Abstract
cardiomyocytes מקורן בתאי גזע pluripotent אדם מושרה (hiPSC-CMS) הפך מקור תא חשוב להתייחס לחוסר cardiomyocytes העיקרי זמין עבור יישומי מחקר וtranslational בסיסיים. להבדיל hiPSCs לשריר לב, פרוטוקולים שונים, כוללים גוף embryoid (EB) בידול מבוסס ואינדוקצית גורם הגדילה פותחו. עם זאת, פרוטוקולים אלה אינם יעילים ומשתנים מאוד ביכולתם ליצור cardiomyocytes המטוהר. לאחרונה, אפנון פרוטוקול ניצול קטן על בסיס מולקולות איתות Wnt / β-קטנין הוצג לקידום בידול לב עם יעילות גבוהה. עם פרוטוקול זה, יותר מ -50% -60% מתאים מובחנים היו cardiomyocytes טרופונין חיובי לב נצפו באופן עקבי. כדי להגדיל את טוהר cardiomyocyte נוסף, התאים המובחנים היו נתונים לגלוקוז רעב לחסל במיוחד שאינו cardiomyocytes המבוסס על ההבדל מטבוליםים בין cardiomyocytes ולא cardiomyocytes. באמצעות אסטרטגית בחירה זו אנו באופן עקבי השגנו עלייה גדולה יותר מ -30% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes באוכלוסייה של תאים מובחנים. cardiomyocytes הנקי במיוחד אלה צריכים לשפר את האמינות של תוצאות מאדם מבוסס iPSC בלימודי דוגמנות המחלה מבחנה ומבחני הקרנת סמים.
Introduction
cardiomyocytes אדם מן המעלה הראשון הם קשה להשגה בגלל הדרישה לביופסיות לב פולשנית, קושי במתנער לתאים בודדים, ובגלל הישרדות תא לטווח ארוך עניה בתרבות. בהתחשב בזה חוסר cardiomyocytes האנושי הראשוני, cardiomyocyte מקורן בתאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מטופל ספציפי טכנולוגיה (hiPSC-CM) כבר נחשבה כמקור עוצמה חלופי cardiomyocyte למחקר בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational כגון דוגמנות מחלה ותרופה תגלית 1. מאמצים מוקדמים בתאי גזע pluripotent לcardiomyocytes מועסקים פרוטוקולי בידול באמצעות גופי embryoid (EBS), אך שיטה זו אינה יעילה בשריר לב בהפקת כי לעתים קרובות פחות מ -25% מתאים בEB מכים cardiomyocytes 2,3. יחסית, פרוטוקול בידול המבוסס על monolayer באמצעות ציטוקינים Activin וBMP4 מוצג יעילות גבוהה יותר מאשר EBS, אבלפרוטוקול זה הוא עדיין יחסית לא יעיל, דורש גורמים יקרים צמיחה, ופועל רק במספר מצומצם של שורות תאי גזע האנושי pluripotent 4. לאחרונה, פרוטוקול יעיל ביותר, המבוסס על monolayer hiPSC בידול cardiomyocyte פותח על ידי ויסות Wnt / β-קטנין איתות 5. אלה hiPSC-CMS להביע T לב טרופונין וactinin אלפא, שני חלבונים sarcomeric שהם סמנים סטנדרטיים של cardiomyocytes 6. הפרוטוקול מתאר כאן הוא עיבוד של,, 5,7 זה קטן על בסיס מולקולות תא מזין ללא הבחנה monolayer שיטה. אנו מסוגלים להשיג להכות cardiomyocytes מhiPSCs לאחר 7-10 ימים (איור 1). עם זאת, בעקבות בידול cardiomyocyte וכתוצאה מכך 50% הכו את התאים, immunostaining באופן עקבי מראה את קיומה של אוכלוסייה הלא-cardiomyocytes כי הם שליליים לסמני cardiomyocyte הספציפי כגון T טרופונין הלבבי ספציפי ואלפא-actinin. לפוrther לטהר cardiomyocytes ולחסל הלא cardiomyocytes, אוכלוסיות תאים מובחנות הטרוגנית היו נתונים לגלוקוז רעב תוך התייחסות אליהם עם מדיום תרבות גלוקוז נמוך מאוד במשך ימים רבים (איור 2). טיפול זה באופן סלקטיבי מבטל הלא