Abstract
Menneskelige induceret pluripotente stamceller celleafledte cardiomyocytter (hiPSC-CMS) er blevet en vigtig celle kilde til at afhjælpe manglen på primære cardiomyocytes rådighed for grundforskning og translationelle applikationer. For at differentiere hiPSCs i cardiomyocytter har forskellige protokoller, herunder embryoid legeme (EB) -baseret differentiering og vækstfaktor induktion blevet udviklet. Men disse protokoller er ineffektive og meget varierende i deres evne til at generere oprensede cardiomyocytter. For nylig blev et lille molekyle-baseret protokol under anvendelse modulering af Wnt / β-Catenin signalering vist sig at fremme hjerte- differentiering med høj effektivitet. Med denne protokol, mere end 50% -60% af differentierede celler var kardial troponin-positive cardiomyocytter blev konsekvent overholdes. For yderligere at øge cardiomyocyte renhed blev de differentierede celler udsat for glucose sult specifikt fjerne ikke-cardiomyocytter baseret på den metaboliske forskels mellem cardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter. Brug dette valg strategi, vi konsekvent opnået en stigning på over 30% i forholdet kardiomyocytter til ikke-kardiomyocytter i en population af differentierede celler. Disse meget oprensede cardiomyocytter bør øge pålideligheden af resultaterne fra human iPSC-baserede in vitro sygdom modellering undersøgelser og lægemiddelscreeningsassays.
Introduction
Primære humane cardiomyocytter er vanskeligt at opnå på grund af kravet om invasive hjerte- biopsier, svært ved at dissociere til enkelte celler, og på grund af dårlig langvarig celleoverlevelse i kultur. I betragtning af denne mangel på primære humane cardiomyocytter, patient-specifikke menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledt cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknologi er blevet betragtet som et godt alternativ cardiomyocyte kilde til grundforskning samt kliniske og translationelle applikationer såsom sygdom modellering og narkotika discovery 1. Tidlige indsats differentiere pluripotente stamceller i kardiomyocytter ansat differentiering protokoller der anvender embryoide organer (EBS), men denne metode er ineffektiv i producerer cardiomyocytter fordi ofte mindre end 25% af cellerne i en EB er at slå cardiomyocytter 2,3. Forholdsvis, et monolag differentiering protokol ved hjælp af cytokiner Activin A og BMP4 viste en højere effektivitet end EB'er, mendenne protokol er stadig relativt ineffektiv, kræver dyre vækstfaktorer og fungerer kun i et begrænset antal humane pluripotente stamcellelinjer 4. For nylig blev en yderst effektiv, hiPSC monolag-baserede cardiomyocyte differentiering protokol udviklet ved at modulere Wnt / β-Catenin signalering 5. Disse hiPSC-CMS udtrykke kardial troponin T og alfa actinin, to sarcomerisk proteiner, som er standard markører for cardiomyocytter 6. Protokollen beskriver her er en tilpasning af dette lille molekyle-baserede, feeder celle-fri, monolag differentiering metode 5,7. Vi er i stand til at opnå slå cardiomyocytter fra hiPSCs efter 7-10 dage (Figur 1). Men efter en cardiomyocyte differentiering resulterer i 50% at slå celler, immunfarvning konsekvent viser, at der findes en population af ikke-cardiomyocytter, der er negative for cardiomyocyte-specifikke markører, såsom hjerte--specifikke troponin T og alpha-actinin. Til further oprense cardiomyocytter og fjerne ikke-cardiomyocytter blev heterogene differentierede cellepopulationer underkastet glucose sult ved at behandle dem med en ekstremt lav glucose dyrkningsmedium til flere dage (figur 2). Denne behandling selektivt fjerner ikke-cardiomyocytter skyldes muligheden af cardiomyocytter, men ikke ikke-cardiomyocytter at metabolisere lactat som den primære energikilde for at overleve i en lav glucose miljø 8. Efter dette rensningstrin, observeres en stigning i forholdet af cardiomyocytter til ikke-cardiomyocytter 40% (figur 3, figur 4), og disse celler kan anvendes til nedstrøms genekspression analyse sygdomsmodeller og lægemiddel-screeningsassays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Sælger information for alle reagenser i denne protokol er blevet opført i tabel 1 og Materialer List. Alle løsninger og udstyr, der kommer i kontakt med celler skal være sterile, og aseptisk teknik skal anvendes i overensstemmelse hermed. Udfør alle kultur inkubationer i en befugtet 37 ° C, 5% CO 2-inkubator, medmindre andet er angivet. I denne protokol, er alle differentieringer udført i 6-brønds plader, hvor hiPSCs er seedede. Efter differentiering og rensning, kan celler adskilles og genudpladet til downstream brug.
