Abstract
Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMS) hebben een belangrijke bron van cellen aan het ontbreken van primaire cardiomyocyten beschikbaar voor fundamenteel onderzoek en translationeel toepassingen pakken geworden. Om hiPSCs naar cardiomyocyten onderscheiden, zijn verschillende protocollen, waaronder embryoid body (EB) gebaseerde differentiatie en groeifactor inductie ontwikkeld. Echter, deze protocollen zijn inefficiënt en zeer variabel in hun vermogen om gezuiverd cardiomyocyten genereren. Onlangs heeft een klein molecuul gebaseerd protocol gebruik te maken van modulatie van de Wnt / β-catenine signalering werd aangetoond dat cardiale differentiatie met een hoge efficiëntie te bevorderen. Met dit protocol, meer dan 50% -60% van de gedifferentieerde cellen waren troponine-positieve hartspiercellen werden consistent waargenomen. Voor een nog grotere zuiverheid cardiomyocyten werden de gedifferentieerde cellen blootgesteld aan glucose honger specifiek elimineren niet- cardiomyocyten gebaseerd op de metabolische verschils tussen cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten. Met deze selectie strategie, we consequent een toename van meer dan 30% in een verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten als een populatie van gedifferentieerde cellen verkregen. Deze zeer gezuiverde hartspiercellen moet de betrouwbaarheid van de resultaten uit menselijke iPSC-gebaseerde in vitro ziekte modelstudies en screeningstesten voor geneesmiddelen te verbeteren.
Introduction
Primaire menselijke cardiomyocyten moeilijk te verkrijgen vanwege de vereiste invasieve cardiale biopsies moeilijk dissociëren tot enkele cellen, en vanwege de slechte lange termijn overleving van de cel in kweek. Gezien dit gebrek aan primaire menselijke hartspiercellen, patiënt-specifieke humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyte (iPSC-CM) technologie is beschouwd als een krachtig alternatief cardiomyocyte bron voor fundamenteel onderzoek, evenals klinisch en translationeel toepassingen zoals de ziekte van modellering en drugs discovery 1. Vroege pogingen in differentiërende pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten toegepast differentiatie protocollen met embryo lichamen (EB's), maar deze methode is inefficiënt produceren cardiomyocyten omdat vaak minder dan 25% van de cellen in een EB zijn slaan cardiomyocyten 2,3. Relatief, een monolaag gebaseerde differentiatie protocol met de cytokines activine A en BMP4 vertoonde een hoger rendement dan EBS, maarDit protocol is nog relatief inefficiënt, vereist kostbare groeifactoren en werkt alleen in een beperkt aantal humane pluripotente stamcellijnen 4. Onlangs werd een zeer efficiënte, iPSC monolaag gebaseerde hartspierceldifferentiatie protocol ontwikkeld door moduleren Wnt / β-catenine signalering 5. Deze iPSC-CM's te uiten troponine T en alpha actinine, twee sarcomeer eiwitten die standaard markers van hartspiercellen 6 zijn. Het protocol beschrijft hier is een aanpassing van deze kleine moleculen gebaseerde, feeder cel-vrij, monolaag differentiatie methode 5,7. Wij zijn in staat om te verkrijgen verslaan hartspiercellen uit hiPSCs na 7-10 dagen (figuur 1). Overeenkomstig een hartspierceldifferentiatie resulteert in 50% verslaan cellen consistent immunokleuring blijkt dat er een populatie van niet- cardiomyocyten die negatief voor cardiomyocyt- specifieke merkers zoals cardiaal-specifieke troponine T en alfa-actinine zijn. Om further zuiveren cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten elimineren, werden heterogene gedifferentieerde celpopulaties blootgesteld aan honger glucose door ze te behandelen met een extreem lage glucose kweekmedium voor meerdere dagen (figuur 2). Deze behandeling selectief kunnen de niet-cardiomyocyten wegens het vermogen van cardiomyocyten, maar geen niet-cardiomyocyten, lactaat als primaire energiebron metaboliseren om te overleven in een lage glucose omgeving 8. Na deze zuiveringsstap wordt een 40% toename in de verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten waargenomen (Figuur 3, Figuur 4) en deze cellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse genexpressie analyse, ziektemodel en screeningstesten voor geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Vendor informatie voor alle reagentia die in dit protocol is opgenomen in tabel 1 en Materialen List. Alle oplossingen en materialen in contact komen met cellen moeten steriel zijn en aseptische techniek moet dienovereenkomstig worden gebruikt. Voer alle incubaties cultuur in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator tenzij anders vermeld. In dit protocol wordt elk verschil uitgevoerd in 6-well platen, waarbij de hiPSCs worden uitgezet. Volgende differentiatie en zuivering, kunnen cellen worden losgekoppeld en opnieuw uitgeplaat voor downstream gebruik.