cardiomyocytes בשל היכולת של שריר לב, אך לא בלתי-cardiomyocytes, לחילוף חומרים לקטט כמקור האנרגיה העיקרי על מנת לשרוד בסביבת גלוקוז נמוכה 8. לאחר שלב טיהור זה, עלייה של 40% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes הוא ציין, (איור 3, איור 4) ותאים אלה יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם ביטוי גנים, דוגמנות מחלה, ומבחני הקרנת סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מידע ספק לכל חומרים כימיים המשמשים בפרוטוקול זה כבר מופיע בטבלה 1 ו רשימת חומרים. כל הפתרונות והציוד הבאים במגע עם תאים חייבים להיות סטרילי, ויש להשתמש בי טכניקת ספטית בהתאם. לבצע את כל incubations התרבות בC ° 37 humidified, 5% CO 2 באינקובטור, אלא אם כן צוין אחרת. בפרוטוקול זה, כל הבידול מבוצע ב6-גם צלחות, שבי hiPSCs הם זורעים. בעקבות בידול וטיהור, יכולים להיות מנותקים תאים וreplated לשימוש במורד הזרם.
1. הכנה בינונית
- לבינוני E8, להפוך את פתרון מניות עבור כל רכיב בינוני (NaHCO 3, חומצה אסקורבית L-2-פוספט, סלניט נתרן, transferrin, אינסולין, FGF2, TGFB1) ולאחסן את הפתרונות ב -20 ° C. הוספת הכמות מתאימה של פתרונות מניות לבקבוק DMEM / F12 ולסנן לעקר. Concentr הפתרוןניתן למצוא ation והתקנת תגובה לרכיבי המניות והבינוניים E8 בטבלה 1.
- לפתרון החוץ-התאי, להפשיר את מטריצת קרום במרתף (מסופקת בדרך כלל על 10 מ"ג / מיליליטר) בשעה 4 ° CO / N. Matrigel משמש בדרך כלל לתרבות תאי גזע pluripotent כי תאי גזע pluripotent אדם יכולים לדבוק גם לחומר זה באמצעות integrin אלפא-6-beta-1 9. ברגע שהפשיר, לעשות aliquots 2.25 מ"ג (250 μl) על קרח באמצעות טיפים pipet הקר כקרח וצינורות ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס.
- כאשר precoating צלחות עם ECMS, להפשיר וaliquot הפתרון תאי המטריצה (ECMS) על קרח. מערבבים את ECMS ובינוני DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200 על קרח. לשמור על קור רוח כדי למנוע התמצקות ECMS מוקדמת.
- לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין, להוסיף 10 מיליליטר של B27 מינוס אינסולין לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI.
- לRPMI / B27 (עם אינסולין) בינוני, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 (עם insulin) ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI.
- למדיום גלוקוז הנמוך, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI נטול גלוקוז.
- לבינוני / הקפאת ההקפאה, לערבב בסרום שור עוברי יחד עם dimethylsulfoxide (DMSO) בשעה 9: 1. מדיום ההקפאה ניתן לאחסן עד חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: יש לסנן כל כלי התקשורת ומאוחסן ב 4 ° C ושימוש בתוך 2 שבועות, אלא אם כן צוין אחרת. כל הכרכים מגיב / פתרון משמשים להלן מיועדים לבודד היטב בצלחת 6-היטב, אלא אם צוינו אחרת.
2. טרום ציפוי צלחות 6-גם עם ECMS
- הפוך ECMS ידי ערבוב מטריצת מרתף קרום (למשל, Matrigel) עם תקשורת DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200, ולאחר מכן להחיל 2 מיליליטר של ECMS הטרי היטב כל אחד לצלחת 6-היטב. כל טוב בצלחת 6-גם יקבל כ 90 מ"ג ECMS.
