Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att tillverka electrospun nanofiber ställningar med graderade organisation av fibrer och utforska sina ansökningar i regleringen cellmorfologi / orientering. Lutningar beträffande fysikaliska och kemiska egenskaper hos nanofiber byggnadsställningar erbjuder ett brett utbud av tillämpningar inom det biomedicinska området.
Introduction
Nanofiber är en populär verktyg för vävnadsteknik på grund av deras förmåga att imitera den extracellulära matrisen i sin struktur och relativa storlek 1. Men vissa nativa vävnadskontaktytorna, såsom den sena-till-ben insättningsstället, innehåller kollagenfibrer, vilka uppvisar en variabel organisationsstruktur som ökar i inriktning mot senan och minskar vid benet plats 2-5. Så, för effektiv regenerering av vävnad föreligger ett behov att tillverka en byggnadsställning som effektivt skulle kunna imitera denna strukturella gradient.
Tidigare har det funnits forskning utförts på gradvisa förändringar i fibersammansättning, närmare bestämt mineralinnehåll 6. Men åter den strukturella delen av bindväv i stort sett outforskat. En tidigare studie undersökte morfologiska gradienter genom att studera effekten av ytan kiseldioxid partikeldensitet på spridningen av rått calvarial osteoblaster och hittade en Inverse samband mellan kiseldioxid partikeldensitet och celltillväxt 7. Men de morfologiska förändringar som förmedlade celldelningen i tidigare arbete var mestadels relaterade till ytan grovhet saknar förmåga i likna fiber organisationsförändringar 7,8. En färsk studie försökte tillverka en byggnadsställning som härmade de unika kollagenfiberoriente med hjälp av en ny uppsamlare för elektrospinning 9. Även denna studie lyckats framställa en byggnadsställning med både linje och slumpmässiga fibrer, underlåtit att efterlikna de gradvisa förändringar utställda i de infödda vävnaderna. Också, att producera separata komponenter, med en omedelbar förändring från linje till slumpvis orientering, de biomekaniska egenskaperna för denna byggnadsställning minskat betydligt. Ingen tidigare arbete har kunnat producera gällande nanofibrer ställningar med kontinuerliga nyanser i fiberoriente från inriktade och slumpmässiga. Vår senaste studie har visat framgångsrikt rekreation av nanofiber byggnadsställningarmed graderingar i fiber organisation som potentiellt kan imitera infödda kollagenorganisationen på senan till ben insättning 10. Detta arbete syftar till att presentera de protokoll som används för produktion av nanofiber ställningar med en struktur som liknar den hos fiber organisation i infödda senan till benvävnad gränssnitt.
Gradient nanofiber strukturer har potentiellt långtgående program inom en rad områden. Vi fokuserade på ansökningarna till vävnadsteknik av senan till ben insticksstället genom att kombinera våra ställningar med adipos-härledda stamceller (ADSCs) som redan utnyttjas för vävnadsregenerering på olika substrat 11-14. Dessutom ADSCs är mycket lika i naturen för att benmärgsstamceller i termer av multipotens och deras resurser är riklig som kan skördas med hjälp av en enkel fettsugning förfarande 15,16. Sådd dessa celler att graderade nanofiber ställningar ytterligare ökar deras tisstämma tekniska tillämpningar genom att tillåta för kontrollerad fördelning av celler som potentiellt kan differentieras till olika vävnader. Förutom att sådd stamceller, kan nanofibrer kapslas in med signalmolekyler för reglering av cellulärt svar. Koppling nanoencapsulation med organisations lutning av dessa ställningar möjliggör studier av cellulära beteende eller möjliga implantat mönster och beläggningar. Inkapsling av funktionella molekyler som benmorfogenesprotein 2 (BMP2), vilket har visat sig inducera osteoblaster differentiering 15,16, kunde ytterligare öka vävnadstekniska tillämpningar av dessa ställningar 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lösningen
- Bered en lösning av poly (ε-kaprolakton) (PCL) (Mw = 80000 g / mol) vid en ungefärlig koncentration av 100 mg / ml. Lös PCL i en blandning av diklormetan (DCM) och N, N-dimethlyformamide (DMF) vid ett förhållande av 4: 1 (volym / volym) med en koncentration av 10% (vikt / volym).
