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Developmental Biology

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS)은 기초 연구와 번역 애플리케이션에 사용할 수 차 심근 세포의 부족을 해결하기위한 중요한 셀 소스되고있다. 심근에 hiPSCs 차별화, 배아 체 (EB) 기반 분화 및 성장 인자 유도를 포함하는 다양한 프로토콜들이 개발되었다. 그러나, 이들 프로토콜은 비효율적 정제 심근 세포를 생성하는 능력에서 매우 다양하다. 최근의 Wnt / β-catenin의 신호의 작은 분자 기반 프로토콜을 사용하는 변조는 높은 효율로 심장 분화를 촉진 것으로 나타났다. 이 프로토콜로, 분화 된 세포의 50 % 초과 -60 % 심장 트로포 닌 양성 심근 세포가 지속적으로 관찰했다. 또 심근 순도를 증가시키기 위해, 구체적으로는 분화 세포 대사 차이에 기초하여 비 - 심근 세포를 제거하는 기아 글루코스 행 하였다심근 세포와 비 심근 세포 사이의. 이 선택 전략을 사용하여, 우리는 지속적으로 분화 된 세포의 집단에서 비 심근에 심근의 비율보다 30 % 증가를 획득. 이러한 고순도 심근 질환 체외 모델링 연구 및 약물 스크리닝 분석법 인간 IPSC 기반 결과의 신뢰성을 향상한다.

Introduction

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차 인간 심근 인해 침습 심장 생검 및 배양 때문에 열악 장기 세포 생존의 단일 셀에 대한 해리 곤란한 요구 사항으로 얻는 것이 곤란하다. 차 인간의 심근 세포, 환자 맞춤형 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 부족을 감안할 때 (hiPSC-CM) 기술은 기초 연구에 대한 강력한 대안 심근 소스뿐만 아니라 질병 모델링 및 약물 임상 및 번역 응용 프로그램으로 간주되었습니다 발견 한. 심근 세포로 다 능성 줄기 세포를 분화 이른 노력 배양체 EBS ()을 사용하여 분화 프로토콜을 채용하지만, EB의 셀 종종으로 25 % 이상이 심근 2,3- 치기 때문에이 방법은 제조 심장 근세포에서 비효율적이다. 비교적, 및 BMP4를 티빈 사이토 카인을 사용하여 단층 계 분화 프로토콜 EB를보다 높은 효율을 표시하지만이 프로토콜은, 여전히 상대적으로 비효율적이다 인간 다 능성 줄기 세포 (4)의 제한된 수의 비싼 성장 인자, 및 전용 기능을 필요로한다. 최근 고효율 hiPSC 단층 계 심근 분화 프로토콜의 Wnt / β 카테닌 5 변조 신호에 의해 개발되었다. 이러한 hiPSC-CMS는 심장 트로포 닌 T와 알파 티닌, 심근 6의 표준 마커 두 sarcomeric 단백질을 표현한다. 프로토콜은 여기에 설명이 저분자 계, 피더 무 세포 단일 층 분화 방법 5,7의 적응이다. 우리는 7-10일 (그림 1) 이후 hiPSCs에서 심근 세포를 구타 얻을 수 있습니다. 그러나 50 %는 세포를 치고 그 결과 심근 세포의 분화에 따라 지속적으로 면역 염색하는 등 심장 관련 트로포 닌 T와 알파 - 티닌과 같은 심근 특정 마커에 대한 부정적 비 심근 세포의 인구의 존재를 보여줍니다. 푸에rther가 심근 세포를 정제 및 비 심근 제거 이기종 분화 된 세포 집단은 일 대 다수의 매우 낮은 글루코스 배지 (도 2)로 처리하여 기아 글루코스 행 하였다. 이러한 처리는 선택적으로 낮은 글루코스 8 환경에서 생존하기 위해 주 에너지 원으로 락트산을 대사하는 심근 세포의 능력으로 인해 비 심근 아니지만 비 심근 세포를 제거한다. 이 정제 단계 이후에, 비 심장 근세포로 심근 세포의 비율이 40 % 증가 (도 3,도 4)이 관측되고, 이러한 셀 하류 유전자 발현 분석, 질병 모델링, 및 약물 스크리닝 분석에 사용될 수있다.

