g> 3 일 (D 그림 4A)에서 형광 현미경 (자이스)로 촬영 한 이미지를 보여줍니다. 줄기 세포의 각도 분포를 정량적으로 정의 MATLAB 프로그램에 의해 평가하고, 다양한 거리에서의 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트를 사용하여 분석 하였다. 4I는 상이한 위치에서 각 셀의 분포를 도시한다. 0mm, 또는 정렬 된 섬유의 영역에서 세포의 70 %가 나노 섬유의 제조 축의 20 ° 내에 나타났다. 대조적으로, 20 ° ADSCs 내에 나타나는 세포의 20 %가이 조직 구조 결여 섬유 지지체의 임의의 부분에 시드. 마지막으로, 쿠마린 6 이용한 화학적 구배의 형성 -로드 PCL 섬유는 형광 현미경을 이용하여 연구 하였다. 화학적 구배 질적 현미경 영상 (도 5a)를 사용하여 확인 하였다. 화상을 확인 증가 CHEMI형광 이미지의 꾸준히 증가 강도에 의해 전시 된 발판에서 칼 농도. 형광 강도 (이미지 J) (도 5b)의 그래프는 발판에 걸쳐 선형 증가를 나타내는 화학적으로 농도 구배를 확인한다.
그림 1 : 일축 정렬 섬유 기판의 제조를위한 실험 장치의 개략도를 보여줍니다.
도 2 (A)는 경사 지지체의 제조를위한 제 주사기 펌프의 배치가도. 콜렉터 위의 마스크 (B)를 요구함. 이 수치는 [10] 문헌 [Macromol에서 재 인쇄되었습니다. Biosci., 12시에, J., 엄마, B., 마이클, PL 및 슐러, FD 파브리섬유 조직 및 그들의 잠재적 인 응용 프로그램에서의 그라데이션으로 나노 비계의 양이온. 1336년부터 1341년까지, 저작권 2012, 와일리 - VCH의 허가.
도 3 : 0mm (A), 2mm (B), 4mm (C), 및 6mm (D)에서의 계조 PCL 나노 섬유 지지체의 SEM 이미지. 보조 이미지는 푸리에 빠른 전송 패턴 (FFT)입니다. (A)에서 패턴 정렬 섬유, (D)의 임의의 섬유 증착을 제시한다는 것이다. 이 수치는 [10] 문헌 [Macromol에서 재 인쇄되었습니다. Biosci., 12시에, J., 엄마, B., 마이클, PL 및 슐러, 섬유 조직의 변화와 그들의 잠재적 인 응용 프로그램이있는 나노 비계의 FD 제작. 1336년부터 1341년까지, 저작권 2012, 와일리 - VCH의 허가.
Figu5 재 : 쿠마린 6 캡슐화 된 섬유 (A) 형광 현미경 이미지. (B)의 그래프는 발판에 걸쳐 형광 강도를 나타낸다. 선형 증가는 지지체를 통해 화학적 농도의 점진적 변화를 의미한다. 이 수치는 [10] 문헌 [Macromol에서 재 인쇄되었습니다. Biosci., 12시에, J., 엄마, B., 마이클, PL 및 슐러, 섬유 조직의 변화와 그들의 잠재적 인 응용 프로그램이있는 나노 비계의 FD 제작. 1336년부터 1341년까지, 저작권 2012, 와일리 - VCH의 허가.
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Acknowledgments
이 작품은 네브라스카 의료 센터와 국립 보건 연구소 (허가 번호 1R15 AR063901-01)의 대학에서 시작 펀드에서 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
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