- דגירה ECMS מצופה צלחות עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. מייד לפני תאי ציפוי, לשאוב DMEM פתרון F12 / מכל טוב. אז הצלחות תהיה מוכנות לקבל תאים.
3. ההפשרה hiPSCs קפוא
הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של hiPSCs לhiPSC-CMS הבא מחזור ההקפאה / הפשרה.
- להפשיר בקבוקון אחד של hiPSCs לכל טוב של 6-גם צלחת. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 9 מיליליטר של מדיום E8 קר עם מעכבי ROCK (10 מיקרומטר) לכל בקבוקון. מעכב ROCK משפר הישרדות hiPSCs הבאה הקפאה 10. שמור את הצלוחיות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להפשיר את התאים עד קרח קוטר גביש כ 5 מ"מ שנשאר.
- תרסיס החיצוני של צלוחיות עם 70% אתנול. נגב את הצלוחיות עם נייר טישו לפני שעברת אותם למכסה המנוע למינרית סטרילי.
- להעביר את התאים לתוך צינור חרוטי מוכן. יש לשטוף tהוא בקבוקון פעם אחת עם 500 μl של מדיום E8 ולהעביר את המדיום המכיל את התאים המופשרים לאותו צינור חרוטי. צנטריפוגה ב RT למשך 4 דקות ב 200 x גרם.
- לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה ועדינות resuspend התא גלולה עם 2 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). להעביר את תאי resuspended לאחד היטב צלחת 6-היטב מראש מצופה עם ECMS.
- החלף את המדיום עם מדיום E8 ללא מעכבי ROCK לאחר 24 שעות של culturing. תאים צריכים דבקו בזמן הזה.
4. Passaging של hiPSCs
- בדרך כלל, hiPSCs מעבר לאחר שהגיע 75% confluency -80% בצלחת 6-היטב. לשאוב את מדיום התרבות. מהירות לשטוף בארות עם 1 מיליליטר של סטרילית, RT PBS. לשאוב PBS.
- הוסף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x (לדוגמא, Accutase) ודגירה של 1-7 דקות ב RT. הזמן מתאים לדגירת EDTA משתנה עם קו hiPSC. מצפה לראות o מסתלסל גלויהעיבוי r של מושבות בקצוות, כמו זה מצביע על כך שפתרון EDTA או ניתוק תא מוכן להסרה.
- לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומטר. לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות צריכה להיות מחולקות 5-10 גושי תא אחרי ההשלמה.
- העבר את המושבות שמושעות ב 1 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר.
- לשבש את גושי תאים הגדולים לגושים קטנים במדיום E8. הוספת נפח מתאים של תקשורת E8 עם מעכב להשעית התא לדלל את התאים. נפח התקשורת להוסיף לדילול תלוי בצפיפות התאים ומספר הבארות שנזרע. באופן אידיאלי, 80% גם של hiPSCs אחת, ומחוברות צריכים להיות מדולל 01:12.
- להוסיף 11 מיליליטר בינוני E8 עם מעכב ROCK ל1 מיליליטר הקיים של ceפתרון ll בצינור חרוטי 15 מ"ל כאמור לקבלת דילול 01:12.
- נוסף triturate גושי תאים לרסיסי תא קטנים (סביב 50-200 תאים בכל בר הוא הטובים ביותר). הימנע על-triturating כמו זה מפחית הישרדות תא.
- לשאוב ECMS מהצלחות מצופים מראש ולהוסיף 2 מיליליטר של תאי resuspended לתוך כל טוב. כ -100,000 תאים לכל גם צלחת 6-גם הוא אידיאליים. שואף לוותר התאים באופן שווה סביב היטב כדי למנוע הצטברות של תאים במרכז הבאר.
- לאחר 24 שעות של culturing, להחליף בינוני עם בינוני E8 ללא מעכבי ROCK. לשנות את מדיום התרבות כל שעה 24 עד התאים להיות מחוברות 80%. לאחר מכן, התאים מוכנים למעבר שוב. זה בדרך כלל לוקח 3-6 ימים בין הקטעים להגיע 80% confluency.