- Placera lösningen i en 20 ml glasröret för blandning. Placera glasröret i ultraljud renare i 30 minuter, eller tills lösningen är genomskinlig.
2. Apparat Förberedelse
- Lägg den förberedda PCL-lösning i en 5 ml spruta med en 21 gauge trubbig nål fastsatt.
- Placera sprutpump i en vertikal elektrospinning läge, enligt figur 1.
- Använd en rostfri-gap samlare med ett öppet utrymme 2 cm x 5 cm för linje fibersubstrat. Placera uppsamlaren 12 cm från nålspetsen.
- Anslut likström (DC) High Voltage strömförsörjning tillnål och jorda samlare. Se till att uppsamlaren är individuellt jordat utan kontakt med andra lab utrustning.
3. Electro
- Ställ sprutpump till 1,50 ml / timme, tills dropparna bildar på nålspetsen omedelbart ersättas när de tas bort. Ställ sedan in flödeshastigheten till 0,50 ml / h.
- Vrid spännings operatören 12 kV.
- Electrospin tills enaxligt inriktade fibrer helt täcka gapet på solfångaren.
- Applicera lim på kanterna av en liten glasplatta och överföra fibrerna från gapet samlare på glasskivan. Placera glasplattan på toppen av en bit aluminiumfolie som har samma storlek som den glasplatta och är jordad.
- Placera den andra sprutan kollektorn enligt figur 3.
- Fäst plastmasken till det andra sprutpumpen och placera den 2 mm ovanför kollektorn.
- Lägg Kumarin 6 vid 1% (vikt / vikt) till PCL-lösning-om nanoencapsulation är desired- och blanda tills lösningen är genomskinlig.
- Ladda PCL eller PCL / Kumarin 6 lösningen i en 5 ml nål med en trubbig 21 gauge nål. Sätt vertikal pumpen till 0,50 ml / h och horisontell att dra vid 9 ml / h eller med en ungefärlig hastighet av 1 mm / min.
- Electrospin tills masken har flyttat nästan helt utanför samlare, men med kantområdet fortfarande under masken.
4. Fiber Karakterisering
- Placera provexemplar med dubbelhäftande ledande tejp till metall stud och päls med platina under 40 sekunder med hjälp av en sputter coater vid 40 mA.
- Undersök fibrer genom svepelektronmikroskop (SEM) enligt våra tidigare studier 17,18.
- Samla bilder på en accelererande spänning på 15 kV.
- Utför snabb Fouriertransform (FFT) analys på ett separat prov fiber för att mäta fiber inriktning. Den detaljerade informationen om mätning fiber anpassning av FFT kan hänvisa to tidigare studier 19,20.
5. Seedning stamceller.
- Sterilisera fiberprover genom blötläggning i en 70% etanollösning under 2 h. Tvätta sedan fibrerna med destillerat vatten för att avlägsna eventuella föroreningar.
- Erhåll mänskliga ADSCs och kulturceller i en 25 cm 2-kolv vid 37 ° C i en atmosfär av 95% luft / 5% CO2. Ändra cellodlingsmediet varannan dag 10.
- Trypsinisera cellerna och räkna antalet celler. Specifikt avlägsna allt odlingsmedium från cellodlings kolven och tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger. Tillsätt sedan en m l av en 0,25% trypsin-EDTA-lösning (för-varmt i vattenbad till 37 ° C) för att täcka cellmonoskiktet och inkubera kolven i cellodlingsinkubator under 2-3 minuter. Lägg 4 ml odlingsmedium och tvätta ur alla celler från ytan genom pipettering av mediet över hela ytan. Centrifugera cellsuspensionen och åter disperst the cellpelleten i odlingsmediet. Räkna celler via hemacytometer. Seed omkring 1 x 10 4 celler till nanofiber schavotten placeras i en 35 mm -kultur skålen och inkubera i 3 och 7 dagar.