1. Medium Bereiding
- Voor het E8 medium, maak een voorraadoplossing per mediumbestanddeel (NaHCO3, L-ascorbinezuur 2-fosfaat, natrium seleniet, transferrine, insuline, FGF2, TGFB1) en bewaar de oplossing bij -20 ° C. Voeg de juiste hoeveelheid voorraad oplossingen om de fles van DMEM / F12 en filteren om te steriliseren. De oplossing krachtvatie en reactie setup voor de voorraad onderdelen en E8 medium is te vinden in tabel 1.
- Voor de extracellulaire matrix oplossing ontdooien de basaalmembraan matrix (gewoonlijk 10 mg / ml bijgeleverd) bij 4 ° CO / N. Matrigel wordt gebruikt voor pluripotente stamcellen kweek omdat de humane pluripotente stamcellen goed kan hechten aan dit materiaal met de alfa-6-beta-1 integrine 9. Eenmaal ontdooid, maak 2.25 mg (250 ui) monsters op ijs met ijskoude pipetpunten en buisjes en bewaar het bij -80 ° C.
- Wanneer precoating platen met ECMS, ontdooien en aliquot de extracellulaire matrix-oplossing (ECMS) op ijs. Meng de ECMS en ijskoude DMEM / F12 medium in een verhouding van 1: 200 op ijs. Koel bewaren om voortijdige ECMS stolling te voorkomen.
- Voor de RPMI / B27 zonder insuline medium, voeg 10 ml B27 Minus Insuline in 500 ml RPMI media.
- Voor de RPMI / B27 (met insuline) medium, voeg 10 ml B27 supplement (met insulin) en 5 ml Pen-Strep antibioticum in 500 ml RPMI medium.
- Voor de lage glucose medium, voeg 10 ml B27 supplement en 5 ml Pen-streptokokken antibiotica in 500 ml glucose vrij RPMI media.
- Voor het bevriezen / cryopreservatie medium, meng foetaal runderserum met dimethylsulfoxide (DMSO) in een 9: 1 verhouding. Het invriesmedium kan maximaal 1 maand bij 4 ° C.
Opmerking: Alle media moeten worden gefilterd en opgeslagen in 4 ° C en binnen 2 weken tenzij anders vermeld. Alle reagens / oplossing volumes hierna gebruikte bestemd voor een enkel putje in een 6-well plaat, tenzij anders vermeld.
2. Pre-coating 6-well platen met ECMS
- Voeg ECMS door mengen basaalmembraan matrix (bv Matrigel) met ijs-koude DMEM / F12 medium in een verhouding van 1: 200, breng 2 ml vers bereide ECMS aan elk putje van een 6-wells plaat. Elk putje in een 6-wells plaat duurt ongeveer 90 mg ECMS ontvangen.
- Incubeer de ECMS beklede platen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Onmiddellijk voorafgaand aan uitplaten cellen zuig DMEM / F12 oplossing uit elk putje. De platen zullen dan klaar zijn om cellen te ontvangen.