5. hiPSCs הקפאה
הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של ירךמנג'רים לhiPSC-CMS הבאים מחזור ההקפאה / הפשרה.
- תווית צינורות קירור עם שם שורת התאים, סוג התא, מספר מעבר, ותאריך הקפאה. כקו מנחה כללי, להשתמש בבקבוקון אחד לכל גם צלחת 6 באר. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 9 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). הכן הקפאה בינונית עם FBS 90% ו -10% DMSO, ולשמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- לשאוב תקשורת והתרבות, להוסיף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x ודגירה של 2-7 דקות ב RT. משך חשיפת פתרון EDTA או ניתוק תא משתנה משורת תאים לשורת תאים.
- לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8.
- לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting מעלה ומטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות לא צריכים להיות מחולקות קטן יותר מ -100 גושי תא. להעביר את התאים מושעים לצינור חרוטי מוכן המכיל E8. צנטריפוגה בRT למשך 4 דקות ב 200 x גרם.
- לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μl של מדיום הקפאה קר לגלולה. Resuspend גלולה ידי pipetting 01:59 פעמים. הישרדות תא משתפרת על ידי שמירה על תאים בגושים גדולים.
- להעביר את תאי resuspended לתוך צינור קירור שכותרת. במהירות להזיז את הבקבוקונים לisopropanol הקפאת מיכל המכילה, אשר תאפשר לקירור הדרגתי. שמור את המכל עם תאים ב -80 ° C למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר את תאי חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
6. לב התמיינות של iPSC האדם
הערה: כל התקשורת צריכה להיות לפחות ב RT כאשר הוסיפו.
- לאחר ניתוק עם פתרון ניתוק תא EDTA או 1x, זרע כ -100,000 iPSCs האנושי על ECMS מצופה תרבות צלחות 6-גם לבידול (אותם צעדים כמו נהלי passaging תא). כאשר התאים מגיעים 85% confluency, לשנות את המדיום לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין עם 6CHIR99021 מיקרומטר מעכב GSK3-ביתא (CHIR) ולשמור במשך 48 שעות.
- לאחר 48 שעות, להחליף את מדיום התרבות CHIR המכיל עם RPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר לבד למשך 24 שעות (עד יום 3).
- ביום 3, לשנות את התקשורת לRPMI / B27 ללא אינסולין עם 5 מיקרומטר Wnt מעכב IWR1 ולשמור במשך 48 שעות (עד יום 5).
הערה: עיכוב Wnt יכול להיות גם ניסה באמצעות תרכובות מולקולה קטנות אחרות, כפי שתואר במחקרים קודמים 11. IWR1 נבחר על מעכבי Wnt מולקולה קטנה אחרים בשל הטווח המוגדל שבה הוכח כיעילים בעיכוב Wnt איתות 11. - ביום 5, לשנות את המדיום חזרה לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר למשך 48 שעות (עד יום 7).
- ביום 7, להחליף בינוני עם בינוני RPMI / B27 (עם אינסולין) ולהחליף בינוניים כל 3 ימים לאחר מכן עם אותו בינוני. מכות ספונטניות של שריר לב צריכה להיות גלויות ראשונה בכ היום 8 ליום10.
7. טיהור של cardiomyocytes האדם באמצעות הרעבת גלוקוז
- ביום שלאחר 10 בידול, לשנות את המדיום בכל טוב של 6-גם הצלחת 2 מיליליטר הבינוני גלוקוז הנמוך ולשמור על התאים במדיום הזה במשך 3 ימים (עד יום 13).
- ביום 13, לחזור תאים למדיום RPMI / B27 (עם אינסולין).
- לחלופין, replate cardiomyocytes לפני הסיבוב של רעב גלוקוז השני כדי לעזור לשחרר הלא cardiomyocytes מצלחת התרבות, המאפשר לניתוק קל של אי-cardiomyocytes במהלך רעב גלוקוז.