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Protocol

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주 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약 벤더 정보가 표 1에 나열되어있다 및 재료 목록. 세포와 접촉하는 모든 솔루션과 장비는 멸균해야하며, 무균 기술 규격 제품을 사용한다. 달리 명시되지 않는 한 가습 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 모든 문화 배양을 수행합니다. 이 프로토콜에서, 모든 분화가되는 hiPSCs가 시딩 6- 웰 플레이트에서 수행된다. 분화 및 정제 후, 세포를 분해 할 수 있고, 다운 스트림 사용을 위해 플레이 팅.

1. 중간 준비

  1. E8 매체의 경우, 각 미디어 구성 요소에 대한 스톡 용액 (NaHCO3을, L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 아 셀렌 산 나트륨, 트랜스페린, 인슐린, FGF2, TGFB1)을하고 -20 ℃에서 용액을 저장한다. DMEM / F12의 병에 원액을 적당량을 추가하고 소독 필터링합니다. 솔루션 CONCENTR주식 구성 요소 및 E8 매체에 대한 ATION 반응 설정은 표 1에서 찾을 수 있습니다.
  2. 세포 외 매트릭스 솔루션의 경우, 4 ° CO / N에서 (일반적으로 10 ㎎ / ㎖에서 제공) 기저막 행렬을 해동. 인간 다 능성 줄기 세포가 알파 -6- 일 - 베타 - 인테그린 9를 사용하여이 물질에 잘 부착 할 수 있기 때문에 마트 리겔은 일반적으로 다 능성 줄기 세포 배양에 사용된다. 일단 차가운 얼음 피펫 팁 및 튜브를 사용하여 얼음에 2.25 MG (250 μL) 분취 량을 -80 ℃에서 분취 량을 저장, 해동.
    1. ECMS으로 판을 프리 코팅 할 때, 해동 및 얼음에 세포 외 기질 용액 (ECMS)을 나누어지는. (1)의 비율로 ECMS 빙냉 DMEM / F12 배지 믹스 : 얼음 200. 조기 ECMS 응고를 방지하기 위해 저온으로 유지하시오.
  3. 인슐린 매체없이 RPMI / B27를 들어, RPMI 미디어의 500 ml의에 B27 마이너스 인슐린 10 ㎖를 추가합니다.
  4. 매체 (인슐린) RPMI / B27를 들어, insuli로 (B27 보충 10 ㎖를 추가N) 및 RPMI 매체에 500㎖의 펜 연쇄상 항생제 5 ㎖.
  5. 낮은 포도당 매체의 경우, B27 보충 10ml의 포도당이없는 RPMI 미디어의 500 ml의에 펜 연쇄상 구균 항생제 5 ㎖를 추가합니다.
  6. : 1 비율 동결 / 동결 보존 매체의 경우,도 9에서 디메틸 설폭 시드 (DMSO)와 함께 소 태아 혈청을 혼합한다. 동결 매체는 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다.
    참고 : 모든 매체가 여과하고 저장 4 ° C에서와 달리 명시되지 않는 한 이주 내에서 사용되어야한다. 달리 명시하지 않는 한 아래에 사용 된 모든 시약 / 솔루션 볼륨은 6 잘 판에서 단일 잘위한 것입니다.

2. ECMS로 6 웰 플레이트 중고 코팅

  1. 다음 6 웰 플레이트 각 웰에 갓 ECMS 2 ㎖를 적용, 200 : 1의 비율로 빙냉 DMEM / F12의 미디어 (예, 마트 리겔) 기저막 매트릭스를 혼합하여 ECMS합니다. 잘 6 웰 플레이트의 각은 약 90 mg의 ECMS를 받게됩니다.
  2. ECM을 품어S는 37 ° C에서 1 시간 동안 코팅 된 플레이트. 각 웰에서, 흡인하는 DMEM / F12 솔루션 세포를 도금 직전. 플레이트를 세포를 수신 할 준비가 될 것이다.

3. 해동 냉동 hiPSCs

참고 : 최적의 배양 및 동결 / 해동주기 다음 hiPSC-의 CM에 hiPSCs의 다운 스트림 분화 등의 원인이 밀접하게이 절차를 수행합니다.