1. Medium Forberedelse
- For E8 medium, gør en stamopløsning for hvert medium komponent (NaHCO3, L-ascorbinsyre-2-phosphat, natriumselenit, transferrin, insulin, FGF2, TGFB1) og lagre opløsningerne ved -20 ° C. Tilføj passende mængde stamopløsninger til flasken DMEM / F12 og filter at sterilisere. Opløsningen concentration og reaktion setup for bestanden komponenter og E8 medium kan findes i tabel 1.
- For den ekstracellulære matrix-opløsning, optø basalmembranmatrix (almindeligvis tilføres ved 10 mg / ml) ved 4 ° CO / N. Matrigel er almindeligt anvendt til pluripotente stamcelle kultur, fordi humane pluripotente stamceller kan klæbe godt til dette materiale under anvendelse af alfa-6-beta-1-integrin 9. Når optøet, lave 2,25 mg (250 pi) portioner på is ved hjælp af is koldt pipettespidser og rør og gemme portioner ved -80 ° C.
- Når præcoating plader med ECMS, tø og udportionerer den ekstracellulære matrix opløsning (ECMS) på is. Bland ECMS og iskold DMEM / F12-medium i et forhold på 1: 200 på is. Opbevares køligt at forhindre for tidlig ECMS størkning.
- For RPMI / B27 uden insulin medium, tilsættes 10 ml B27 Minus Insulin i 500 ml RPMI medier.
- For RPMI / B27 (med insulin) medium, tilsættes 10 ml B27 Supplement (med insulin) og 5 ml Pen-strep antibiotikum i 500 ml RPMI medier.
- For lav glucose medium, tilsættes 10 ml B27 supplement og 5 ml Pen-strep antibiotikum i 500 ml glucose-frit RPMI-medium.
- For fryse / kryopræservering medium, blandes kalvefosterserum sammen med dimethylsulfoxid (DMSO) ved en 9: 1-forhold. Den frysemedium kan opbevares i op til 1 måned ved 4 ° C.
BEMÆRK: Alle medier bør filtreres og opbevares i 4 ° C og anvendt inden for 2 uger, medmindre andet er angivet. Alle reagens / løsning, der bruges nedenfor mængder er beregnet til en enkelt brønd i en 6-brønds plade, medmindre andet er angivet.
2. Præ-coating 6-brønds plader med ECMS
- Gør ECMS ved blanding basalmembranmatrix (fx Matrigel) med iskold DMEM / F12-medium i et forhold på 1: 200, derefter anvende 2 ml frisk gjort ECMS til hver brønd i en 6-brønds plade. Hver brønd i en 6-brønds plade får ca. 90 mg ECMS.
- Inkubér ECMS belagte plader i 1 time ved 37 ° C. Umiddelbart før udpladning celler, aspireres DMEM / F12 opløsning fra hver brønd. Pladerne vil derefter være klar til at modtage celler.
3. optøning af frosne hiPSCs
BEMÆRK: Nøje følge denne procedure, da det kan føre til optimal dyrkning og nedstrøms differentiering af hiPSCs i hiPSC-CMS efter fryse / tø cyklus.
- Optøs et hætteglas med hiPSCs for hver brønd i en 6-brønds plade. Forbered en 15 ml konisk rør med 9 ml kold E8 medium med ROCK-hæmmer (10 uM) for hvert hætteglas. ROCK inhibitor forbedrer hiPSCs overlevelse efter kryopræservering 10. Opbevar hætteglassene i 37 ° C vandbad for at optø cellerne, indtil en ca. 5 mm i diameter iskrystal tilbage.
- Spray ydersiden af hætteglassene med 70% ethanol. Tør hætteglas med silkepapir, før du flytter dem til den sterile laminar hætte.
