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Developmental Biology

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) sind zu einem wichtigen Zellquelle, um den Mangel an primären Kardiomyozyten für die Grundlagenforschung und translationale Anwendungen anzugehen. Um hiPSCs in Kardiomyozyten zu differenzieren, wurden verschiedene Protokolle wie Embryoidkörper (EB) -basierte Differenzierung und Wachstumsfaktor Induktion entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle ineffizient und sehr variabel in ihrer Fähigkeit gereinigt Kardiomyozyten erzeugen. Kürzlich wurde ein kleines Molekül-basierte Protokoll Verwendung Modulation Wnt / β-Catenin-Signalisierung wurde dargestellt, um die Herzdifferenzierung mit hohem Wirkungsgrad zu fördern. Bei diesem Protokoll, größer als 50% -60% der differenzierten Zellen Troponin-positiven Kardiomyozyten wurden konsequent beobachtet. Um Kardiomyozyten Reinheit weiter zu erhöhen, wurden die differenzierten Zellen unterzogen, um Hunger Glukose gezielt beseitigen Nicht-Kardiomyozyten auf der Grundlage der Stoffwechselunterschieds zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten. Unter Verwendung dieses Selektionsstrategie, die wir durchgängig erhalten eine Erhöhung des Verhältnisses der Herzmuskelzellen nicht-Kardiomyozyten größer als 30% in einer Population differenzierter Zellen. Diese hochgereinigtes Kardiomyozyten sollte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse von In-vitro-Krankheit Modellstudien und Wirkstoff-Screeningtests menschlichen iPS-basierten verbessern.

Introduction

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Primäre humane Kardiomyozyten sind aufgrund der Erfordernis invasiver Herzbiopsien, Schwierigkeiten bei der Dissoziation einzelner Zellen und wegen der schlechten langfristige Überleben der Zellen in Kultur schwierig zu erhalten. Angesichts dieses Mangels an primären humanen Kardiomyozyten, patientenspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) Technologie als leistungsfähige Alternative Kardiomyozyten Quelle für die Grundlagenforschung als auch klinische und translationale Anwendungen wie Krankheit Modellierung und Droge angesehen Entdeckung ein. Frühe Bemühungen bei der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu Herzmuskelzellen verwendet Differenzierungsprotokollen mit Embryoidkörper (EB), aber dieses Verfahren ist nicht effizient bei der Herstellung von Herzmuskelzellen, da oft weniger als 25% der Zellen in einem EB schlagen Kardiomyozyten 2,3. Vergleichsweise, eine Monobasis Differenzierungsprotokoll unter Verwendung der Zytokine Aktivin A und BMP4 angezeigt einen höheren Wirkungsgrad als EBs, aberDieses Protokoll ist immer noch relativ ineffizient und erfordert eine teure Wachstumsfaktoren und funktioniert nur in einer begrenzten Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien 4. Vor kurzem wurde eine hocheffiziente, hiPSC Monolayer-basierte Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll durch Modulation Wnt / β-Catenin-Signalweg 5 entwickelt. Diese hiPSC-CMs auszudrücken Troponin T und Alpha Actinin, zwei sarkomerischen Proteine, die Standard-Marker von Herzmuskelzellen 6. Das Protokoll beschreibt hier ist eine Anpassung dieser niedermolekulare, Feeder zellfreie, Mono Differenzierung Verfahren 5,7. Wir sind in der Lage zu schlagen Kardiomyozyten aus hiPSCs nach 7-10 Tagen (Abbildung 1) zu erhalten. Jedoch nach einer Kardiomyozytendifferenzierung einer 50% schlagen Zellen, Immunfärbung zeigt einheitlich das Vorliegen einer Population von Nicht-Herzmuskelzellen, die negativ für Kardiomyozyten-spezifische Marker wie Herz-spezifisches Troponin T und alpha-Actinin sind. Um fueitere reinigen Kardiomyozyten und die Beseitigung nicht-Kardiomyozyten wurden heterogene differenzierten Zellpopulationen unterzogen, um Hunger, indem sie mit einem extrem niedrigen Glukosekulturmedium für mehrere Tage (Abbildung 2) Glukose. Diese Behandlung selektiv eliminiert nicht Kardiomyozyten aufgrund der Fähigkeit von Kardiomyozyten, aber nicht nicht-Kardiomyozyten, Lactat als Primärenergiequelle, um in einer niedrigen Glucoseumgebung 8 überleben metabolisieren. Nach diesem Reinigungsschritt wird eine 40% ige Zunahme im Verhältnis von Kardiomyozyten nicht Kardiomyozyten beobachtet (Figur 3, Figur 4) und der nachgeschalteten Genexpressionsanalyse, Krankheitsmodelle und Wirkstoff-Screening-Assays können diese Zellen verwendet werden.