3. Het ontdooien van de bevroren hiPSCs
OPMERKING: Nauw deze procedure volgen als het kan leiden tot een optimale kweken en downstream differentiatie van hiPSCs in iPSC-CM's na de vries / dooi cyclus.
- Dooi een flacon van hiPSCs voor elk putje van een 6-wells plaat. Bereid een 15 ml conische buis met 9 ml koud E8 medium met ROCK-remmer (10 uM) voor elke flacon. ROCK-remmer verbetert hiPSCs overleving na cryopreservatie 10. De injectieflacons van 37 ° C waterbad om de cellen ontdooien tot een ongeveer 5 mm diameter ijs kristal verlaten.
- Spuit de buitenkant van de flesjes met 70% ethanol. Veeg de flesjes met tissue papier voordat ze te verplaatsen naar de steriele laminaire kap.
- Breng de cellen in de voorbereide conische buis. Spoel thij eenmaal flesje met 500 pl E8 medium en breng het medium dat de cellen ontdooid op dezelfde conische buis. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 200 x g.
- Zuig de supernatant na centrifugeren en voorzichtig resuspendeer de celpellet met 2 ml E8 medium met ROCK inhibitor (10 uM). Breng de geresuspendeerd cellen om één putje van een 6-wells plaat pre-gecoat met ECMS.
- Vervang het medium met E8 medium zonder ROCK inhibitor na 24 uur kweken. De cellen moeten hebben gehandeld door deze tijd.
4. passage van de hiPSCs
- Typisch passage hiPSCs na het bereiken van 75% -80% confluentie in een 6-wells plaat. Zuig het kweekmedium. Snel wassen putjes met 1 ml steriele PBS RT. Aspireren PBS.
- Voeg 500 ul 0,5 mM EDTA of 1x cel losraken oplossing (bijv Accutase) en incubeer gedurende 1-7 minuten bij kamertemperatuur. Geschikte tijd voor EDTA incubatietijd varieert met de iPSC lijn. Verwachten zichtbare krullen o zienr verdikking kolonies rond de randen, aangezien dit dat EDTA of cel losraken oplossing geeft gereed te verwijderen.
- Zuig het EDTA of de cel onthechting oplossing. Voeg 1 ml E8 medium aangevuld met 10 uM ROCK inhibitor. Verdringen iPSC kolonies in de put door herhaaldelijk en neer te pipetteren en spuiten kolonies af met een P1000 pipet. Kolonies moet worden opgesplitst in 5-10 celklonten na afloop.
- Breng de kolonies die zijn gesuspendeerd in 1 ml medium met E8 ROCK inhibitor in een 15 ml conische buis.
- Verstoren van de grote cel klonten in kleine groepjes in de E8 medium. Voeg een geschikte hoeveelheid E8 media remmer aan de celsuspensie om de cellen te verdunnen. De media volume toevoegen verdunning afhankelijk van de celdichtheid en het aantal putten worden gezaaid. Idealiter zou een 80% confluente putje hiPSCs verdund 1:12.
- Voeg 11 ml E8 medium met ROCK-remmer op de bestaande 1 ml van cell oplossing in genoemde 15 ml conische buis met een 1:12 verdunning te verkrijgen.
- Verder vermaal de cel klonten in kleine cel fragmenten (ongeveer 50-200 cellen in elk fragment is het beste). Voorkomen dat over-triturating als dit vermindert celoverleving.
- Zuig ECMS uit de pre-gecoate platen en voeg 2 ml geresuspendeerd cellen in elk putje. Ongeveer 100.000 cellen per putje van een 6-wells plaat is ideaal. Doel om de cellen gelijkmatig doseren rond de put om clustering van cellen in het midden van de put te vermijden.
