Abstract
Menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMS) har blitt en viktig celle kilde for å løse mangelen på primær kardiomyocytter tilgjengelige for grunnforskning og translasjonsforskning applikasjoner. For å skille hiPSCs inn kardiomyocytter, har ulike protokoller inkludert embryoid kroppen (EB) -basert differensiering og vekstfaktor induksjon blitt utviklet. Disse protokollene er ineffektiv og meget variabel i deres evne til å generere rensede kardiomyocytter. Nylig ble et lite molekyl-basert protokoll benytter modulering av Wnt / β-catenin signale vist seg å fremme differensiering hjerte med høy effektivitet. Med denne protokoll, var større enn 50% -60% av differensierte celler hjerte troponin-positive kardiomyocytter ble konsekvent observert. For ytterligere å øke cardiomyocyte renhet ble de differensierte cellene utsettes for glukose sult for spesifikt å eliminere ikke-kardiomyocytter basert på den metabolske forskjellens mellom cardiomyocytes og ikke-kardiomyocytter. Ved hjelp av dette valget strategi, vi konsekvent fått en større enn 30% økning i forholdet mellom kardiomyocytter til ikke-cardiomyocytes i en populasjon av differensierte celler. Disse høyt rensede kardiomyocytter bør forbedre påliteligheten av resultatene fra menneskelig IPSC-basert in vitro sykdom modelleringsstudier og narkotika screening-analyser.
Introduction
Primære humane kardiomyocytter er vanskelig å oppnå på grunn av kravet til invasive biopsier, vanskeligheter med å dissosiere til enkeltceller, og på grunn av dårlig langtidscelleoverlevelse i kultur. Gitt denne mangel på primære humane kardiomyocytter, pasient-spesifikke menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknologi har vært ansett som en kraftig alternativ cardiomyocyte kilde for grunnforskning samt kliniske og translasjonsforskning applikasjoner som sykdom modellering og narkotika oppdagelse en. Tidlig innsats i å differensiere pluripotente stamceller inn kardiomyocytter ansatt differensiering protokoller ved hjelp av embryoid organer (EBS), men denne metoden er ineffektiv i produserende cardiomyocytes fordi ofte mindre enn 25% av cellene i en EB er juling cardiomyocytes 2,3. Relativt, en monolayer basert differensiering protokollen ved hjelp av cytokiner aktivin A og BMP4 vises en høyere virkningsgrad enn EBS, mendenne protokollen er fortsatt relativt ineffektiv, krever dyre vekstfaktorer, og fungerer kun i et begrenset antall menneskelige pluripotente stamcellelinjer 4. Nylig ble en svært effektiv, hiPSC monolayer-basert cardiomyocyte differensiering protokoll utviklet av moduler Wnt / β-catenin signale 5. Disse hiPSC-CMs uttrykke hjerte troponin T og alfa actinin, to sarcomeric proteiner som er standard markører for kardiomyocytter 6. Protokollen beskriver her er en tilpasning av denne lite molekyl-baserte, mater celle-fri, mono differensiering metode 5,7. Vi er i stand til å få juling cardiomyocytes fra hiPSCs etter 7-10 dager (Figur 1). Imidlertid, etter en cardiomyocyte differensiering som resulterer i 50% av stolpene celler, farging konsekvent viser eksistensen av en populasjon av ikke-kardiomyocytter som er negative for cardiomyocyte-spesifikke markører så som hjertespesifikk troponin T og alfa-actinin. Til further rense kardiomyocytter og eliminere ikke-kardiomyocytter, ble heterogene differensierte cellepopulasjoner kastet glukose sult ved å behandle dem med en ekstremt lav glukosekulturmedium for flere dager (figur 2). Denne behandling selektivt eliminerer ikke-kardiomyocytter på grunn av evnen til kardiomyocytter, men ikke ikke-kardiomyocytter, for å forbrenne laktat som den primære energikilde for å overleve i et lavt glukose miljø 8. Etter dette rensetrinnet, er en 40% økning i forholdet av kardiomyocytter til ikke-kardiomyocytter observert (figur 3, figur 4), og disse celler kan brukes til nedstrøms genekspresjonsanalyser, sykdoms modellering og medikamentscreeningsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Vendor informasjon for alle reagenser som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1 og Materialer List. Alle løsninger og utstyr som kommer i kontakt med cellene må være sterilt og aseptisk teknikk brukes tilsvarende. Utføre alle kultur inkubasjonene i en fuktet 37 ° C, 5% CO 2 inkubator med mindre annet er spesifisert. I denne protokollen, er alle differensiering utført i 6-brønners plater, hvor hiPSCs sås. Etter differensiering og rensing, kan cellene bli dissosiert og platet for senere anvendelse.