  1. 6- 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 hiPSCs 바이알을 해동. 각각의 병에 대한 ROCK 저해제 (10 μM) 감기 E8 매체의 9 ml로 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. ROCK 저해제는 냉동 보존 (10)를 다음과 hiPSCs의 생존을 향상시킵니다. 약 5mm 직경의 얼음 결정이 남아 때까지 세포를 해동 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 유지합니다.
  2. 70 % 에탄올과 튜브의 외부를 스프레이. 멸균 층류 후드로 이동하기 전에 휴지와 병을 닦습니다.
  3. 준비된 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. t을 씻어그는 E8 배지 500 μL 회 유리 병 같은 원추형 튜브에 세포를 해동 함유하는 배지를 옮긴다. 200 x g에서 4 분간 실온에서 원심 분리기.
  4. 원심 분리 후 상층 액을 기음 부드럽게 ROCK 저해제 (10 μM)와 E8 매체의 2 ml의 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트 ECMS로 사전 코팅 잘 하나에 재현 탁 세포를 전송합니다.
  5. 배양 24 시간 후 ROCK 저해제없이 E8 매체와 매체를 교체합니다. 세포는이 시간 준수해야합니다.

hiPSCs 4.과 Passaging

  1. 일반적으로 6 웰 플레이트에서 75 % -80 %의 포화 상태에 도달 한 후 통과 hiPSCs. 문화 매체를 대기음. 신속하게 멸균 1 ㎖, RT PBS로 우물을 씻어. 대기음 PBS.
    1. 500 0.5 mM의 EDTA ㎕의 또는 1X 세포 분리 솔루션 (예를 들어, Accutase)를 첨가하고, 실온에서 1-7 분 동안 품어. EDTA 배양을위한 적절한 시간은 hiPSC 라인에 따라 달라집니다. 눈에 보이는 컬링 O를 볼 것을 예상가장자리 주위 식민지의 R 비후이 그 EDTA 또는 세포 분리 솔루션을 나타냅니다으로 제거 할 준비가되어 있습니다.
  2. EDTA 또는 셀 분리 솔루션을 기음. 10 μM의 ROCK 저해제로 보충 E8 매체의 1 ML을 추가합니다. 반복적으로 피펫 팅과 아래 P1000 피펫으로 식민지를 분사하여 잘에 hiPSC 식민지를 대체. 식민지 완료 후 5 ~ 10 세포 덩어리로 분리해야합니다.
  3. 15 ML 원뿔 관에 ROCK 억제제 E8 매체의 1에 현탁 된 식민지를 전송합니다.
  4. E8 매체에서 작은 덩어​​리로 큰 세포 덩어리를 방해. 세포를 희석하여 세포 현탁액 억제제 E8 매체의 적절한 볼륨. 희석 추가 매체 볼륨이 세포 밀도에 따라 우물의 수는 시드 할. 이상적으로, hiPSCs의 단일, 80 %의 합류가 잘 1:12 희석해야한다.
    1. CE의 기존 1 ml의 ROCK 저해제와 11 ml의 E8 매체를 추가전술 한 15ml의 원뿔형 튜브 LL 용액 1:12 희석액을 얻었다.
  5. 또한 (각 조각에 50-200 세포가 최선의 주위에) 작은 세포 조각에 세포 덩어리를 씹다. 이 세포 생존을 감소시키기 때문에 피 오버 분쇄하여.
  6. 기음 미리 코팅 된 플레이트에서 ECMS 각 우물에 재현 탁 세포 2 ㎖를 추가합니다. 6 웰 플레이트의 웰 당 약 10 만 세포가 이상적입니다. 웰의 중앙에 세포의 클러스터링을 피하기 위해 잘 해결 고르게 분배하는 세포를 목표로한다.
  7. 배양 24 시간 후, ROCK 저해제없이 E8 매체와 매체를 교체합니다. 세포가 80 % 합류가 될 때까지 배양 배지마다 24 시간을 변경합니다. 이어서, 세포를 다시 통과 할 준비가되었다. 그것은 일반적으로 80 % 포화 상태에 도달하는 통로 사이 3-6일 걸립니다.

5. 어는 hiPSCs

참고 : 최적의 배양과 엉덩이의 다운 스트림 분화 등의 원인이 밀접하게 다음 절차를 수행hiPSC-CM이에 SCS는 동결 / 해동 사이클을 다음과 같습니다.