- Na 24 uur kweken, vervang het medium met E8 medium zonder ROCK-remmer. Verander het kweekmedium elke 24 uur tot cellen 80% samenvloeiing. Vervolgens worden de cellen weer klaar voor passage. Het duurt meestal 3-6 dagen tussen passages tot 80% samenvloeiing bereiken.
5. Bevriezing hiPSCs
OPMERKING: Nauw deze procedure volgen als het kan leiden tot een optimale kweken en downstream differentiatie van hipSC's in iPSC-CM's na de vries / dooi cyclus.
- Labelen cryogene buizen met de cellijn naam, het type cel, passage nummer, en invriezen datum. Als algemene richtlijn, gebruikt u een flesje voor elk putje van een 6-wells plaat. Bereid een 15 ml conische buis gevuld met 9 ml E8 medium met ROCK-remmer (10 uM). Bereid invriesmedium met 90% FBS en 10% DMSO, en houdt het bij 4 ° C tot gebruik.
- Zuig het kweekmedium, voeg 500 ul 0,5 mM EDTA of 1x cel losraken oplossing en incubeer gedurende 2-7 minuten bij kamertemperatuur. De duur van de blootstelling EDTA of mobiele onthechting oplossing varieert van cellijn tot cellijn.
- Aspireren EDTA of mobiele onthechting oplossing. Voeg 1 ml E8 medium.
- Verdringen iPSC kolonies in de goed door en neer te pipetteren en spuiten kolonies af met een P1000 pipet. Kolonies mogen niet worden gebroken in kleinere dan 100 celklonten. Breng de geschorste cellen naar de voorbereide conische buis met E8. Centrifugeer bij RT gedurende 4 min bij 200 x g.
- Zuig het supernatant en voeg 500 ul koud freezing medium om de pellet. Resuspendeer de pellet door pipetteren 1-2 keer. Celoverleving wordt verbeterd door hem cellen in grote massa.
- Breng de geresuspendeerde cellen in een gemerkte cryogene buis. Bewegen snel de flesjes in een bevriezing container met isopropanol, die zal zorgen voor geleidelijke afkoeling. De container met cellen bij -80 ° C gedurende 24 uur, vervolgens over de cellen vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
6. Cardiale differentiatie van humane iPSC
OPMERKING: Alle media moeten op zijn minst bij RT wanneer toegevoegd.
- Na dissociatie met EDTA of 1x cel onthechting oplossing, zaad ongeveer 100.000 menselijk iPSCs op ECMS gecoat 6 putjes voor differentiatie (dezelfde stappen als cel passage procedures). Wanneer de cellen te bereiken 85% samenvloeiing, veranderen de middellange tot RPMI / B27 zonder insuline medium met 6uM GSK3-beta-remmer CHIR99021 (CHIR) en te onderhouden voor 48 uur.
- Na 48 uur, vervang de CHIR bevattende kweekmedium met RPMI / B27 zonder insuline medium en laat staan voor 24 uur (tot dag 3).
- Op dag 3, veranderen de media om RPMI / B27 zonder insuline met 5 uM Wnt-remmer IWR1 en onderhouden voor 48 uur (tot dag 5).
OPMERKING: Wnt remming kan ook worden geprobeerd op andere kleine molecule verbindingen, zoals beschreven in eerdere studies 11. IWR1 werd gekozen boven andere kleine molecule inhibitoren Wnt vanwege de toegenomen bereik waarin is aangetoond effectief in het remmen Wnt signalering 11 zijn. - Op dag 5, verandert het medium terug naar RPMI / B27 zonder insuline medium en laat voor 48 uur (tot en met dag 7).
- Op dag 7, vervang het medium met RPMI / B27 medium (met insuline) en vervang medium om de 3 dagen daarna met hetzelfde medium. Spontane kloppen van hartspiercellen moet eerst duidelijk zichtbaar zijn op ongeveer dag 8 tot dag10.