- ביום 13, בינוני לשאוב, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולנתק את התאים לתאים בודדים באמצעות 500 μl של אנזים התנערות תא במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. באופן ספציפי, לאחר 5 דקות של טיפול אנזים, להשתמש פיפטה 1000 μl לנתק ידני cardiomyocytes מהצלחת 6-היטב על ידי משיכת שוב ושוב את אנזים התנערות תא וריסוס נגדו cardiomyomonolayer cyte. עד 30 חזרות pipetting ייתכן שיהיה צורך לנתק את cardiomyocytes לתוך תאים בודדים.
- לאחר התאים הם ניתקו והם בצורה חדה-תאית, לאסוף את כל התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 5 מיליליטר של מדיום RPMI / B27 עם אינסולין כדי לדלל את אנזים התנערות תא צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 200 x g. לשאוב ולזרוק supernatant.
- להשעות מחדש את התאים עם מדיום 2 מיליליטר RPMI / B27 וצלחת על צלחת 6-גם מצופה ECMS חדשה. בדרך כלל, confluency גבוה יותר של שריר לב מסייע בהישרדות תא במהלך replating. מטרת replate 2 מיליון תאים לכל צלחת 6-גם חדשה להישרדות אופטימלית במהלך replating.
- ביום 14, לשנות את המדיום חזרה ל -2 מיליליטר של מדיום גלוקוז הנמוך למעגל קיפוח גלוקוז שני. תרבות התאים במדינת גלוקוז נמוכה זה במשך 3 ימים נוספים. רוב הלא-cardiomyocytes ימותו במצב התרבות הנמוך של גלוקוז זה.
- ביום 17 ב, לשנות הבינוני עד 2 מיליליטר של Rבינוני PMI / B27 עם אינסולין. התאים הנותרים יהיו cardiomyocytes הנקי במיוחד. cardiomyocytes אלה יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים, הקרנת סמים, ניתוח חילוף חומרים, ומבחנים במורד הזרם שונים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השינויים מורפולוגיים במהלך התמיינות hiPSC.
HiPSC התרבותי בצלחות מזין ללא גדל מושבות שטוחות כמו, דו-ממדיות. לאחר שהגיע סביב 85% confluency, טופלו hiPSCs עם 6 מיקרומטר CHIR לבידול (איור 1 א). כמויות ניכרות של מוות של תאים, תופעה נורמלית ושכיחה, נצפו לאחר 24 שעות של טיפול CHIR. לאחר יומיים של טיפול CHIR, hiPSCs המשיך להבחין כלפי גורל mesodermal. בהשוואה לתאים במושבות hiPSC, גודל תא עבור 2 תאים אלה היום גדל. מספר תאים גדל גם דרך תא חלוקה (איור 1). ביום 5, תאי mesodermal הופנו לשושלת הלב (mesoderm לב). בשלב זה, תאים מתחילים התגבשו ויצרו מבנים אופייניים, כמו סניף (איור 1 ג). ביום 10, מבנים דמויים-סניף הוכרזו מאוד, וכוכב cardiomyocytesטד להכות באופן ספונטני (1D איור). cardiomyocytes סופני בדיל לא להתרבות מעבר לנקודה זו. ציר זמן של פרוטוקול הבידול מוצג באיור 2.
cardiomyocytes Immunostaining וזרימת cytometry תוצאות הראו היו מטוהר עם רעב גלוקוז.