  1. 세포주 이름, 셀 타입, 통로 번호 및 날짜와 함께 동결 극저온 튜브 레이블. 일반적인 지침으로, 6 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 유리 병을 사용합니다. ROCK 저해제 (10 μM)와 E8 매체의 9 ml로 가득 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 90 % FBS 10 % DMSO와 매체를 동결 준비 및 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 매체를 유지합니다.
  2. , 문화 미디어를 대기음 500 0.5 mM의 EDTA ㎕의 또는 1X 세포 분리 솔루션을 추가하고 실온에서 2-7 분 동안 품어. EDTA 또는 세포 분리 용액 노출 기간은 세포주로 세포주 다르다.
  3. 기음 EDTA 또는 세포 분리 솔루션입니다. E8 매체의 1 ML을 추가합니다.
  4. 피펫 팅과 아래 P1000 피펫으로 식민지를 분사하여 잘 hiPSC 식민지를 대체. 식민지는 100보다 작은 세포 덩어리로 분리 할 수​​ 없습니다. E8을 함유하는 원뿔형 튜브에 제조 된 현탁 세포 이동. R 원심 분리기T 200 x g에서 4 분.
  5. 뜨는을 기음과 펠렛에 차가운 동결 매체의 500 μl를 추가합니다. 1-2 회 피펫 팅하여 펠릿을 재현 탁. 세포 생존은 큰 덩어리에서 세포를 유지하여 개선된다.
  6. 레이블이 극저온 튜브에 재현 탁 세포를 전송합니다. 신속 점진적 냉각을 위해 수 냉동 컨테이너 포함 이소프로판올로 튜브를 이동합니다. 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 셀을 전송, 24 시간 동안 -80 ° C에서 셀 용기를 보관.

인간의 IPSC 6. 심장 차별화

참고 : 추가 할 때 모든 미디어가 RT 적어도해야한다.

  1. EDTA 또는 1 배 세포 분리 솔루션을 분리 한 후, 약 10 만 차별화를위한 ECMS 코팅 6 웰 배양 접시에 인간의 iPSCs (세포 계대 절차와 동일한 절차를) 씨입니다. 세포가 85 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, (6) 인슐린 매체없이 RPMI / B27으로 변화 매체μM GSK3 베타 억제제 CHIR99021 (치르)과 48 시간 동안 유지한다.
  2. 48 시간 후, 인슐린 매체없이 RPMI / B27로 치르 함유 배지를 교체하고 (3 일까지) 24 시간 동안 혼자 남겨.
  3. 3 일에서 5 μM의 Wnt 억제제 IWR1과 인슐린없이 RPMI / B27에 미디어를 변경하고 (5 일까지) 48 시간 동안 유지한다.
    주 : 이전 연구 11에 기재된 바와 같이이 Wnt 억제는 또한, 다른 저분자 화합물을 사용하여 시도 될 수있다. IWR1 인해 그것이 11의 Wnt 신호 전달 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다 증가하는 범위로 다른 소분자 저해제의 Wnt상에서 선택 하였다.
  4. 5 일에서 인슐린 매체없이 다시 RPMI / B27에 매체를 변경하고 (7 일까지) 48 시간 동안 둡니다.
  5. 7 일에, (인슐린) RPMI / B27 매체와 매체를 교체하고 같은 매체 매 3 일 이후 매체를 교체합니다. 심근 세포의 자발적인 박동는 첫 날에 약 8 일에서 볼 수 있어야합니다10.