7. Zuivering van Human Cardiomyocytes door Glucose Verhongering
- Op dag 10 na differentiatie, wijzigt het medium in elk putje van de 6-well plaat 2 ml lage glucose medium en de cellen behouden in dit medium gedurende 3 dagen (tot dag 13).
- Op dag 13, terug cellen om RPMI / B27 medium (met insuline).
- Eventueel replate cardiomyocyten vóór de tweede ronde van glucose honger te helpen los niet- cardiomyocyten van de kweekplaat, waardoor gemakkelijker dissociatie van niet- cardiomyocyten in glucose uithongering.
- Op dag 13, aspireren medium, eenmaal wassen met PBS, en dissociëren de cellen in enkele cellen met 500 ul cel dissociatie enzym gedurende 5 min bij 37 ° C. Specifiek, na 5 min enzym behandeling, gebruik 1.000 ul pipet handmatig cardiomyocyten van de 6-well plaat dissociëren door herhaaldelijk trekken de cel dissociatie enzym en sproeien tegen cardiomyocyte monolaag. Tot 30 pipetteren herhalingen kan worden verplicht om de hartspiercellen distantiëren in enkele cellen.
- Nadat cellen gedissocieerd en in eencellige vorm verzamel alle cellen in een 15 ml conische buis gevuld met 5 ml van RPMI / B27-medium met insuline verdund uit de cel dissociatie enzym en centrifugeer gedurende 4 min bij 200 x g. Zuig en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de cellen met 2 ml RPMI / B27 medium en plaat op een nieuw ECMS-beklede 6-wells plaat. Typisch, hogere samenvloeiing van hartspiercellen helpt met celoverleving tijdens opnieuw platen. Streven naar 2 miljoen cellen per nieuwe 6-well schotel voor optimale overlevingskansen replate tijdens opnieuw platen.
- Op dag 14, verandert het weer als 2 ml van laag glucose medium voor een tweede glucosedeprivatie cyclus. De cultuur van de cellen in deze laag glucose staat voor 3 dagen. De meeste niet-cardiomyocyten zal sterven in dit lage glucose kweekomstandigheid.
- Op dag 17, veranderen de middellange tot 2 ml RPMI / B27 medium met insuline. De resterende cellen wordt sterk gezuiverde cardiomyocyten. Deze hartspiercellen kunnen worden gebruikt voor gen-expressie analyse, drug screening, metaboolanalyse en diverse andere stroomafwaarts assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De morfologische veranderingen tijdens iPSC differentiatie.
De iPSC gekweekt in voedingsvrije platen groeide als platte, tweedimensionale kolonies. Bij het bereiken van ongeveer 85% samenvloeiing, werden hiPSCs behandeld met 6 uM CHIR voor differentiatie (figuur 1A). Aanzienlijke hoeveelheden van celdood, een normaal en veel voorkomend verschijnsel, werden waargenomen na 24 uur van CHIR behandeling. Na twee dagen van CHIR behandeling, de hiPSCs verder differentiëren naar mesodermale lot. In vergelijking met cellen in iPSC kolonies, celgrootte deze dag 2 cellen verhoogd. Cel nummer ook toegenomen door celdeling (Figuur 1B). Op dag 5 werden de mesodermale cellen gericht cardiale afstamming (cardiaal mesoderm). Momenteel cellen beginnen coalescentie en vormen karakteristieke vertakte structuren (figuur 1C). Op dag 10 werden de tak-achtige structuren zeer uitgesproken, en hartspiercellen sterted spontaan verslaan (figuur 1D). Terminaal gedifferentieerde hartspiercellen zal niet vermenigvuldigen voorbij dit punt. Een chronologie van de differentiatie protocol wordt getoond in figuur 2.
Immunokleuring en flow cytometrie resultaten toonden cardiomyocyten werden gezuiverd met glucose honger.