- Overfør cellerne i den forberedte konisk rør. Skyl than hætteglas gang med 500 pi E8 medium og overføre mediet indeholdende de optøede celler til den samme koniske rør. Der centrifugeres ved stuetemperatur i 4 minutter ved 200 x g.
- Aspirer supernatanten efter centrifugering og forsigtigt resuspender cellepelleten med 2 ml E8 medium med ROCK inhibitor (10 uM). Overfør resuspenderede celler til en brønd i en plade med 6 brønde præ-overtrukket med ECMS.
- Udskift mediet med E8 medium uden ROCK inhibitor efter 24 timer af dyrkning. Celler skulle have levet på dette tidspunkt.
4. Passage af hiPSCs
- Typisk passage hiPSCs Efter at have nået 75% -80% konfluens i en 6-brønds plade. Aspirer dyrkningsmediet. Hurtigt vaske brønde med 1 ml sterilt, RT PBS. Aspirer PBS.
- Der tilsættes 500 pi 0,5 mM EDTA eller 1x celle løsrivelse opløsning (f.eks Accutase) og inkuberes i 1-7 minutter ved stuetemperatur. Passende tidspunkt for EDTA inkubation varierer med hiPSC linje. Forvent at se synlige curling or fortykkelse af kolonier omkring kanterne, da dette vil indikere, at EDTA eller celle løsrivelse opløsning er klar til at blive fjernet.
- Aspirer EDTA eller celle løsrivelse opløsning. Der tilsættes 1 ml E8 medium suppleret med 10 pM ROCK inhibitor. Fortrænges hiPSC kolonier i brønden ved gentagen pipettering op og ned og sprøjtning kolonier med en P1000 pipette. Kolonier bør opdeles i 5-10 celleklumper efter afslutningen.
- Overfør kolonierne, der er suspenderet i 1 ml E8 medium med ROCK inhibitor i et 15 ml konisk rør.
- Sprænges store celleklumper i små klumper i E8 medium. Tilsæt en passende mængde E8 medier med inhibitor til cellesuspensionen for at fortynde cellerne. Medierne volumen for at tilføje til fortynding afhænger celledensiteten og antallet af brønde, der skal podes. Ideelt set bør en enkelt, 80% sammenflydende godt af hiPSCs fortyndes 1:12.
- Tilføj 11 ml E8 medium med ROCK-hæmmer de eksisterende 1 ml cell opløsning i ovennævnte 15 ml konisk rør til opnåelse af en 1:12 fortynding.
- Yderligere tritureres celleklumper i små cellefragmenter (ca. 50-200 celler i hvert fragment er bedst). Undgå over-triturering da dette reducerer celle overlevelse.
- Aspirer ECMS fra de forud overtrukne plader og tilsættes 2 ml resuspenderet celler i hver brønd. Ca. 100.000 celler per brønd af en 6-brønds plade er ideelle. Målet er at dispensere cellerne jævnt omkring godt for at undgå klynger af celler i centrum af brønden.
- Efter 24 timer af dyrkning, erstatte mediet med E8 medium uden ROCK inhibitor. Skift dyrkningsmediet hver 24 timer, indtil cellerne bliver 80% sammenflydende. Derefter er cellerne klar til passage igen. Det tager normalt 3-6 dage mellem passager for at nå 80% konfluens.
5. Frysning hiPSCs
BEMÆRK: Nøje følge denne procedure, da det kan føre til optimal dyrkning og nedstrøms differentiering af HIPSC'er i hiPSC-CMS efter fryse / tø cyklus.
- Mærk kryogene rør med cellelinien navn, celletype, passage nummer og frysning dato. Som en generel retningslinje, skal du bruge et hætteglas til hver brønd i en 6-brønds plade. Forbered en 15 ml konisk rør fyldt med 9 ml E8 medium med ROCK inhibitor (10 uM). Forbered frysemedium med 90% FBS og 10% DMSO, og holde ved 4 ° C, indtil klar til brug.
- Aspirer dyrkningsmediet tilsættes 500 pi 0,5 mM EDTA eller 1x celle løsrivelse opløsning og inkuberes i 2-7 minutter ved stuetemperatur. Varigheden af EDTA eller celle løsrivelse opløsning eksponering varierer fra cellelinje til cellelinje.