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Protocol

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HINWEIS: Lieferanteninformationen für alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 aufgeführt und Materialliste. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen, müssen steril sein, und aseptisches Verfahren entsprechend verwendet werden. Führen alle Kultur Inkubationen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator, sofern nicht anders angegeben. In diesem Protokoll werden alle Unterscheidungen in 6-Well-Platten durchgeführt, bei dem die hiPSCs ausgesät. Nach Differenzierung und Reinigung können Zellen dissoziiert und zur späteren Verwendung erneut plattiert werden.

1. Mittelvorbereitung

  1. Für die E8 Medium, stellen eine Stammlösung für jedes Medium Komponente (NaHCO 3, L-Ascorbinsäure-2-phosphat, Natrium-Selenit, Transferrin, Insulin, FGF2, TGFB1) und die Lösungen bei -20 ° C lagern. Fügen Sie entsprechende Menge an Stammlösungen in die Flasche DMEM / F12 und filtern, um zu sterilisieren. Die Lösung Konzentration und Reaktionsansatz für die Aktienkomponenten und E8 Medium kann in Tabelle 1 zu finden.
  2. Für die extrazelluläre Matrix-Lösung, auftauen Basalmembranmatrix (allgemein bei 10 mg / ml enthalten) bei 4 ° CO / N. Matrigel ist allgemein für pluripotente Stammzellkultur verwendet werden, weil die menschliche pluripotente Stammzellen können auch auf dieses Material unter Verwendung des alpha-6-beta-1 Integrin 9 haften. Einmal aufgetaut, machen 2,25 mg (250 ul) Aliquots auf Eis mit eiskaltem Pipettenspitzen und Schläuche und die Aliquots bei -80 ° C.
    1. Wenn Vorbeschichtung Platten mit ECMS, auftauen und aliquotieren die extrazelluläre Matrix-Lösung (ECMS) auf Eis. Mischen Sie das ECMS und eiskalten DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200 auf Eis. Keep cool, um vorzeitige ECMS Erstarrung zu verhindern.
  3. Für die RPMI / B27 ohne Insulin Medium, 10 ml B27 Minus Insulin in 500 ml RPMI-Medium.
  4. Für die RPMI / B27 (mit Insulin) Medium, 10 ml B27 Supplement (mit insulin) und 5 ml Pen-Strep-Antibiotikum in 500 ml RPMI-Medium.
  5. Für den niedrigen Glucose-Medium, 10 ml B27 Supplement und 5 ml Pen-Strep Antibiotikum in 500 ml Glukose-freiem RPMI-Medien.
  6. Das Einfrieren / Kryokonservierungsmedium mischen fötalem Rinderserum mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Verhältnis 9: 1. Das Einfriermedium kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
    Hinweis: alle Medien sollten gefiltert und gespeichert werden in 4 ° C und innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, wenn nicht anders angegeben. Alle Reagenz / Lösungsvolumina unter Verwendung eines einzigen gut in einer 6-Well-Platte bestimmt, sofern nicht anders angegeben.