포도당 기아을 통해 인간의 심근 세포 7. 정화

  1. 10 일 후 분화에서, 6 웰 플레이트에 2 ㎖의 저혈당 배지의 각 웰에서 배지를 변경하고 (13 일까지) 3 일간이 배지에서 세포를 유지한다.
  2. 하루에 13에서, (인슐린) RPMI / B27 매체에 세포를 반환합니다.
  3. 선택적으로, 포도당 기아 동안 비 심근 쉽게 분리를 허용, 문화 판에서 비 심근 세포를 풀고 도움이 포도당 기아의 두 번째 라운드 이전에 심근 세포를 replate.
    1. 13 일째, 대기음 매체에서, PBS로 한번 세척하고, 37 ° C에서 5 분 동안 세포 해리 효소의 500 μl를 사용하여 단일 세포로 세포를 해리. 특히, 효소 처리의 5 분 후, 수동으로 반복 셀 탈퇴 효소를 위로 끌어 당기 cardiomyo에 대해 그것을 분사하여 6 웰 플레이트에서 심근 세포를 해리 1,000 μL 피펫을 사용cyte 단일 층. 30 피펫 반복 최대 단일 세포로 심근 세포를 떼어 놓다해야 할 수 있습니다.
    2. 세포 해리 단일 셀 형태 인 후 X g (200)에서 4 분 동안 세포 해리 효소 및 원심 분리기를 희석 인슐린 RPMI / B27 배지 5 ㎖를 가득 15ml의 원뿔형 튜브에 모든 세포를 수집한다. 기음과 상층 액을 제거한다.
    3. 새로운 ECMS 코팅 6 웰 플레이트에 2 ml의 RPMI / B27 매체 접시와 세포를 다시 일시 중지합니다. 일반적으로 심근의 높은 포화 상태가 replating 동안 세포 생존에 도움이됩니다. replating시 최적의 생존을위한 새로운 6 자 접시 당 2 백만 세포를 replate하는 것을 목표로하고 있습니다.
  4. 14 일에, 두 번째 포도당 박탈주기 위해 다시 낮은 포도당 배지 2 ㎖에 매체를 변경합니다. 문화 3 일 이상이 낮은 혈당 상태에서 세포. 비 심근 세포의 대부분이 낮은 포도당 배양 조건에서 죽을 것이다.
  5. 17 일에, R의 2 ㎖의 배지를 변경인슐린 PMI / B27 매체. 나머지 세포는 고도로 정제 된 심근 될 것입니다. 이러한 심근은 유전자 발현 분석, 약물 스크리닝, 대사 분석 및 다양한 다른 하류 분석법에 사용될 수있다.

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Representative Results

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hiPSC 차별화 동안 형태 학적 변화.

공급 장치가없는 접시에서 배양 hiPSC는 평면의 2 차원 식민지 증가했다. 약 85 %의 포화 상태에 도달하면, hiPSCs는 분화 (그림 1A) 6 μM 치르 처리 하였다. 세포 죽음, 정상 및 일반적인 현상은 상당량 치르 처리 24 시간 후에 관찰 하였다. 치르 처리 이틀 후, hiPSCs는 중배엽 운명 향해 분화하는 것을 계속했다. hiPSC 식민지에서 세포와 비교할 때 이러한 일이 세포에 대한 세포의 크기가 증가했다. 세포 수는 세포 분열 (그림 1B)를 통해 증가했다. 5 일째, 중배엽 세포 계보 심장 (심장 중배엽)을 지향 하였다. 이 때, 세포 유착과 특성, 가지 같은 구조 (그림 1C)을 형성하기 시작. 10 일에, 지사와 같은 구조는 매우 발음 및 심근 스타했다테드는 자발적으로 (그림 1D)를 상회. 말기 차별화 된 심근 세포는이 시점을 넘어 확산되지 않습니다. 분화 프로토콜의 타임 라인은도 2에 도시되어있다.

보여 면역 염색 결과 유동 세포 계측법 심근 세포는 포도당 기아로 정제 하였다.

분화 10 일 후, 셀 영역의 50 % 이상 상회한다. 그러나 박동 세포 시트는 때때로 비 심근 세포와 혼합된다. 심근 순도를 검사하려면, 심근 마커 심장 트로포 닌-T (cTnT의)에 대한 면역과 세포는 대부분의 세포가 cTnT는 긍정적이라고 찾을 특징으로했다. 그러나 분화 된 세포의 집단에서 비 정제, 세포의 수는도 13 일 (도 3a)에서이 집단에서 분화 된 심근 세포의 비 존재를 시사 cTnT의 발현의 결여. 그러나 포도당 기아와,거의 모든 나머지 세포는 포도당 기아 다음 심근 세포의 성공적인 정화를 나타내는, 일 (13) (그림 3B)에서 cTnT는 양성이었다. 이 데이터는 추가 분석 유동 세포 계측법을 사용하여 확증되었다. 하루 13 후 분화에 분화 된 세포의 인구는 굶주린 (그림 4A)를 포도당하지 약 50 % TNNT2 + 세포가 포함되어 있습니다. 병렬 차별화도 실시하지만 삼일 포도당 부족으로 분화 후 10 일에 시작했다. unstarved 분화 달리, 글루코스 손실은 13 일 (도 4b)에서 90 % TNNT2 + 세포를 포함하는 정제 된 인구되었다.