1. Medium Forberedelse
- For E8 medium, gjør en stamløsning for hver mellom komponent (NaHCO3, L-askorbinsyre 2-fosfat, natrium- selenitt, transferrin, insulin, FGF2, TGFB1) og lagre løsningene ved -20 ° C. Legg passende mengde lagerløsninger til flaske DMEM / F12 og filter for å sterilisere. Løsningen konsentrasjonerasjon og reaksjon oppsett for aksje komponenter og E8 medium kan finnes i tabell 1.
- For den ekstracellulære matriks-løsning, tine basalmembranen matriks (som vanligvis leveres ved 10 mg / ml) ved 4 ° CO / N. Matrigel er ofte brukt for pluripotent stamcelle kultur fordi menneskelige pluripotente stamceller kan feste seg godt til dette materialet ved hjelp av alfa-6-beta-en inte 9. Tint, lage 2,25 mg (250 pl) porsjoner på isen ved hjelp av isen kald pipettespisser og rør og lagre alikvotene ved -80 ° C.
- Når forbelegge plater med ECMS, tine og delmengde den ekstracellulære matrise løsning (ECMS) på is. Bland ECMS og is-kald DMEM / F12-medium i et forhold på 1: 200 på is. Oppbevares kjølig å hindre for tidlig ECMS størkning.
- For RPMI / B27 uten insulin medium, tilsett 10 ml av B27 Minus Insulin i 500 ml RPMI media.
- For RPMI / B27 (med insulin) medium, tilsett 10 ml B27 Supplement (med insulin) og 5 ml Pen-Strep antibiotikum i 500 ml RPMI-medium.
- For lav glukose medium, tilsett 10 ml B27 Supplement og 5 ml av Pen-strep antibiotika i 500 ml glukose-fri RPMI media.
- For frysing / kryopreservering medium, blander føtalt bovint serum sammen med dimetylsulfoksyd (DMSO) i en 9: 1-forhold. Frysing medium kan lagres opp til en måned ved 4 ° C.
NOTE: Alle media bør filtreres og lagres i 4 ° C og benyttet innen 2 uker, med mindre annet er angitt. Alle reagenser / løsningsvolum som brukes nedenfor er ment for en enkelt brønn i en 6-brønns plate, med mindre annet er angitt.
2. Pre-belegg 6-brønners plater med ECMS
- Gjør ECMS ved å blande basalmembran matrise (f.eks Matrigel) med iskald DMEM / F12 media i forholdet 1: 200, og deretter bruke 2 ml nylaget ECMS til hver brønn for en seks-brønns plate. Hver brønn i en 6-brønns plate vil motta tilnærmet 90 mg ECMS.
- Inkuber ECMS belagte platene i 1 time ved 37 ° C. Umiddelbart før plating celler, aspirer DMEM / F12 løsning fra hver brønn. Platene vil da være klar til å motta celler.
3. Tining av frossen hiPSCs
MERK: Følge denne prosedyren fordi det kan føre til optimal dyrking og nedstrøms differensiering av hiPSCs inn hiPSC-CMs etter fryse / tine syklus.
- Tine en ampulle med hiPSCs for hver brønn i en 6-brønns plate. Forberede en 15 ml konisk rør med 9 ml kald E8 medium med ROCK inhibitor (10 mm) for hvert hetteglass. ROCK hemmer forbedrer hiPSCs overlevelse etter nedfrysing 10. Oppbevar hetteglassene i 37 ° C vannbad for å tine cellene til en ca 5 mm diameter iskrystall er igjen.
- Spray utsiden av hetteglass med 70% etanol. Tørk hetteglassene med silkepapir før du flytter dem til den sterile laminær hette.