- Stain-celler med användning fluoresceindiacetat (5 mg / ml i aceton) (FDA) sedan bilden proverna med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Specifikt till 100 pl av FDA lösning till odlingsskålen och inkubera under 30 min. Tvätta cellerna med PBS tre gånger innan fluorescerande avbildning. Analysera cell orientering genom en anpassad matta-lab program baserat på våra tidigare studier 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll, var en fibermatta med en organisatorisk gradient bildas. Figur 3 visar SEM-bilder tagna vid olika platser på nanofiber schavotten. Kvalitativt kan det bestämmas att det finns en progression från enaxligt inriktade fibrerna vid 0 mm (Figur 3A) till en slumpmässig fiber sortiment på 6 mm (figur 3D). FFT ger ett kvantitativt värde på fiber anpassning, detaljerna på de kvantitativa processerna är detaljerade här 19. Fibrer vid 0 mm uppvisar en FFT som anger fiber justering och vid 6 mm FFT mönstret innebär en slumpmässig orientering. Det finns en tydlig progression i SEM-bilder (Figur 3) från en linje fiberorganisation till en allt slumpmässig fiber nedfall (figur 3B - C).
ADSCs gick morfologiska förändringar baserat på deras placering i nanofiber schavotten. Figur 4 (Figur 4A - D) och 7 dagar (Figur 4E - H). Fördelningen av stamcellsvinkeln kvantitativt bedömas av ett anpassat MATLAB-program och analyseras med hjälp av Kolmogorov-Smirnov test på olika avstånd. Figur 4I visar fördelningen av cellvinkel på olika platser. Vid 0 mm, eller regionen inriktade fibrer, dök 70% av cellerna inom 20 ° från axel nanofiber tillverkning. Däremot ADSCs såddes på de slumpmässiga delarna av fiber byggnadsställningar saknade denna organisationsstruktur, med endast 20% av cellerna förekommer inom 20 °. Slutligen, bildandet av den kemiska gradienten använder kumarin 6 - laddades PCL fibrer studerades med användning av fluorescensmikroskopi. Den kemiska gradienten kvalitativt bekräftades med användning av mikroskopbild (figur 5A). Bilden bekräftar den ökande kemical koncentration över schavotten, som uppvisas av stadigt ökande intensitet av det fluorescerande bilden. Kurvan över fluorescensintensitet (Image J) (figur 5B) bekräftar den gradient av den kemiska koncentrationen genom att uppvisa en linjär tillväxt i hela ställningen.
Figur 1: Visar den schematiska av experimentuppställning för beredningen av enaxligt inriktade fibersubstrat.
Figur 2: (a) visar placeringen av den andra sprutpumpen för tillverkning av gradienten ställningen. (B) Placering av masken ovanför kollektorn. Denna siffra har tryckts från [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabriningen av nanofiber Ställningar Med nyanser i Fiber Organisation och deras potential Applications. 1336-1341, Copyright 2012, med tillstånd från Wiley-VCH.
Figur 3: SEM-bilder av PCL graderade nanofiber byggnadsställning vid 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C), och 6 mm (D). De sekundära bilder är Fourier snabba överföringsmönster (FFT). Mönster på (A) är att av inriktade fibrer, (D) föreslår slumpmässig fiberavsättning. Denna siffra har tryckts från [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Tillverkning av nanofiber Ställningar Med nyanser i Fiber Organisation och deras potential Applications. 1336-1341, Copyright 2012, med tillstånd från Wiley-VCH.
Figure 5: (A) Fluorescensmikroskopi bild av Kumarin 6-inkapslade fibrer. (B) Grafen uppvisar fluorescensintensiteten tvärs över ställningen. Den linjära ökningen innebär en gradvis förändring i den kemiska koncentrationen genom ställningen. Denna siffra har tryckts från [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Tillverkning av nanofiber Ställningar Med nyanser i Fiber Organisation och deras potential Applications. 1336-1341, Copyright 2012, med tillstånd från Wiley-VCH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis från start medel från University of Nebraska Medical Center och National Institute of Health (licensnummer 1R15 AR063901-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