לאחר 10 ימים של בידול, יותר מ -50% מאזורי התא מכים. עם זאת, גיליונות תא להכות לעתים גם התערבבו עם לא-cardiomyocytes. כדי לבחון טוהר cardiomyocyte, תאים עם immunostaining נגד סמן cardiomyocyte Troponin-T לב (cTnT) התאפיינו לגלות כי רוב התאים היו cTnT חיובי. עם זאת, באוכלוסיית קנה בלתי של תאים מובחנים, מספר התאים גם חסר הבעה של cTnT, המצביע על נוכחותם של לא-cardiomyocytes באוכלוסייה מובחנת זה ביום 13 (איור 3 א). עם זאת, עם רעב גלוקוז,כמעט כל תאים הנותרים היו cTnT חיוביים ביום 13 (איור 3), המצביעים על טיהור מוצלחת של cardiomyocytes הבא רעב גלוקוז. נתונים אלה מאששים נוספים באמצעות ניתוח התזרים cytometry. אוכלוסייה של תאים מובחנים ביום שלאחר 13 בידול הכילה כ תאי TNNT2 + 50% כאשר לא גלוקוז המורעב (איור 4 א). בידול מקביל נערך גם אבל עם חסך גלוקוז 3 ימים מתחיל ביום 10 אחרי הבידול. בניגוד לבידול unstarved, קיפוח גלוקוז הוביל לאוכלוסייה מטוהרת המכילה TNNT2 + תאי 90% ביום 13 (איור 4).
() HiPSCs המובחן איור 1. שינויים מורפולוגיים רציפים במהלך התמיינות hiPSC כלפי שושלת הלב.במורפולוגיה מושבה טיפוסית 0 תערוכת יום והגיע סביב confluency 85%. (ב) ביום 2, תאים לאחר הטיפול בCHIR במשך יומיים הגיעו ל -100% confluency ונכנסו לשושלת mesodermal. (ג) ביום 5, תאים לאחר הטיפול בIWR1 עבור 2 ימים נכנסו לשלב mesoderm לב. תאים מסוימים החלו למזג וליצור מורפולוגיות אופייניות כמו סניף-(מסומנות בחצים). (ד) ביום 7-10, מבנים דמויים-סניף ניכרים מאוד, וcardiomyocytes מתחיל באופן ספונטני מכות. בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ציר זמן של איור 2. פרוטוקול בידול hiPSC-CM ותהליך רעב גלוקוז שלאחר מכן. מכות cardiomyocytes מחדש בדרך כלל נצפה לראשונה בכ ימים 7-10. שני סבבים של רעב גלוקוז יגרמו אוכלוסייה מטוהרת של cardiomyocytes ביום 17. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Immunofluorescence מגלה טיהור של cardiomyocytes הבא רעב גלוקוז. (א) בתאי קנה בלתי לאחר 13 ימים של בידול הוכתמו לב Troponin T (cTnT). רוב התאים מובחנים לשריר לב והיו cTnT חיובי, אבל מספר התאים לא-לבבי, cTnT שלילי גם בהווה. (ב) לעומת זאת, לאחר רעב גלוקוז 3 ימים מתחיל ביום 10, כמעט כל התאים ששרדו היו cTnT חיובי יום 13. בר סולם = 200 מיקרומטר על ידי.נ"צ = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Cytometry זרימה מגלה טיהור של cardiomyocytes הבא רעב גלוקוז. (א) לאחר 13 ימים של בידול לב ללא רעב גלוקוז, אוכלוסייה של תאים הציגה TNNT2 + cardiomyocytes בערך 50%. אדום מציין אוכלוסיית תאים מובחנת וכחול מציין hiPSCs מובחן כביקורת שלילית. (ב) לאחר 10 ימים של בידול לב ואחריו 3 ימים של רעב גלוקוז, אוכלוסייה של תאים מאותו הקבוצה של בידול הייתה מטוהרת להכיל TNNT2 + cardiomyocytes 90%. לחץ כאן ללהציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| יצירות לבינוניות E8 | |||