- Overfør cellene i forberedt konisk rør. Skyll tHan hette en gang med 500 ul av E8 medium og overføre mediet inneholdende de tinte celler til den samme koniske rør. Sentrifuger ved RT i 4 min ved 200 x g.
- Aspirere supernatanten etter sentrifugering og forsiktig cellepelleten suspenderes med 2 ml av E8 medium med ROCK-inhibitor (10 pM). Overfør de resuspenderte celler i en brønn i en 6-brønns plate forhåndsbelagt med ECMS.
- Erstatte mediet med E8 medium uten ROCK hemmer etter 24 timer av dyrkning. Cellene skal ha levd på denne tiden.
4. aging av hiPSCs
- Vanligvis passasje hiPSCs etter å ha nådd 75% -80% konfluens i en 6-brønns plate. Aspirere kulturmediet. Raskt vaskes brønnene med 1 ml steril, RT PBS. Aspirer PBS.
- Legg 500 mL av 0,5 mM EDTA eller 1x celle avløsning løsning (f.eks Accutase) og inkuberes i 1-7 min ved RT. Passende tid for EDTA inkubasjon varierer med hiPSC linje. Forvent å se synlig curling or fortykkelse av kolonier rundt kantene, da dette vil indikere at EDTA eller celle løsgjøring løsningen er klar til å bli fjernet.
- Aspirer EDTA eller celle avløsning løsning. Tilsett 1 ml av E8-medium supplert med 10 uM ROCK-inhibitor. Fortrenge hiPSC kolonier i brønnen ved gjentatte ganger å pipettere opp og ned og sprøyting kolonier med en P1000 pipette. Kolonier bør deles inn i 5-10 celleklumper etter ferdigstillelse.
- Overfør de kolonier som er suspendert i 1 ml medium E8 med ROCK-inhibitor inn i et 15 ml konisk rør.
- Forstyrre store celleklumper i små klumper i E8 medium. Tilsett en passende volum av E8 media med inhibitor til cellesuspensjonen for å fortynne cellene. Medievolumet for å legge til fortynning er avhengig av celletetthet og av antall brønner som skal podes. Ideelt sett bør en singel, 80% sammenflytende godt av hiPSCs fortynnes 1:12.
- Legg 11 ml E8 medium med ROCK hemmer til eksisterende 1 ml cell oppløsning i ovennevnte 15 ml konisk rør for å oppnå en 1:12 fortynning.
- Videre Triturer celleklumper til små cellefragmenter (rundt 50 til 200 celler i hvert fragment er best). Unngå over-triturating da dette reduserer celle overlevelse.
- Aspirer ECMS fra pre-belagte plater og tilsett 2 ml resuspendert celler i hver brønn. Omtrent 100.000 celler per brønn i en 6-brønns plate er ideell. Tar sikte på å dispensere cellene jevnt rundt brønnen for å unngå opphopning av cellene i sentrum av brønnen.
- Etter 24 timer av dyrking, erstatte mediet med E8 medium uten ROCK hemmer. Endre kulturen medium hver 24 timer før cellene blir 80% sammenflytende. Deretter er cellene klare til passasjen igjen. Det tar vanligvis 3-6 dager mellom passasjer å nå 80% confluency.
5. Frysing hiPSCs
MERK: Følge denne prosedyren fordi det kan føre til optimal dyrking og nedstrøms differensiering av hipSentre i hiPSC-CMs etter fryse / tine syklus.
- Etikett kryogene rør med cellelinjen navn, celletype, passasje nummer og frysetidspunktet. Som en generell retningslinje, bruke en ampulle for hver brønn i en 6-brønns plate. Forberede en 15 ml konisk rør fylt med 9 ml E8 medium med ROCK inhibitor (10 mm). Forberede frysing medium med 90% FBS og 10% DMSO, og holde mediet ved 4 ° C til den er klar til bruk.
- Aspirer dyrkingsmedier, tilsett 500 mL av 0,5 mM EDTA eller 1x celle avløsning løsning og inkuberes i 2-7 min ved RT. Varigheten av EDTA eller celle avløsning løsning eksponeringen varierer fra cellelinje til cellelinje.
- Sug EDTA eller celle avløsning løsning. Tilsett 1 ml av E8 medium.