2. Pre-Beschichtung 6-Well-Platten mit ECMS

  1. Make ECMS durch Mischen Basalmembranmatrix (zB Matrigel) mit eiskaltem DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200, dann gelten 2 ml frisch hergestellter ECMS in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Jedes der gut in einer 6-Well-Platte wird ca. 90 mg ECMS erhalten.
  2. Inkubieren Sie die ECMS-beschichteten Platten für 1 h bei 37 ° C. Unmittelbar vor dem Beschichten Zellen, absaugen DMEM / F12-Lösung aus jeder Vertiefung. Die Platten werden dann bereit sind, Zellen zu empfangen.

3. Auftauen der Tiefkühl hiPSCs

HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten hiPSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus führen.

  1. Tauwetter ein Fläschchen hiPSCs für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml kaltem E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 & mgr; M) für jedes Fläschchen. ROCK-Hemmer verbessert hiPSCs Überlebensrate nach Kryokonservierung 10. Die Durchstechflaschen im 37 ° C Wasserbad, um die Zellen, bis eine ca. 5 mm Durchmesser Eis Kristall überlassen auftauen.
  2. Besprühen Sie die Außenseite der Fläschchen mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Fläschchen mit Seidenpapier, bevor er sie an den sterilen laminaren Haube.
  3. Übertragen Sie die Zellen, in die vorbereitete konischen Rohr. Spülen ter einmal mit 500 ul E8 Medium Fläschchen und übertragen Sie das Medium, das die aufgetauten Zellen auf den gleichen konischen Rohr. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g.
  4. Saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und sanft Zellpellet mit 2 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor (10 uM). Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ECMS vorbeschichtet.
  5. Ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer nach 24 Stunden der Kultivierung. Die Zellen sollten bis zu diesem Zeitpunkt eingehalten haben.

4. Passagieren von hiPSCs

  1. Typischerweise Gang hiPSCs nach Erreichen 75% bis 80% Konfluenz in einer 6-Well-Platte. Saugen Sie das Kulturmedium. Waschen schnell Vertiefungen mit 1 ml sterilem, RT PBS. Absaugen PBS.
    1. Fügen Sie 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung (zB Accutase) und Inkubation für 1-7 min bei RT. Gegebener Zeit für EDTA Inkubation variiert mit der hiPSC Linie. Erwarten Sie, um zu sehen Curling o sehenr Verdickung Kolonien an den Rändern, da dieses anzeigt, daß EDTA oder Zellentfernungslösung bereit, entfernt werden.
  2. Saugen Sie das EDTA oder die Zellablösung Lösung. 1 ml der E8-Medium mit 10 & mgr; ROCK-Hemmer ergänzt. Verdrängen hiPSC Kolonien in der auch durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollte in 5-10 Zellklumpen nach Abschluss gebrochen werden.
  3. Übertragen Sie die Kolonien, die in 1 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor in einen 15 ml konischen Röhrchen suspendiert sind.
  4. Stören die große Zellklumpen in kleine Klumpen in der E8 Medium. Fügen Sie einen entsprechenden Volumen von E8 Medien mit Inhibitor der Zellsuspension, um die Zellen zu verdünnen. Das Medienvolumen, um die Verdünnung hinzuzufügen, hängt von der Zelldichte und die Zahl der Brunnen ausgesät werden. Im Idealfall sollte eine einzige, 80% konfluent auch von hiPSCs 01.12 verdünnt werden.
    1. Fügen Sie 11 ml Medium mit E8 ROCK-Hemmer zu den bestehenden 1 ml cell-Lösung in den oben erwähnten 15 ml konischen Röhrchen, um eine Verdünnung zu erhalten 01.12.
  5. Weitere verreiben die Zellklumpen in kleine Zellfragmente (etwa 50 bis 200 Zellen in jedem Fragment am besten). Vermeiden Sie zu Verreiben da dadurch das Überleben der Zelle.
  6. Saugen Sie ECMS von den Pre-beschichteten Platten und 2 ml resuspendierten Zellen in jede Vertiefung. Etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ist ideal. Ziel ist es, die Zellen gleichmäßig um den gut verzichten zu Clusterbildung von Zellen, die in der Mitte der Vertiefung zu vermeiden.
  7. Nach 24 Stunden der Kultivierung, ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer. Ändern Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden, bis die Zellen zu 80% konfluent. Dann werden die Zellen wieder bereit, Durchgang. Es dauert normalerweise 3-6 Tage zwischen den Kanälen zu 80% konfluent.