| E8 | נפח: 1 ליטר | חברה | מספר קטלוג |
| DMEM / F12 עם גלוטמין וHEPES | 1,000 מיליליטר | Invitrogen | 11330-032 |
| NaHCO 3 (7.5%, 75 מ"ג / מיליליטר) | 7.24 מיליליטר | Invitrogen | 25080-094 |
| חומצת L-Ascorbic 2-פוספט (64 מ"ג / מיליליטר) | 1 מיליליטר | Sigma | A8960 |
| סלניט נתרן (70 מיקרוגרם / מיליליטר) | 200 μl | Sigma | S5261 |
| transferrin (50 מ"ג / מיליליטר) | 214 μl | Sigma | T3705 |
| אינסולין (4 מ"ג / מיליליטר) 5 מיליליטר | Invitrogen | 12585-014 | |
| FGF2 (200 ng / μl) | 500 μl | Peprotech | 100-18B |
| TGFB1 (100 ng / μl) | 20 μl | Peprotech | 100-21 |
| פתרונות המניות ליצירות E8 | |
| החומצה-2-פוספט L-Ascorbic (64 מ"ג / מיליליטר) | 3.2 גרם ב 50 מיליליטר המים ultrapure, חנות 500 aliquots μl ב -20 ° C |
| Transferrin (50 מ"ג / מיליליטר) | 500 מ"ג ב 10 מיליליטר של מים ultrapure, חנות 107 aliquots μl ב -20 ° C |
| סלניט נתרן (70 מיקרוגרם / מיליליטר) | סלניט נתרן 35 מ"ג למי 500 מיליליטר ultrapure, חנות 100 aliquots μl ב -20 ° C |
| FGF2 (200 ng / μl) | 1 מ"ג בD- הקר 5 מיליליטרPBS, חנות 250 aliquots μl ב -20 ° C |
| TGFB1 (100 ng / μl) | ב 1 מיליליטר חומצה קרה 10 מ"מ לימון, pH 3, חנות 10 aliquots μl 100 מיקרוגרם ב -20 ° C |
טבלת 1. הרכב של E8 בינוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קבלת כמות גדולה של שריר לב הנגזר hiPSC נקי במיוחד היא קריטית למחקר לב בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational. פרוטוקולי בידול לב עברו שיפורים עצומים בשנים האחרונות, מעבר משיטות המבוסס על גוף embryoid ניצול צמיחת קרדיוגני גורמים 2, למטריצת שיטות כריך 12, ולבסוף לשיטות המבוססות monolayer-מווסת מולקולה קטנות ו5. מהפרוטוקולים האמורים, הפרוטוקול המתואר כאן מוצג הגבוה ביותר ואת יעילות בידול לב לשחזור ביותר לשורות תאי hiPSC שונות על ידי ויסות איתות / β-קטנין Wnt באמצעות המולקולות הקטנות CHIR וIWR 5,7. באופן ספציפי, hiPSCs מובחן היו מושרה לעבור התמיינות mesodermal עם CHIR GSK3-beta המעכב ובידול לב שלאחר מכן עם IWR1 מעכב איתות Wnt. צעדים אלה רציפים שלאפנון איתות Wnt, נעזר בדלדול אינסולין בשלב האינדוקציה שושלת הלב, הוביל לבידול לב יעיל ביותר. CHIR הוא מעכב GSK3-beta מולקולה נפוץ קטן המשמש לזירוז mesodermal, אבל מולקולות קטנות אחרות לעיכוב GSK3-ביתא נבדקו בפרוטוקולי בידול cardiomyocyte 11. מספר רב של אפשרויות משמשות גם למעכב Wnt מולקולה קטנה שלאחר מכן. לדוגמא, פרסום האחרון מתמקד בבידול כימי מוגדר של תאי גזע pluripotent לcardiomyocytes משתמש 2 מיקרומטר Wnt-C59 לעיכוב Wnt יעיל וmesoderm לב אינדוקציה 11.