- Aspirer EDTA eller celle løsrivelse opløsning. Der tilsættes 1 ml E8 medium.
- Fortrænges hiPSC kolonier i brønden ved pipettering op og ned og sprøjtning kolonier med en P1000 pipette. Kolonier bør ikke opdeles i mindre end 100 celleklumper. Overfør suspenderede celler til det fremstillede koniske rør indeholdende E8. Der centrifugeres ved RT i 4 minutter ved 200 x g.
- Aspirer supernatanten og tilsæt 500 pi kold frysning medium til pelleten. Pelleten resuspenderes ved pipettering 1-2 gange. Celleoverlevelse forbedres ved at holde cellerne i store klumper.
- Overfør resuspenderede celler i et mærket kryogen rør. Hurtigt flytte hætteglassene i en frysning beholder indeholdende isopropanol, hvilket vil give mulighed for gradvis afkøling. Hold beholderen med cellerne ved -80 ° C i 24 timer, og derefter overføre cellerne til flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
6. Cardiac differentiering af humane iPSC
BEMÆRK: Alle medier bør være mindst ved stuetemperatur, når den tilsættes.
- Efter dissociation med EDTA eller 1x celle detachement løsning, frø ca. 100.000 humane iPSCs på ECMS belagt 6-brønds dyrkningsplader til differentiering (samme fremgangsmåde som celle overførselsteknikker procedurer). Når cellerne når 85% konfluens, ændre mediet til RPMI / B27 uden insulin medium med 6iM GSK3-beta-hæmmer CHIR99021 (CHIR) og vedligeholde i 48 timer.
- Efter 48 timer, skal du udskifte CHIR-holdige dyrkningsmedium med RPMI / B27 uden insulin medium og lade alene i 24 timer (indtil dag 3).
- På dag 3, ændre medierne til RPMI / B27 uden insulin med 5 uM Wnt inhibitor IWR1 og vedligeholde i 48 timer (indtil dag 5).
BEMÆRK: Wnt inhibering kan også forsøgt under anvendelse af andre forbindelser med små molekyler, som beskrevet i tidligere undersøgelser 11. IWR1 blev valgt frem for andre små molekyler Wnt inhibitorer på grund af øget interval, hvor det har vist sig at være effektive til inhibering af Wnt signalering 11. - På dag 5, ændre mediet tilbage til RPMI / B27 uden insulin medium og lad i 48 timer (indtil dag 7).
- På dag 7, erstatte mediet med RPMI / B27 medium (med insulin) og erstatte medium hver 3. dag derefter med det samme medium. Spontan slå af cardiomyocytter skal først være synlig på ca. dag 8 til dag10.
7. Oprensning af menneskelige Cardiomyocytter gennem glukose Sult
- På dag 10 post-differentiering, ændre mediet i hver brønd i 6-brønds plade til 2 ml lav glucose-medium og opretholde cellerne i dette medium i 3 dage (indtil dag 13).
- På dag 13 tilbage celler til RPMI / B27 medium (med insulin).
- Eventuelt replate kardiomyocytter forud for anden runde af glukose sult at hjælpe med at løsne ikke-kardiomyocytter fra kultur plade, der giver mulighed for lettere dissociation af ikke-kardiomyocytter under glucose sult.
- På dag 13 aspireres mediet, vaskes en gang med PBS, og dissociere cellerne i enkelte celler under anvendelse af 500 pi cell dissociation enzym i 5 minutter ved 37 ° C. Specifikt, efter 5 min af enzymbehandlingen bruge en 1.000 pi pipette manuelt dissociere cardiomyocytter fra 6-brønds plade ved gentagne gange at trække op cellen dissociation enzym og sprøjtning mod cardiomyoCyte monolag. Op til 30 pipettering gentagelser kan være nødvendigt at adskille kardiomyocytter i enkeltceller.
- Efter cellerne dissocieres og er i encellede form indsamle alle celler i et 15 ml konisk rør fyldt med 5 ml RPMI / B27 medium med insulin til at fortynde den celle dissociation enzym og centrifugeres i 4 minutter ved 200 x g. Aspirer og kassér supernatanten.