5. Einfrieren hiPSCs

HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten Hüfte führenSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus.

  1. Beschriften Sie Kryoröhrchen mit der Zelllinie Name, Zelltyp, Durchgang Nummer und Einfrieren Tag. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie eine Flasche für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 & mgr; M) befüllt. Bereiten Gefriermedium mit 90% FBS und 10% DMSO, und halten Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  2. Saugen Sie das Kulturmedien, 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung und Inkubation für 2-7 min bei RT. Die Dauer der EDTA oder Zellentfernungslösung Belichtung variiert von Zelllinie zu Zelllinie.
  3. Saugen Sie EDTA oder Zellablösung Lösung. 1 ml der E8 Medium.
  4. Verdrängen hiPSC Kolonien in der gut durch Auf-und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollten nicht in weniger als 100 Zellklumpen zerlegt werden. Übertragen Sie die suspendierten Zellen auf die vorbereitete konische Röhrchen mit E8. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g.
  5. Saugen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul kaltem Einfriermedium zu dem Pellet. Das Pellet pipettiert ein- bis zweimal. Das Überleben der Zellen ist, indem sie Zellen in großen Klumpen verbessert.
  6. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein beschriftetes kryogenen Rohr. Bewegen sich schnell die Fläschchen in einen Gefrierbehälter, Isopropanol, die allmähliche Abkühlung ermöglicht. Das Behältnis mit Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, dann übertragen die Zellen in flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung.

6. Herz Differenzierung von humanen iPS

HINWEIS: Alle Medien sollten mindestens bei Raumtemperatur, wenn hinzugefügt.

  1. Nach Dissoziation mit EDTA oder 1x Zellablösung Lösung, Samen rund 100.000 menschlichen iPS-Zellen auf ECMS beschichtete 6-Well-Kulturplatten zur Differenzierung (dieselben Schritte wie Zell Passagieren Verfahren). Wenn die Zellen bis 85% Konfluenz, ändern Sie die mittel- bis RPMI / B27 ohne Insulin-Medium mit 6uM GSK3-beta-Hemmer CHIR99021 (CHIR) und halten für 48 Stunden.
  2. Nach 48 Stunden, ersetzen Sie den CHIR haltigen Kulturmedium mit RPMI / B27 ohne Insulin Medium und in Ruhe zu lassen für 24 Stunden (bis zum Tag 3).
  3. Am Tag 3, ändern Sie die Medien, um RPMI / B27 ohne Insulin mit 5 uM Wnt-Inhibitor IWR1 und halten für 48 Stunden (bis zum Tag 5).
    HINWEIS: Wnt Hemmung kann auch unter Verwendung anderer Verbindungen mit kleinen Molekülen versucht werden, wie in früheren Studien 11 beschrieben. IWR1 wurde über andere kleine Molekül Wnt Inhibitoren wegen der erhöhten Bereich, in dem es sich gezeigt hat, bei der Hemmung der Wnt signal 11 werden ausgewählt.
  4. Am Tag 5, ändern Sie das Medium wieder in RPMI / B27 ohne Insulin Medium und lassen für 48 Stunden (bis zum Tag 7).
  5. Am Tag 7, ersetzen Sie das Medium mit RPMI / B27 Medium (mit Insulin) und ersetzen Medium alle 3 Tage danach mit dem gleichen Medium. Spontane Schlagen Kardiomyozyten zunächst sichtbar bei ca. 8. Tag zu Tag10.