- Fortrenge hiPSC kolonier i brønnen ved å pipettere opp og ned og sprøyting kolonier med en P1000 pipette. Kolonier bør ikke deles opp i mindre enn 100 celleklumper. Overfør de suspenderte celler til den preparerte konisk rør inneholdende E8. Sentrifuger ved RT i 4 minutter ved 200 x g.
- Aspirere supernatanten og tilsett 500 ul kald frysemedium til pelleten. Resuspender pelleten ved å pipettere ett femtinitti ganger. Celleoverlevelse er forbedret ved å holde cellene i store klumper.
- Overfør resuspenderte celler i en merket kryogenisk tube. Raskt å bevege flaskene inn i en frysebeholder inneholdende isopropanol, noe som vil tillate gradvis avkjøling. Holde beholderen med cellene ved -80 ° C i 24 timer, deretter overføre cellene til flytende nitrogen for langtidslagring.
6. Cardiac Differensiering of Human IPSC
MERK: Alle media bør være minst ved RT da lagt.
- Etter dissosiasjon med EDTA eller 1x celle avløsning løsning, frø omtrent 100.000 mennesker iPSCs på ECMS belagt seks-brønns kultur plater for differensiering (samme fremgangsmåte som celleaging prosedyrer). Når cellene når 85% confluency, bytter mediet som RPMI / B27 uten insulin medium med 6pM GSK3p-beta-inhibitor CHIR99021 (Chir) og opprettholde i 48 timer.
- Etter 48 timer erstatte tsjir holdig dyrkingsmedium med RPMI / B27 uten insulin medium og la alene for 24 timer (inntil dag 3).
- På dag 3, endre medie til RPMI / B27 uten insulin med fem mikrometer Wnt inhibitor IWR1 og vedlikeholde i 48 timer (inntil dag 5).
MERK: Wnt inhibering kan også forsøkt ved hjelp av andre lavmolekylære forbindelser, som beskrevet i tidligere studier 11. IWR1 ble valgt fremfor andre småmolekylære Wnt inhibitorer på grunn av den økte område i hvilket det har blitt vist å være effektive i å hemme Wnt signale 11. - På dag 5, bytter mediet tilbake til RPMI / B27 uten insulin medium og la stå i 48 timer (inntil dag 7).
- På dag 7, erstatte mediet med RPMI / B27 medium (med insulin) og erstatte medium hver 3 dager etterpå med samme medium. Spontan juling av kardiomyocytter bør først være synlig på ca dag 8 til dag10.
7. Rensing av menneske kardiomyocytter gjennom Glukose Sult
- På dag 10 post-differensiering, endre mediet i hver brønn på 6-brønners plate i 2 ml lavt glukosemedium og opprettholde cellene i dette medium i 3 dager (inntil dag 13).
- På dag 13, returnere celler til RPMI / B27 medium (med insulin).
- Eventuelt replate kardiomyocytter før andre runde av glukose sult for å hjelpe løsne ikke-cardiomyocytes fra kultur plate, noe som gir enklere dissosiasjon av ikke-kardiomyocytter under glukose sult.
- På dag 13, aspireres mediet, vaskes en gang med PBS, og cellene dissosiere til enkeltceller ved hjelp av 500 ul av celle disassosiasjon enzymet i 5 min ved 37 ° C. Nærmere bestemt, etter 5 min av enzymbehandling ved å bruke en 1000 ul pipette for å dissosiere kardiomyocytter fra 6-brønns plate manuelt ved gjentatte ganger å trekke opp cellen dissosiasjon enzym og spraye den mot cardiomyocyte enkeltlag. Opp til 30 pipetteringssykluser repetisjoner kan være nødvendig å distansere de cardiomyocytes til enkeltceller.
- Etter at cellene ble dissosiert, og er i enkeltcelleform, samle alle celler i et 15 ml konisk rør fylt med 5 ml RPMI / B27-medium med insulin for å fortynne ut cellen dissosiasjon enzym og sentrifuger i 4 min ved 200 x g. Aspirer og kast supernatanten.
- Re-suspendere cellene med 2 ml RPMI / B27 medium og plate på en ny ECMS-belagt seks-brønns plate. Vanligvis hjelper høyere confluency av cardiomyocytes med celle overlevelse under replating. Mål å replate 2 millioner celler per ny 6-brønnen parabolen for optimal overlevelse under replating.
