Abstract
Клеток получают кардиомиоциты плюрипотентные стволовые вызванных деятельностью человека (hiPSC-CMS) стали важным источником клеток для решения проблемы нехватки первичных кардиомиоцитов, доступных для фундаментальных исследований и трансляционных приложений. Чтобы дифференцировать hiPSCs в кардиомиоциты, различные протоколы, включая эмбриоидном тела (EB) основе дифференциации и индукции фактора роста были разработаны. Тем не менее, эти протоколы неэффективны и сильно варьирует в их способности генерировать очищенные кардиомиоциты. В последнее время, малая молекула на основе протокола использованием модуляции сигналов Wnt / β-катенин было показано, чтобы способствовать сердечной дифференциации с высокой эффективностью. С помощью этого протокола, более чем на 50% -60% дифференцированных клеток были сердечный тропонин-положительных кардиомиоциты последовательно наблюдалось. Для дальнейшего повышения чистоты кардиомиоцитов, дифференцированные клетки подвергали голоданию в глюкозу, чтобы специально исключить некардиомиоциты на основе метаболического разностис между кардиомиоцитов и некардиомиоциты. Используя эту стратегию выбора, мы последовательно получили увеличение более чем на 30% в соотношении кардиомиоцитов в некардиомиоциты в популяции дифференцированных клеток. Эти особо чистые кардиомиоциты должны повысить надежность результатов человеческой IPSC основе в пробирке исследования моделирования заболеваний и скрининга лекарственных средств анализов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