Na 10 dagen van differentiatie, meer dan 50% van de cellen gebieden slaan. Echter, het verslaan van cel vellen soms worden ook vermengd met niet-hartspiercellen. Om cardiomyocyte zuiverheid te onderzoeken, werden de cellen met immunostaining tegen cardiomyocyte marker cardiaal troponine-T (cTnT) gekenmerkt te vinden dat de meeste cellen waren cTnT positief. In een ongezuiverde populatie van gedifferentieerde cellen, een aantal cellen ook ontbrak expressie van cTnT, suggereert de aanwezigheid van niet-cardiomyocyten als deze gedifferentieerde populatie op dag 13 (Figuur 3A). Echter, met glucose honger,bijna alle resterende cellen waren cTnT positief op dag 13 (Figuur 3B), wat aangeeft succesvolle zuivering van de hartspiercellen volgende glucose hongerdood. Deze gegevens werden verder bevestigd met behulp van flowcytometrieanalyse. Een populatie van gedifferentieerde cellen op dag 13 na de differentiatie bevatte ongeveer 50% TNNT2 + cellen die niet glucose uitgehongerd (figuur 4A). Een parallel differentiatie werd ook uitgevoerd, maar met een 3-daagse glucose ontbering beginnend op dag 10 na differentiatie. In tegenstelling tot de unstarved differentiatie glucosedeprivatie tot een gezuiverde populatie met 90% TNNT2 + cellen op dag 13 (Figuur 4B).
Figuur 1. De opeenvolgende morfologische veranderingen tijdens iPSC differentiatie naar de cardiale lijn. (A) gedifferentieerde hiPSCsop dag 0 vertonen typische kolonie morfologie en bereikt ongeveer 85% samenvloeiing. (B) Op dag 2 werden cellen na behandeling met CHIR twee dagen bereikte 100% confluentie en ging de mesodermale lijn. (C) Op dag 5 werden de cellen na behandeling met IWR1 gedurende 2 dagen ging de cardiale mesoderm fase. Sommige cellen begon te smelten en vormen karakteristieke branch-achtige morfologie (aangegeven door pijlen). (D) Op dag 7-10, tak-achtige structuren zijn zeer duidelijk, en hartspiercellen beginnen spontaan te verslaan. Bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Tijdlijn van iPSC-CM differentiatie protocol en latere glucose verhongeringsproces. Beating cardiomyocyten een re typisch eerst waargenomen bij ongeveer 7-10 dagen. Twee rondes van glucose hongerdood zal resulteren in een gezuiverde populatie van hartspiercellen op dag 17. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Immunofluorescentie onthult zuivering van hartspiercellen volgende glucose verhongering. (A) Ongezuiverd cellen na 13 dagen van de differentiatie werden gekleurd met troponine T (cTnT). De meeste cellen zijn gedifferentieerd in cardiomyocyten en waren cTnT positief, maar een aantal niet-cardiale, cTnT-negatieve cellen aanwezig. (B) daarentegen na 3 dagen glucose verhongering beginnend op dag 10 bijna alle overlevende cellen cTnT positief op dag 13. Schaal bar = 200 urn.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Flow cytometrie openbaart zuivering van cardiomyocyten na glucose verhongering. (A) na 13 dagen van cardiale differentiatie zonder glucose honger, een populatie van cellen vertoonden ongeveer 50% TNNT2 + cardiomyocyten. Rood geeft aan dat de gedifferentieerde cel populatie en blauw geeft ongedifferentieerde hiPSCs als negatieve controle. (B) Na 10 dagen van cardiale differentiatie en gevolgd door 3 dagen van glucose honger, een populatie van cellen uit dezelfde partij van differentiaties werd gezuiverd tot 90% TNNT2 + hartspiercellen bevatten. Klik hier om tebekijk een grotere versie van deze figuur.