7. Reinigung von humanen Kardiomyozyten durch Glucose Starvation

  1. Am Tag 10 nach der Differenzierung, ändern Sie das Medium in jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen bis 2 ml niedrigen Glucose-Medium und Aufrechterhaltung der Zellen in diesem Medium für 3 Tage (bis zum Tag 13).
  2. Am Tag 13, zurück Zellen RPMI / B27 Medium (mit Insulin).
  3. Optional Ausstrich Kardiomyozyten vor der zweiten Runde der Glukose Hunger zu helfen, lösen nicht-Kardiomyozyten von der Kulturplatte, die ein einfacheres, Dissoziation von nicht-Kardiomyozyten während Glukose Hunger.
    1. Am Tag 13, absaugen Medium einmal mit PBS waschen und distanzieren die Zellen in einzelne Zellen unter Verwendung von 500 ul Zell Disassoziierung Enzyms für 5 min bei 37 ° C. Insbesondere wird nach 5 min der Enzymbehandlung, mit einem 1000 ul-Pipette Kardiomyozyten aus der 6-Well-Platte manuell dissoziieren durch wiederholtes Ziehen des Zell Disassoziierung Enzym und Sprühen gegen die cardiomyocyte Monolage. Bis zu 30 Pipettieren Wiederholungen erforderlich sein, um die Herzmuskelzellen in einzelne Zellen distanzieren werden.
    2. Nachdem die Zellen dissoziiert und in Einzelzellform, sammeln sämtliche Zellen in einer 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin gefüllt, um für 4 min bei 200 x g verdünnt das Zell Disassoziierung Enzym und zentrifugiert. Absaugen und den Überstand verwerfen.
    3. Resuspendieren der Zellen mit 2 ml RPMI / B27 Medium und der Platte auf einen neuen ECMS beschichteten 6-Well-Platte. Typischerweise höherer Konfluenz von Kardiomyozyten hilft bei der Zellüberleben bei Neubelegung. Ziel ist es, zwei Millionen Zellen pro neue 6-Well-Platte für optimale Überleben während Neubelegung Ausstrich.
  4. Am Tag 14, ändern Sie das Medium wieder in 2 ml niedrigen Glucose-Medium für eine zweite Glukoseentzug-Zyklus. Kultur die Zellen in diesem niedrigen Glukose Zustand für 3 Tage. Die meisten der nicht-Kardiomyozyten in diesem niedrigem Glucosekulturbedingungen sterben.
  5. Am Tag 17, ändern Sie das Medium bis 2 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin. Die verbleibenden Zellen werden hoch gereinigte Kardiomyozyten sein. Diese Kardiomyozyten zur Genexpressionsanalyse, Arzneimittel-Screening, metabolische Analyse und verschiedene andere Downstream-Assays verwendet werden.

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Representative Results

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Die morphologischen Veränderungen während hiPSC Differenzierung.

Die hiPSC in Feeder-freien Platten kultiviert wuchs als flache, zweidimensionale Kolonien. Bei Erreichen etwa 85% Konfluenz wurden hiPSCs mit 6 uM CHIR zur ​​Differenzierung (1A) behandelt. Erhebliche Mengen von Zelltod, eine normale und weit verbreitetes Phänomen, wurden nach 24 Stunden von CHIR Behandlung beobachtet. Nach zwei Tagen CHIR Behandlung die hiPSCs weiter in Richtung eines mesodermal Schicksal unterscheiden. Im Vergleich zu Zellen in hiPSC Kolonien Zellengröße für diesen Tag 2-Zellen erhöht. Zellzahl auch durch Zellteilung (1B) erhöht. Am Tag 5 wurden die Mesodermzellen Richtung kardialen Zelllinie (cardiac Mesoderm) gerichtet ist. Zu diesem Zeitpunkt Zellen beginnen Koaleszenz und bilden charakteristische, Filiale artigen Strukturen (Abbildung 1C). Am Tag 10 wurden die Zweigartige Strukturen stark ausgeprägte und Kardiomyozyten Sterneted spontan schlag (1D). Terminal differenzierten Kardiomyozyten wird nicht über diesen Punkt hinaus zu vermehren. Eine Zeitachse der Differenzierung Protokoll ist in Abbildung 2 dargestellt.

Immunfärbung und Durchflusszytometrie Ergebnisse zeigten Kardiomyozyten wurden mit Glucose Verhungern gereinigt.