- Re-suspendere cellerne med 2 ml RPMI / B27 medium og plade på en ny ECMS-belagt 6-brønds plade. Typisk højere konfluens på cardiomyocytter hjælper med celleoverlevelse under genudplade. Til formål at replate 2 millioner celler pr ny 6-godt fad for optimal overlevelse under genudplade.
- På dag 14 ændre mediet tilbage til 2 ml lav glucose-medium til en anden glucosemangel cyklus. Kultur cellerne i denne lave glukose tilstand i 3 dage mere. De fleste af de ikke-cardiomyocytter vil dø i denne lav-glucose dyrkningsbetingelser.
- På dag 17, ændre mediet til 2 ml RPMI / B27 medium med insulin. De resterende celler vil være højt oprensede cardiomyocytter. Disse cardiomyocytter kan anvendes til genekspression analyse lægemiddelscreening, metabolisk analyse, og forskellige andre downstream assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De morfologiske ændringer i hiPSC differentiering.
Den hiPSC dyrket i fødefri plader voksede som flade, todimensionelle kolonier. Da de nåede omkring 85% konfluens, blev hiPSCs behandlet med 6 uM CHIR for differentiering (figur 1A). Betydelige mængder af celledød, en normal og almindeligt fænomen, blev observeret efter 24 timer af CHIR behandling. Efter to dages CHIR behandling, de hiPSCs fortsat at differentiere hen imod en mesodermal skæbne. I sammenligning med celler i hiPSC kolonier cellestørrelse for disse dag 2-celler øges. Celleantal steg også gennem celledeling (figur 1B). På dag 5 blev mesodermale celler rettet mod hjertets afstamning (hjerte mesoderm). På dette tidspunkt, begynder cellerne sammensmeltende og danner karakteristiske, gren-lignende strukturer (figur 1C). På dag 10 blev gren-lignende strukturer meget udtalt, og cardiomyocytter stjerneTed spontant bankende (figur 1D). Terminalt differentierede cardiomyocytter vil ikke formere sig ud over dette punkt. En tidslinje for differentiering protokol er vist i figur 2.
Immunfarvning og flowcytometri Resultaterne viste cardiomyocytter blev oprenset med glucose sult.
Efter 10 dages differentiering, er mere end 50% af celleområder slå. Men beating celle arkene nogle gange også blandet med ikke-kardiomyocytter. For at undersøge cardiomyocyte renhed blev celler med immunfarvning mod cardiomyocyte markør cardiac troponin-T (cTnT), kendetegnet at finde, at de fleste celler var cTnT positive. Men i en uoprenset population af differentierede celler, et antal celler manglede også ekspression af cTnT, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ikke-cardiomyocytter i denne differentierede population på dag 13 (figur 3A). Men med glucose sult,næsten alle resterende celler var cTnT positive på dag 13 (figur 3B), hvilket indikerer vellykket oprensning af cardiomyocytter efter glukose sult. Disse data blev yderligere bekræftet ved hjælp af flowcytometri analyse. En population af differentierede celler på dag 13 post-differentiering indeholdt ca. 50% TNNT2 + celler, når ikke glucose sultet (figur 4A). En parallel differentiering blev også udført, men med en 3 dages glucosemangel begyndende på dag 10 efter differentiering. I modsætning til den unstarved differentiering, glucosemangel førte til en oprenset population indeholdende 90% TNNT2 + -celler på dag 13 (figur 4B).