| De composities voor E8 medium | |||
| E8 | Volume: 1 L | Vennootschap | Catalogusnummer |
| DMEM / F12 met glutamine en HEPES | 1000 ml | Invitrogen | 11330-032 |
| NaHCO3 (7,5%, 75 mg / ml) | 7,24 ml | Invitrogen | 25080-094 |
| L-ascorbinezuur 2-fosfaat (64 mg / ml) | 1 ml | Sigma | A8960 |
| natriumseleniet (70 ug / ml) | 200 gl | Sigma | S5261 |
| transferrine (50 mg / ml) | 214 ul | Sigma | T3705 |
| insuline (4 mg / ml) 5 ml | Invitrogen | 12585-014 | |
| FGF2 (200 ng / ul) | 500 pi | Peprotech | 100-18B |
| TGFB1 (100 ng / ul) | 20 gl | Peprotech | 100-21 |
| De voorraad oplossingen voor E8 composities | |
| L-ascorbinezuur-2-fosfaat (64 mg / ml) | 3,2 g in 50 ml ultrazuiver water, opslag 500 ul aliquots bij -20 ° C |
| Transferrine (50 mg / ml) | 500 mg in 10 ml ultrazuiver water, opslag 107 ul aliquots bij -20 ° C |
| Natrium seleniet (70 ug / ml) | 35 mg natrium seleniet in 500 ml ultrazuiver water, opslag 100 ul aliquots bij -20 ° C |
| FGF2 (200 ng / ul) | 1 mg in 5 ml koude D-PBS, opslag 250 ul aliquots bij -20 ° C |
| TGFB1 (100 ng / ul) | 100 mg in 1 ml koude 10 mM citroenzuur, pH 3, opslag 10 pi aliquots bij -20 ° C |
Tabel 1. Samenstelling van E8 Medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het verkrijgen van een grote hoeveelheid zeer zuivere-iPSC afgeleide cardiomyocyten cruciaal voor fundamenteel cardiale onderzoek als klinische en translationele toepassingen. Cardiale differentiatie protocollen enorme verbeteringen ondergaan in de afgelopen jaren, overgang van embryoid body gebaseerde werkwijzen die gebruik cardiogene groeifactoren 2, sandwich werkwijzen 12 matrix, en uiteindelijk naar kleine moleculen gemoduleerd en monolaag-gebaseerde methoden 5. Van de bovengenoemde protocollen, de hier beschreven protocol het snelst en meest reproduceerbare cardiale differentiatie efficiëntie van verschillende iPSC cellijnen door modulatie Wnt / β-catenine signalering via de kleine moleculen CHIR en IWR 5,7. In het bijzonder werden de ongedifferentieerde hiPSCs aangezet tot mesodermaal differentiatie ondergaan met de GSK3-beta-remmer CHIR en de daaropvolgende cardiale differentiatie met de Wnt-signalering remmer IWR1. Deze opeenvolgende stappen vanWnt-signalering modulatie, geholpen door insuline uitputting tijdens de cardiale lineage inductiefase, leidde tot zeer efficiënte cardiale differentiatie. CHIR een gemeenschappelijk klein molecuul GSK3 beta-remmer voor mesodermale inductie, maar andere kleine moleculen voor GSK3-beta remming getest in cardiomyocyten differentiatie protocollen 11. Meerdere opties worden ook gebruikt voor de volgende kleine molecule inhibitor Wnt. Bijvoorbeeld, een recente publicatie gericht op chemisch gedefinieerde differentiatie van pluripotente stamcellen tot cardiomyocyten gebruikt 2 uM Wnt-C59 doeltreffende Wnt remming en cardiaal mesoderm inductie 11.