Nach 10 Tagen der Differenzierung, der mehr als 50% der Zellbereiche zu schlagen. Allerdings schlagen Zellschichten manchmal werden auch mit nicht-Kardiomyozyten vermischt. Um Kardiomyozyten Reinheit zu prüfen, Zellen mit Immunfärbung gegen Kardiomyozyten Marker Herztroponin-T (cTnT) wurden charakterisiert, um zu finden, dass die meisten Zellen waren cTnT positiv. Jedoch in ungereinigter Population differenzierter Zellen, eine Anzahl von Zellen fehlte auch Expression cTnT, was auf das Vorhandensein von nicht-Kardiomyozyten in dieser differenzierten Population an Tag 13 (3A). Jedoch mit Glucose Verhungernfast alle restlichen Zellen wurden cTnT positiv an Tag 13 (3B), was auf eine erfolgreiche Reinigung der Kardiomyozyten folgenden Glukose Hunger. Diese Daten wurden weiter unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. Eine Population von differenzierten Zellen an Tag 13 nach der Differenzierung enthalten ca. 50% TNNT2 + Zellen, wenn sie nicht verhungert Glukose (4A). Eine parallele Differenzierung wurde ebenfalls durchgeführt, aber mit einem 3 Tage Glukoseentzug beginnend an Tag 10 nach der Differenzierung. Im Gegensatz zu der unstarved Differenzierung führte Glucoseentzug auf eine gereinigte Population, die 90% TNNT2 + Zellen am Tag 13 (4B).

Figur 1
Abbildung 1. Die sequentielle morphologischen Veränderungen während hiPSC Differenzierung in Richtung der Herzlinie. (A) Undifferenzierte hiPSCsam Tag 0 weisen typische Koloniemorphologie und etwa 85% Konfluenz erreicht. (B) Am Tag 2-Zellen nach Behandlung mit CHIR zwei Tagen erreichte 100% Konfluenz und trat in den mesodermalen Linie. (C) am Tag 5 wurden die Zellen nach der Behandlung mit IWR1 für 2 Tage in die Herz Mesoderm Stufe. Einige Zellen begann zu schmelzen und bilden Kennlinienast artige Morphologien (durch Pfeile angedeutet). (D) An Tag 7-10 sind zweigartigen Strukturen sehr offensichtlich und Kardiomyozyten beginnen spontan schlag. Bar = 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Zeitleiste hiPSC-CM Differenzierungsprotokoll und nachfolgende Glukose Hunger Prozess. Beating Kardiomyozyten ein Wieder typischerweise zuerst bei ca. 7-10 Tage beobachtet. Zwei Runden von Glukose Hunger wird in gereinigter Population von Kardiomyozyten für Tag 17 zur Folge haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Immunfluoreszenz zeigt die Reinigung von Kardiomyozyten folgenden Glukose Hunger. (A) ungereinigtem Zellen nach 13 Tagen der Differenzierung wurden mit Cardiac Troponin T (cTnT) gefärbt. Die meisten Zellen zu Kardiomyozyten differenziert und wurden cTnT positive, sondern eine Reihe von Nicht-Herz, cTnT-negative Zellen sind ebenfalls vorhanden. (B) Im Gegensatz dazu nach einer 3-tägigen Glucose Verhungern beginnend am Tag 10, die fast alle die überlebenden Zellen waren cTnT positive Tag 13. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Durchfluss-Zytometrie zeigt die Reinigung von Kardiomyozyten folgenden Glukose Hunger. (A) Nach 13 Tagen der kardialen Differenzierung ohne Glucose Hunger, eine Population von Zellen zeigten etwa 50% TNNT2 + Kardiomyozyten. Rot zeigt die differenzierten Zellpopulation und Blau undifferenzierten hiPSCs als Negativkontrolle. (B) Nach 10 Tagen der kardialen Differenzierung und gefolgt von 3 Tagen nach der Glukose Hunger, wurde eine Population von Zellen aus der gleichen Charge von Differenzierungen gereinigt, um 90% TNNT2 + Kardiomyozyten enthalten. Bitte klicken Sie hier, umsehen eine größere Version dieser Figur.