Figur 1. De sekventielle morfologiske ændringer i hiPSC differentiering mod hjerte- afstamning. (A) Udifferentierede hiPSCspå dag 0 udviser typisk koloni morfologi og nåede omkring 85% konfluens. (B) På dag 2, celler efter behandling med CHIR i to dage nåede 100% konfluens og indtastet mesodermal afstamning. (C) På dag 5 blev cellerne efter behandling med IWR1 2 dage indtastede hjertets mesoderm fase. Nogle celler begyndte at smelte og danne karakteristiske gren-lignende morfologier (angivet med pile). (D) På dag 7-10, gren-lignende strukturer er meget tydelig, og cardiomyocytter begynder spontant bankende. Bar = 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Tidslinje for hiPSC-CM differentiering protokol og efterfølgende glukose sult proces. Bankende cardiomyocytter a re typisk først observeret ved ca. dage 7-10. To runder af glukose sult vil resultere i en oprenset population af cardiomyocytter ved dag 17. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Immunofluorescens afslører oprensning af cardiomyocytes efter glukose sult. (A) urenset celler efter 13 dages differentiering blev farvet med kardial troponin T (cTnT). De fleste celler er differentieret i cardiomyocytter og var cTnT positive, men en række ikke-hjerte-, cTnT-negative celler er også til stede. (B) I modsætning hertil efter en 3 dages glukose sult begynder på dag 10, næsten alle de overlevende celler var cTnT positive ved dag 13. Scale bar = 200 um.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Flow cytometri afslører oprensning af cardiomyocytes efter glukose sult. (A) Efter 13 dages hjerte-differentiering uden glukose sult, en population af celler udviste omkring 50% TNNT2 + kardiomyocytter. Rød angiver differentieret cellepopulation og blå indikerer udifferentierede hiPSCs som en negativ kontrol. (B) Efter 10 dages hjerte-differentiering og efterfulgt af 3 dage med glukose sult blev en population af celler fra samme parti differentieringer renset til at indeholde 90% TNNT2 + kardiomyocytter. Klik her for atse en større version af dette tal.
| Præparaterne til E8 medium | |||
| E8 | Volume: 1 l | Firma | Katalog nummer |
| DMEM / F12 med glutamin og HEPES | 1000 ml | Invitrogen | 11330-032 |
| NaHCO3 (7,5%, 75 mg / ml) | 7.24 ml | Invitrogen | 25080-094 |
| L-ascorbinsyre-2-phosphat (64 mg / ml) | 1 ml | Sigma | A8960 |
| natriumselenit (70 ug / ml) | 200 pi | Sigma | S5261 |
| transferrin (50 mg / ml) | 214 pi | Sigma | T3705 |
| insulin (4 mg / ml) 5 ml | Invitrogen | 12585-014 | |
| FGF2 (200 ng / pl) | 500 pi | Peprotech | 100-18B |
| TGFB1 (100 ng / pl) | 20 pi | Peprotech | 100-21 |
| De stamopløsninger til E8 kompositioner | |
| L-ascorbinsyre-2-phosphat (64 mg / ml) | 3,2 g i 50 ml ultrarent vand, butik 500 pi alikvoter ved -20 ° C |
| Transferrin (50 mg / ml) | 500 mg i 10 ml ultrarent vand, butik 107 pi alikvoter ved -20 ° C |
| Natriumselenit (70 ug / ml) | 35 mg natriumselenit i 500 ml ultrarent vand, butik 100 pi alikvoter ved -20 ° C |
| FGF2 (200 ng / pl) | 1 mg i 5 ml kold D-PBS, butik 250 pi alikvoter ved -20 ° C |
| TGFB1 (100 ng / pl) | 100 pg i 1 ml kold 10 mM citronsyre, pH 3, lagre 10 aliquoter pi ved -20 ° C |
Tabel 1. Sammensætning af E8 Medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erhvervelse af en stor mængde højt oprensede hiPSC-afledte cardiomyocytter er kritisk for grundlæggende hjerte-forskning samt kliniske og translationelle applikationer. Hjertedifferentiering protokoller har undergået enorme forbedringer i de seneste år, der skiftes fra embryoide body-baserede fremgangsmåder, der anvender kardiogent vækstfaktorer 2, til matrix sandwich metoder 12, og endelig til små molekyle-moduleret og monolag-baserede metoder 5. Af de førnævnte protokoller, protokollen beskrevet her viste den højeste og den mest reproducerbare hjerte-differentiering effektivitet for forskellige hiPSC cellelinjer ved at modulere Wnt / β-catenin signalering ved hjælp af de små molekyler CHIR og IWR 5,7. Specifikt blev de udifferentierede hiPSCs induceret til at undergå mesodermal differentiering med GSK3-beta inhibitor CHIR og efterfølgende hjerte- differentiering med Wnt signalering inhibitor IWR1. Disse sekventielle trinWnt signalering modulation, hjulpet af insulin udtømning under hjertets afstamning induktionsfasen førte til højeffektive hjerte- differentiering. CHIR er en fælles lille molekyle GSK3-beta-inhibitor anvendes til mesodermal induktion, men andre små molekyler til GSK3-beta hæmning er blevet testet i cardiomyocyte differentiering protokoller 11. Flere muligheder er også anvendes til den efterfølgende lille molekyle Wnt inhibitor. For eksempel en nylig publikation fokus på kemisk definerede differentiering af pluripotente stamceller til cardiomyocytter bruger 2 um Wnt-C59 for effektiv Wnt hæmning og hjerte- mesoderm induktion 11.