Bovendien, de gedifferentieerde cardiomyocyten met een glucose honger werkwijze werden verder gezuiverd, dat profiteert van de afzonderlijke glucose metabolisme stromen bestaan tussen cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten 8. Het is noodzakelijk op te merken dat de doeltreffendheid van de glucose hongerdood methode is density-afhankelijke (dwz, differentiaties dat hogere percentages van hartspiercellen opgeleverd hebben meer kans op grotere cardiomyocyte overleving te bereiken). De overgang naar het lage glucose-medium ook een stressvolle voorwaarde voor de cardiomyocyten. Het is belangrijk om de cellen terug naar de normale RPMI / B27 insuline medium veranderen na 3 dagen van glucose verhongering. In dit protocol werd een voedingsvrije groei gebruikte systeem, waarin pluripotente stamcellen werden gekweekt op voeder muis embryonale fibroblasten (MEF). Echter, voorafgaand cardiale differentiatie protocollen-feeder systemen toegepast voor cardiomyocyten produceren uit pluripotente stamcellen 5. Evenzo hebben voorafgaand protocollen ook mTeSR1 medium voor stamceltransplantatie onderhoud, maar de E8 media en voedingsvrije systeem hier gebruikte superieur vanwege zijn eenvoud en geen overtollige xenogene componenten zoals runderserumalbumine en muis embryonale fibroblasten.
Momenteel,pluripotente stamcellen differentiatie naar cardiomyocyte geslachten is grotendeels robuust, maar nog steeds lijdt aan iPSC line-to-line variabiliteit in termen van efficiëntie. Dit blijft een belangrijk thema in de differentiatie veld cardiale en zal verder onderzoek nodig zijn. De differentiatie efficiëntie door goed onderhoud van iPSC lijnen, en in het bijzonder het voorkomen overconfluency tijdens iPSC onderhoud. Extra variabiliteit komt voort uit zaaien van cellen tijdens de passage proces als gelijkmatig gezaaid monolaag van hiPSCs neiging tot de beste totale differentiaties geven. Hier werd een muis-afgeleide, Matrigel-gebaseerde ECMS voor cel zaaien tijdens celcultuur met succes gebruikt, maar een eventuele overgang naar xeno-vrije ondergronden wordt aanbevolen. Met betrekking tot de cel zaaien op ECMS, ongelijke zaaien resulteert vaak in ongelijke verdeling van hartspiercellen binnen een bepaald goed. Als bijvoorbeeld hiPSCs ongelijk gezaaid, de randen van een goed in een zes-well plaat kan aanleiding geven tot highaar aantal cardiomyocyten dan het midden van de put. Deze ongelijkheid enten omstandigheden kunnen leiden tot lage differentiaties efficiëntie en een groter aantal niet-cardiomyocyt, endodermale afgeleiden zoals fibroblasten en gladde spiercellen geven. We hebben ook waargenomen dat lage rendement differentiaties (minder dan 50%) zijn veel moeilijker te zuiveren volgens de hieronder vermelde glucosedeprivatie proces. Een ander neveneffect van de lange termijn glucose honger is een potentieel verlies in cardiomyocyte levensvatbaarheid. Hoewel de cardiomyocyten kunnen lactaat metaboliseren in afwezigheid van glucose, vinden we dat deze schakelaar een laag glucose omgeving belastend voor de cellen. Cellen kunnen spontaan stoppen met kloppen, en sommige mobiele verlies kan worden waargenomen als glucose hongerdood wordt verlengd voorbij de aanbevolen tijd. Deze verbeterde gevoeligheid voor glucose ontbering kan een afspiegeling is van de gevestigde ontwikkelingsstoornissen, functioneel, en elektrofysiologische onvolwassenheid van stamcellen afgeleide cardiomyocy zijntes in vergelijking met echte volwassen hartspiercellen 13.
Samengevat, de hier beschreven protocol combineert de kleine moleculen gebaseerde, iPSC monolaag cardiale differentiatie werkwijze met cardiomyocyten zuiverende glucose honger methode. Dit protocol maakt het mogelijk om reproduceerbare generatie hoog gezuiverd hartspiercellen en moeten verschillende stroomafwaarts assays tot hart- en vaatziekten modellering en drug discovery relevant zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