Die Zusammensetzungen zur E8 Medium
E8 Volumen: 1 L Unternehmen Katalog-Nummer
DMEM / F12 mit Glutamin und HEPES 1.000 ml Invitrogen 11330-032
NaHCO 3 (7,5%, 75 mg / ml) 7,24 ml Invitrogen 25080-094
L-Ascorbinsäure-2-phosphat (64 mg / ml) 1 ml Sigma A8960
Natriumselenit (70 ug / ml) 200 & mgr; Sigma S5261
Transferrin (50 mg / ml) 214 & mgr; Sigma T3705
Insulin (4 mg / ml) 5 ml Invitrogen 12585-014
FGF2 (200 ng / ul) 500 & mgr; Peprotech 100-18B
TGFB1 (100 ng / ul) 20 & mgr; Peprotech 100-21
Die Stammlösungen für E8 Kompositionen
L-Ascorbinsäure-2-phosphat (64 mg / ml) 3,2 g in 50 ml Reinstwasser, speichern 500 ul Aliquots bei -20 ° C
Transferrin (50 mg / ml) 500 mg in 10 ml Reinstwasser, speichern 107 ul Aliquots bei -20 ° C
Natriumselenit (70 ug / ml) 35 mg Natriumselenit in 500 ml Reinstwasser, speichern 100 ul Aliquots bei -20 ° C
FGF2 (200 ng / ul) 1 mg in 5 ml kaltem D-PBS, speichern 250 ul Aliquots bei -20 ° C
TGFB1 (100 ng / ul) 100 & mgr; g in 1 ml kaltem 10 mM Citronensäure, pH 3, Speicher 10 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C

Tabelle 1. Zusammensetzung der E8 Medium.

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Discussion

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Erhalten einer großen Menge von hochgereinigtem hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten ist kritisch für die Grundherzforschung sowie klinische und translationale Anwendungen. Cardiac Differenzierungsprotokolle haben enorme Verbesserungen in den letzten Jahren, um Kleinmoleküle moduliert und Monolayer-basierte Methoden 5 unterzogen, den Übergang von Embryoidkörper-basierte Verfahren, die einen kardiogenen Wachstumsfaktoren 2, um Sandwichverfahren 12 Matrix und schließlich. Der vorstehend genannten Protokolle, die hier beschriebene Protokoll zeigte die höchste und reproduzierbare kardiale Differenzierung Effizienz für verschiedene hiPSC Zellinien durch Modulieren Wnt / β-Catenin-Signalisierung mit den kleinen Molekülen CHIR und IWR 5,7. Insbesondere wurden die undifferenzierte hiPSCs bewogen, mesodermalen Differenzierung mit der GSK3-beta-Hemmer CHIR und nachfolgenden Herzdifferenzierung mit dem Wnt-Signalweg-Inhibitor IWR1 zu unterziehen. Diese aufeinanderfolgenden Schritte desWnt-Signalmodulation durch Insulin Erschöpfung während des Herzlinie Induktionsphase unterstützt, führte zu hocheffiziente kardialen Differenzierung. CHIR ist eine gemeinsame kleine Molekül GSK3-beta-Hemmstoff für die mesodermalen Induktion verwendet, aber andere kleine Moleküle für GSK3-beta-Hemmung in Kardiomyozytendifferenzierung Protokolle 11 getestet. Mehrere Optionen werden auch für die anschließende Kleinmolekül Wnt-Hemmer. Zum Beispiel wird eine neuere Veröffentlichung mit Schwerpunkt auf chemisch definierten Differenzierung pluripotenter Stammzellen Kardiomyozyten verwendet 2 uM Wnt-C59 für eine effektive Hemmung der Wnt und Herz Mesoderm Induktions 11.