- På dag 14, endrer mediet tilbake til 2 ml av lav glukosemedium for en andre glukosemangel syklus. Kultur cellene i denne lave glukose tilstand for tre dager. De fleste av de ikke-kardiomyocytter vil dø i dette lav-glukose dyrkingsbetingelser.
- På dag 17, bytter mediet til 2 ml av RPMI / B27 medium med insulin. De resterende cellene vil være svært renset kardiomyocytter. Disse kardiomyocytter kan brukes genekspresjonsanalyser, medikamentscreening, metabolsk analyse og forskjellige andre nedstrøms for analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De morfologiske endringer under hiPSC differensiering.
Den hiPSC dyrket i mater frie plater vokste som flate, todimensjonale kolonier. Ved å nå rundt 85% confluency, ble hiPSCs behandlet med 6 mikrometer tsjir for differensiering (figur 1A). Betydelige mengder av celledød, et normalt og vanlig fenomen ble observert etter 24 timers behandling av Chir. Etter to dager med Chir behandling, hiPSCs fortsatte å skille mot en mesodermal skjebne. I forhold til cellene i hiPSC kolonier, cellestørrelse for disse dag 2 celler økes. Celle nummer også økt gjennom celledeling (figur 1B). På dag 5 ble mesodermal celler rettet mot hjerte avstamning (hjerte mesoderm). På dette tidspunkt begynner celler fortetting og danner karakteristiske, grenlignende strukturer (figur 1C). På dag 10 ble avdelingslignende strukturer svært uttalt, og kardiomyocytter stjerneted spontant slo (figur 1D). Terminalt differensierte cardiomyocytes vil ikke spre seg utover dette punktet. En tidslinje for differensiering protokollen er vist i figur 2.
Farging og flowcytometri Resultatene viste cardiomyocytes ble renset med glukose sult.
Etter 10 dager med differensiering, er mer enn 50% av celleområder juling. Imidlertid slo celle arkene er også blandet med ikke-kardiomyocytter. Å undersøke cardiomyocyte renhet, ble celler med farging mot cardiomyocyte markør hjerte troponin-T (cTnT) karakterisert til å finne at de fleste cellene var cTnT positive. Imidlertid, i en urenset populasjon av differensierte celler, et antall celler har også manglet ekspresjon av cTnT, noe som tyder på tilstedeværelsen av ikke-kardiomyocytter i denne differensiert populasjon på dag 13 (figur 3A). Men med glukose sult,nesten alle gjenværende cellene var cTnT positiv på dag 13 (Figur 3B), noe som indikerer vellykket rensing av cardiomyocytes følgende glukose sult. Disse dataene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av flowcytometri analyse. En befolkning på differensierte celler på dag 13 etter differensiering inneholdt ca 50% TNNT2 + celler når ikke glukose sultet (Figur 4A). En parallell differensiering ble også gjennomført, men med en 3 dagers glukose deprivasjon begynner på dag 10 etter differensiering. I motsetning til den Usultede differensiering, glukosemangel førte til et renset populasjon inneholdende 90% TNNT2 + celler på dag 13 (figur 4B).