Desuden differentierede cardiomyocytter med glucose sult metode blev yderligere oprenset, som drager fordel af den særskilte glucose metaboliske flow eksisterende mellem cardiomyocytter og ikke-cardiomyocytter 8. Det er vigtigt at bemærke, at effektiviteten af glucose sult metode er Density-afhængig (dvs. differentieringer, der gav højere procentdele af cardiomyocytes er mere tilbøjelige til at opnå større cardiomyocyte overlevelse). Men overgangen til lav glucose-medium er også en stressende betingelse for cardiomyocytter. Det er vigtigt at ændre cellerne tilbage til den almindelige RPMI / B27 med insulin medium efter 3 dages glucose sult. I denne protokol blev en feeder-fri vækstsystem udnyttet, hvor pluripotente stamceller ikke blev dyrket på feeder muse embryonale fibroblaster (MEF'er). Imidlertid har tidligere hjerte-differentiering protokoller udnyttet feeder-baserede systemer til at producere kardiomyocytter fra pluripotente stamceller 5. Ligeledes har tidligere protokoller også anvendes mTeSR1 medium for stamcelle vedligeholdelse, men E8 medier og fødefri systemet udnyttes her er overlegne på grund af sin enkelhed og mangel på overskydende xenogene komponenter såsom bovint serumalbumin og muse embryonale fibroblaster.
Currently,pluripotente stamcelle differentiering mod cardiomyocyte slægter er stort set robust, men stadig lider hiPSC line-til-line variation med hensyn til effektivitet. Dette er fortsat et stort problem i hjertets differentiering felt og vil kræve yderligere undersøgelse. Differentieringen effektivitet forbedres ved korrekt vedligeholdelse af hiPSC linjer, og især forebyggelse overconfluency løbet hiPSC vedligeholdelse. Yderligere variabilitet skyldes cellepodning under passage proces, som en jævnt podet monolag af hiPSCs tendens til at give anledning til de bedste samlede opdelinger. Her var en mus-afledte, Matrigel-baserede ECMS for celle såning under cellekultur med succes udnyttet, men en eventuel overgang til xeno-frie substrater anbefales. Med hensyn til cellepodning på ECMS, ujævn såning ofte resulterer i ujævn fordeling af cardiomyocytter inden for en bestemt brønd. For eksempel, hvis hiPSCs podes ujævnt, kan kanterne af en brønd i en seks-brønds plade giver anledning til HIGhendes antal cardiomyocytter end midten af brønden. Disse ujævne seeding betingelser kan give anledning til lave effektivitet opdelinger og et større antal ikke-cardiomyocyte, mesodermale derivater, såsom fibroblaster og glatte muskelceller. Vi har også observeret, at lav virkningsgrad opdelinger (under 50%) er meget vanskeligere at oprense ved hjælp af glucosemangel proces nævnt her. En anden bivirkning af langsigtet glucose sult er et potentielt tab i cardiomyocyte levedygtighed. Selvom cardiomyocytter er i stand til at metabolisere laktat i fravær af glucose, finder vi, at denne kontakt til en lav-glucose miljø er stressende for cellerne. Celler kan stoppe spontant bankende, og nogle celletab kan observeres, hvis glukose sult er forlænget ud over den anbefalede tid. Denne øgede følsomhed over for glukose afsavn kan være reflekterende af veletablerede udviklingsmæssige, funktionelle og elektrofysiologisk umodenhed stamcelle-afledt cardiomyocyTES i forhold til ægte voksen kardiomyocytter 13.
Sammenfattende protokollen beskrevet her kombinerer lille molekyle-baserede, hiPSC monolag hjertedifferentiering metode med en cardiomyocyte luftrensende glucose sult metode. Denne protokol muliggør reproducerbar generation af højt oprenset cardiomyocytter og bør fremme forskellige downstream analyser er relevante for hjertekarsygdomme modellering og narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