Darüber hinaus wurden die differenzierten Kardiomyozyten mit Glucose Verhungern Verfahren weiter gereinigt werden, was den Vorteil dieser unterschiedlichen Glukosemetabolismus statt fließen, die zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten 8. Es ist wichtig zu beachten, dass die Effizienz der Glukose Verhungern Verfahren ist dichte abhängig (dh Unterscheidungen, die höhere Anteile von Kardiomyozyten ergab eher größer cardiomyocyte Überleben zu erreichen). Jedoch ist der Übergang auf den niedrigen Glucosemedium auch ein Stresszustand der Kardiomyozyten. Es ist wichtig, die Zellen nach 3 Tagen von Glucose Verhungern zurück zu den regelmäßigen RPMI / B27 Insulin Medium ändern. In diesem Protokoll wurde eine Feeder-freien Wachstumssystem verwendet, bei dem pluripotenten Stammzellen nicht auf Feeder embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) gezüchtet. Allerdings haben vor Herzdifferenzierungsprotokolle Feeder-basierten Systemen verwendet werden, um Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen 5 zu produzieren. Ebenso haben bekannte Protokolle verwendet mTeSR1 Medium zur Erhaltung von Stammzellen, aber der hier verwendete E8 Medien und Feeder-freien System überlegen ist aufgrund seiner Einfachheit und der Mangel an überschüssigem xenogenen Komponenten, wie Rinderserumalbumin und embryonalen Mausfibroblasten.

Derzeitpluripotenten Stammzelldifferenzierung zu Kardiomyozyten Linien weitgehend robust, aber immer noch leidet hiPSC Line-to-Line-Variabilität in Bezug auf Effizienz. Dies ist und bleibt ein wichtiges Thema in der Herzdifferenzierung Feld und werden weitere Untersuchungen erforderlich. Die Differenzierung Effizienz wird durch die ordnungsgemäße Wartung der hiPSC Linien verbessert und insbesondere verhindert overconfluency während hiPSC Wartung. Zusätzliche Variabilität entsteht durch Zellaussaat während der Passage Prozess, wie eine gleichmäßig ausgesät Monolage hiPSCs neigt dazu, die zu den besten Gesamt Differenzierungen geben. Hier wurde ein Maus stamm, Matrigel-basierte ECMS für Zellaussaat während der Zellkultur erfolgreich eingesetzt, aber eine eventuelle Umstellung auf Xeno freien Untergründen empfohlen. In Bezug auf die Zellaussaat auf ECMS, unebene Aussaat führt oft zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Herzmuskelzellen in einem bestimmten gut. Zum Beispiel, wenn hiPSCs ungleichmäßig ausgesät, die Kanten einer Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte kann zu geben higihre Anzahl von Herzmuskelzellen als die Mitte der Vertiefung. Diese ungleichmäßigen Säbedingungen kann zu geringen Wirkungsgrad Differenzierungen und eine größere Anzahl von nicht-Kardiomyozyten, mesodermalen Derivate wie Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu ergeben. Wir haben auch beobachtet, dass geringe Effizienz Differenzierungen (unter 50%) sind viel schwieriger zu reinigen unter Verwendung der hier genannten Glukoseentzug Prozess. Ein weiterer Nebeneffekt der Langzeitzucker Hunger ist ein potenzieller Verlust in Kardiomyozyten Lebensfähigkeit. Obwohl die Kardiomyozyten können Lactat in Abwesenheit von Glucose metabolisieren, finden wir, daß dieser Schalter auf einen niedrigen Glucose Umwelt belastend für die Zellen. Die Zellen können sich selbst aufhören zu schlagen, und einige Zellverlust kann beobachtet werden, wenn Glukose Hunger wird über die empfohlene Zeit verlängert werden. Diese verbesserte Empfindlichkeit gegenüber Glucose-Entzug kann repräsentativ für die etablierten Entwicklungs, funktional und elektrophysiologische Unreife Stammzellen gewonnenen cardiomyocy seintes im Vergleich zum wahren adulten Kardiomyozyten 13.

Zusammenfassend ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die niedermolekulare, hiPSC Mono kardialen Differenzierungsmethode mit einem Kardiomyozyten reinig Glucose Verhungern Methode. Dieses Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Erzeugung von hochreinem Kardiomyozyten und sollte verschiedene nachgelagerten relevanten kardiovaskulären Erkrankungen Modellierung und Wirkstoff-Screeningtests zu erleichtern.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

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Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation
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Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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