Figur 1. De sekvensielle morfologiske endringer i løpet hiPSC differensiering mot hjerte avstamning. (A) Udifferensierte hiPSCspå dag 0 utstillings typisk koloni morfologi og nådde rundt 85% confluency. (B) På dag 2, celler etter behandling med tsjir for to dager nådde 100% confluency og kom inn i mesodermal avstamning. (C) På dag 5 ble cellene etter behandling med IWR1 i 2 dager kom inn i hjerte mesoderm trinnet. Noen celler begynte å smelte og danne karakteristiske avdelingslignende morfologi (angitt med piler). (D) I dag 7-10, avdelingslignende strukturer er svært tydelig, og cardiomyocytes begynner spontant slo. Bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tidslinje av hiPSC-CM differensiering protokollen og påfølgende glukose sult prosess. Slo cardiomyocytes en re typisk først observert ved ca. dager 7-10. To runder med glukose sult vil resultere i et renset befolkning på kardiomyocytter etter dag 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Immunfluorescens avslører rensing av kardiomyocytter følgende glukose sult. (A) urenset celler etter 13 dager med differensiering ble farget med Cardiac troponin T (cTnT). De fleste celler som har differensiert til kardiomyocytter og var cTnT positive, men en rekke av ikke-kardial, cTnT-negative celler er også til stede. (B) I motsetning til dette, etter en 3 dagers glukose sult begynner på dag 10, er nesten alle av de overlevende celler var positive cTnT ved dag 13. Skala bar = 200 um.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Flow avslører cytometri rensing av kardiomyocytter følgende glukose sult. (A) Etter 13 dager med hjerte differensiering uten glukose sult, en populasjon av celler utstilt omtrent 50% TNNT2 + kardiomyocytter. Rødt indikerer den differensierte cellepopulasjon og blått angir udifferensierte hiPSCs som en negativ kontroll. (B) Etter 10 dager med hjerte differensiering og etterfulgt av tre dager med glukose sult, ble en populasjon av celler fra samme batch av differensieringer renset å inneholde 90% TNNT2 + cardiomyocytes. Klikk her for åse en større versjon av dette tallet.
| Komposisjonene for E8 medium | |||
| E8 | Volum: 1 l | Selskap | Katalognummer |
| DMEM / F12 med Glutamin og HEPES | 1000 ml | Invitrogen | 11330-032 |
| NaHCO3 (7,5%, 75 mg / ml) | 7,24 ml | Invitrogen | 25080-094 |
| L-askorbinsyre 2-fosfat (64 mg / ml) | 1 ml | Sigma | A8960 |
| natriumselenitt (70 ug / ml) | 200 mL | Sigma | S5261 |
| transferrin (50 mg / ml) | 214 mikroliter | Sigma | T3705 |
| insulin (4 mg / ml) 5 ml | Invitrogen | 12585-014 | |
| FGF2 (200 ng / mL) | 500 mL | Peprotech | 100-18B |
| TGFB1 (100 ng / mL) | 20 mL | Peprotech | 100-21 |
| Aksje løsninger for E8 komposisjoner | |
| L-askorbinsyre-2-fosfat (64 mg / ml) | 3,2 g i 50 ml ultrarent vann, lagre 500 mL alikvoter ved -20 ° C |
| Transferrin (50 mg / ml) | 500 mg i 10 ml av ultrarent vann, lagre 107 ul porsjoner ved -20 ° C |
| Natriumselenitt (70 ug / ml) | 35 mg natriumselenitt i 500 ml ultrarent vann, lagre 100 mL alikvoter ved -20 ° C |
| FGF2 (200 ng / mL) | 1 mg i 5 ml kald D-PBS, lagre 250 ul porsjoner ved -20 ° C |
| TGFB1 (100 ng / mL) | 100 ug i 1 ml kald 10 mM sitronsyre, pH 3, lagre 10 mL alikvoter ved -20 ° C |
Tabell 1. Sammensetning av E8 Medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innhenting av en stor mengde høyt rensede hiPSC-avledet cardiomyocytes er kritisk for grunnleggende hjerte forskning samt kliniske og translasjonsforskning applikasjoner. Hjerte differensiering protokoller har gjennomgått store forbedringer de siste årene, overgangen fra embryoid body-baserte metoder benytter kardiovekstfaktorer 2, til matrise sandwich-metoder 12, og til slutt til små molekyl-modulert og monolayer-baserte metoder fem. Av de nevnte protokoller, protokollen som er beskrevet her vises den høyeste og mest reproduserbare hjerte differensiering effektivitet for ulike hiPSC cellelinjer ved moduler Wnt / β-catenin signalering ved hjelp av små molekyler tsjir og IWR 5,7. Nærmere bestemt ble de udifferensierte hiPSCs indusert til å gjennomgå differensiering mesodermal med GSK3p-beta-inhibitor Chir og påfølgende hjerte differensiering med Wnt signale inhibitor IWR1. Disse sekvensielle trinnene avWnt signal modulasjon, hjulpet av insulinmangel i løpet av hjertestans avstamning induksjon fase, førte til svært effektiv hjerte differensiering. Chir er en vanlig lite molekyl GSK3p-beta-inhibitor som brukes for mesodermal induksjon, men andre små molekyler for GSK3-beta-inhibering er blitt testet i cardiomyocyte differensierings protokoller 11. Flere alternativer er også brukt for den påfølgende lite molekyl Wnt hemmer. For eksempel, en fersk publikasjon med fokus på kjemisk definerte differensiering av pluripotente stamceller til kardiomyocytter bruker to mikrometer Wnt-C59 for effektiv Wnt hemming og hjerte mesoderm induksjon 11.