בנוסף, cardiomyocytes המובחן עם שיטת רעב גלוקוז היה מטוהרים נוספים, שמנצל את חילוף החומרים של גלוקוז הברור לזרום קיימים בין cardiomyocytes ולא cardiomyocytes 8. זה חיוני לציין כי אפקטיבי של שיטת רעב גלוקוז הוא Density תלוי (כלומר, בידול שהניב שיעור גבוה יותר של שריר לב נוטה יותר להשגת הישרדות cardiomyocyte גדולה יותר). עם זאת, המעבר למדיום גלוקוז הנמוך הוא גם מצב מלחיץ עבור cardiomyocytes. חשוב לשנות את התאים בחזרה לRPMI / B27 הרגיל עם מדיום אינסולין לאחר 3 ימים של רעב גלוקוז. בפרוטוקול זה, מערכת צמיחת מזין ללא נוצלה, שבו תאי גזע pluripotent לא גדלו על fibroblasts עכבר מזין העוברי (MEFs). עם זאת, פרוטוקולי בידול לב לפני שמנוצלים מערכות מבוססות מזין לייצר cardiomyocytes מתאי גזע pluripotent 5. כמו כן, פרוטוקולים לפני שמשמשים גם בינוני mTeSR1 לתחזוקת תאי גזע, אך מערכת התקשורת והמזין ללא E8 מנוצלת כאן היא מעולה בשל הפשטות וחוסר ברכיבי xenogeneic עודפים כגון אלבומין בסרום השור וfibroblasts העכבר העוברי שלה.
נכון לעכשיו,התמיינות תאי גזע pluripotent כלפי שושלות cardiomyocyte היא במידה רבה חזקה, אבל עדיין סובלת משונות קו לקו hiPSC במונחים של יעילות. זה נשאר נושא מרכזי בתחום בידול הלב ודורש מחקר נוסף. יעילות הבידול הוא השתפר על ידי תחזוקה נכונה של קווי hiPSC, ובפרט, מניעת overconfluency במהלך תחזוקת hiPSC. השתנות נוספות נובעת מזריעת תאים במהלך תהליך passaging, כmonolayer זורעים באופן שווה של hiPSCs נוטה להצמיח הבידול הטוב ביותר הכולל. כאן, שמקורם בעכבר ECMS, המבוסס על Matrigel לזריעת תאים בתרבית תאים נוצל בהצלחה, אבל מעבר סופו של דבר לקסנו ללא מצעים מומלץ. בכל הקשור לזריעת תאים על ECMS, זריעה אחידה לעתים קרובות תוצאות חלוקה לא שווה של cardiomyocytes בתוך היטב בפרט. לדוגמא, אם hiPSCs הם זורעים בצורה לא אחידה, הקצוות היטב בצלחת שש היטב עשויים להצמיח HIGהמספרים שלה cardiomyocytes מהמרכז גם. תנאי זריעה אחידים אלה עשויים להצמיח בידול יעילות נמוך ומספר גדול יותר של אי-cardiomyocyte, נגזרי mesodermal כגון fibroblasts ותאי שריר חלק. יש לנו גם ציינו כי בידול יעילות נמוכה (מתחת ל -50%) הוא הרבה יותר קשה כדי לטהר באמצעות תהליך קיפוח גלוקוז שהוזכר כאן. תופעת לוואי נוסף של רעב גלוקוז בטווח הארוך הוא הפסד אפשרי בכדאיות cardiomyocyte. למרות cardiomyocytes מסוגל לעכל חומצת החלב בהעדר גלוקוז, אנו מוצאים כי בורר זה לסביבה נמוכה-גלוקוז הוא מלחיץ עבור התאים. תאים עלולים להפסיק באופן ספונטני מכות, וכמה אובדן תא אפשר לראות אם רעב גלוקוז הוא ממושך מעבר לזמן המומלץ. רגישות מוגברת זו לקיפוח גלוקוז יכולה להיות רעיוני של חוסר בגרות התפתחותית, פונקציונלי, ואלקטרו המבוסס היטב של cardiomyocy מקורן בתאי הגזעtes בהשוואה למבוגרים אמיתיים cardiomyocytes 13.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן משלב, שיטה הקטנה על בסיס מולקולות monolayer hiPSC בידול לב עם שיטת רעב גלוקוז cardiomyocyte לטיהור. פרוטוקול זה מאפשר לדור לשחזור של cardiomyocytes המטוהרים ביותר וצריך להקל על מבחני במורד הזרם שונים רלוונטיים לדוגמנות מחלות לב והקרנת סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 | |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 | |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