I tillegg er de differensierte kardiomyocytter med en glukose sult metode ble ytterligere renset, som tar fordel av den distinkte glukose metabolsk strømme eksisterende mellom kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter 8. Det er viktig å merke seg at effektiviteten av glukose sult metoden er density avhengig (dvs. differensieringer som ga høyere prosenter av cardiomyocytes er mer sannsynlig å oppnå større cardiomyocyte overlevelse). Imidlertid er overgangen til den lave glukosemedium også en stresstilstand for kardiomyocytter. Det er viktig å endre cellene tilbake til den vanlige RPMI / B27 insulin medium etter 3 dager av glukose sult. I denne protokollen, ble en mater-free vekst system benyttes, hvor pluripotente stamceller ikke ble dyrket på mater mus embryonale fibroblaster (MEFs). Imidlertid har tidligere hjerte differensiering protokoller utnyttet mater-baserte systemer for å produsere cardiomyocytes fra pluripotente stamceller 5. Likeledes er tidligere kjente protokoller også brukt mTeSR1 medium for stamcelle vedlikehold, men E8 media og mater fritt system benyttes her er overlegen på grunn av sin enkelhet og mangel på skytende xenogene komponenter slik som bovint serumalbumin og mus embryonale fibroblaster.
Foreløpigpluripotent stamcelle differensiering mot cardiomyocyte linjene er i stor grad robust, men likevel lider hiPSC linje til linje variasjon i forhold til effektivitet. Dette er fortsatt et stort problem i den hjerte differensiering feltet og vil kreve videre studier. Differensieringen effektiviteten forbedres ved riktig vedlikehold av hiPSC linjer, og i særdeleshet, hindrer overconfluency under hiPSC vedlikehold. Ytterligere variasjon oppstår fra celle såing under aging prosessen, som et jevnt sådd monolag av hiPSCs en tendens til å gi opphav til de beste samlede differensiering. Her var en mus-avledet, Matrigel-baserte ECMS for celle seeding under cellekultur med hell utnyttet, men en eventuell overgang til Xeno-frie underlag anbefales. I forhold til celle seeding på ECMS, ujevn seeding ofte resulterer i ujevn fordeling av kardiomyocytter innenfor et bestemt godt. For eksempel, hvis hiPSCs sås ujevnt, kan kantene av en brønn i en seks-brønns plate gir opphav til highennes antall kardiomyocytter enn sentrum av brønnen. Disse ujevne forhold ved såing kan gi opphav til lav effektivitet differensiering og et større antall ikke-cardiomyocyte, mesodermal derivater så som fibroblaster og glattmuskelceller. Vi har også observert at lave effektivitet differensiering (under 50%) er mye vanskeligere å rense ved hjelp av glukosemangel prosessen som er nevnt her. En annen bivirkning av langsiktig glukose sult er et potensielt tap i cardiomyocyte levedyktighet. Selv om kardiomyocytter er i stand til å metabolisere laktat i fravær av glukose, finner vi at denne bryteren til en lav-glukose miljøet er stressende for cellene. Celler kan stoppe spontant slo, og noen celleskader kan observeres hvis glukose sult er forlenget utover den anbefalte tiden. Denne forbedrede følsomheten til glukose deprivasjon kan være representative for de veletablerte utviklings, funksjonelle og elektrofysiologisk umodenhet av stamcelle-avledet cardiomyocytes i forhold til sann voksen kardiomyocytter 13.
Oppsummert protokollen beskrevet her kombinerer lite molekyl-baserte, hiPSC monoskikt hjertestans differensiering metode med en cardiomyocyte rensende glukose sult metode. Denne protokollen åpner for reproduserbar generasjon av svært renset kardiomyocytter og skal legge til rette for ulike nedstrøms analyser er relevante for kardiovaskulær sykdom modellering og narkotika screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