그림 1
그림 1. 심장 혈통으로 hiPSC 차별화 동안 순차적 형태로 변경됩니다. (A) 미분화 hiPSCs0 일 전시 전형적인 식민지 형태에서 85 %의 컨 플루 주위에 도달했다. 2 일에서 (B)는, 치르 치료 후 세포 이틀 동안 100 % 컨 플루 언시에 도달하고 중배엽 계통 들어갔다. 5 일째 (C)는, 셀 IWR1 치료 후 이일은 심장 중배엽 스테이지를위한 입력. 일부 셀과 퓨즈 (화살표로 나타낸) 특성 분기 형 모폴로지를 형성하기 시작했다. 7-10 일 (D)는, 분기 형 구조는 매우 명백하며, 심근 자발적 박동. 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
hiPSC-CM 분화 프로토콜과 이후의 포도당 기아 프로세스의 그림 2. 타임 라인. 심근 잔 다시 일반적으로 첫 번째 약 7 ~ 10 일에 관찰했다. 포도당 기아의 두 라운드는 하루 17에 의한 심근의 정제 인구가 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 면역 형광 포도당 기아 다음 심근 세포의 정화를 알 수있다. (A)의 분화 십삼일가 심장 트로포 닌 T (cTnT의)로 염색 한 후 정제되지 않은 세포. 대부분의 세포는 심근 세포로 분화하고 긍정적 인 cTnT의를했지만, 비 심장, cTnT의 음성 세포의 숫자도 존재했다. 반면에 (B), 10 일에 시작하는 삼일 포도당 기아 후, 거의 모든 생존 세포의 cTnT는 하루 13 스케일 바 = 200 μm의에 의해 양성이었다.심판 = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 유동 세포 계측법 포도당 기아 다음 심근 세포의 정화를 알 수있다. (A)이 포도당 기아없이 심장 분화 13 일 후, 세포의 인구가 약 50 % TNNT2 + 심근 세포를 나타냈다. 빨간색은 분화 된 세포 집단을 나타내며 파란색은 음성 대조군으로 미분화 hiPSCs를 나타냅니다. 심장 분화 후 10 일 후 (B) 및 포도당 기아 3 일 다음은 차별화의 동일한 배치에서 세포의 인구는 90 % TNNT2 + 심근 세포를 포함하는 정제 하였다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.

E8 매체 용 조성물
E8 볼륨 : 1 L 회사 카탈로그 번호
글루타민과 HEPES와 DMEM는 / F12 1000 ml의 인비 트 로젠 11330-032
NaHCO3 (7.5 %, 75 ㎎ / ㎖) 7.24 ml의 인비 트 로젠 25080-094
L 아스코르브 산 -2- 포스페이트 (64 ㎎ / ㎖) 1 ml의 시그마 A8960
아 셀렌 산 나트륨 (70 ㎍ / ㎖) 200 μL 시그마 S5261
트랜스페린 (50 ㎎ / ㎖) 214 μL 시그마 T3705
인슐린 (4 ㎎ / ㎖) 5 ml의 인비 트 로젠 12585-014
FGF2 (200 NG / μL) 500 μL Peprotech 100-18B
TGFB1 (100 NG / μL) 20 μL Peprotech 100-21
E8 조성물에 대한 재고 솔루션
L- 아스 코르 빈산 -2- 인산 (64 ㎎ / ㎖) 50 ml의 초순수 3.2 g, 상점 500 μL 씩 -20 ° C에서
트랜스페린 (50 ㎎ / ㎖) -20 ° C에서 초순수, 저장 107 μL 씩 10 ml의 500 mg의
아 셀렌 산 나트륨 (70 ㎍ / ㎖) -20 ℃에서 500ml의 초순수, 점포 100 μL 분취 액을 후 35 mg의 나트륨 셀레 나이트
FGF2 (200 NG / μL) 5 ml의 차가운 D- 1 mg의PBS, 상점 250 μL 씩 -20 ° C에서
TGFB1 (100 NG / μL) -20 ° C에서 1 ml의 차가운 10 mM의 시트르산, pH 3으로, 저장소 10 μL 분취 액에 100 μg의

E8 중간 표 1. 구성.

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Discussion

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고순도 hiPSC 유래 심근 세포를 다량 획득하는 기본 심장 연구뿐 아니라 임상 및 병진 애플리케이션에 중요하다. 심장 분화 프로토콜은 작은 분자 변조 및 단층 기반의 방법 (5)에 마지막으로 심인성 성장을 이용하여 배아 몸 기반 방식에서 전환, 최근 몇 년 동안 엄청난 개선을 시행 샌드위치 방법 (12) - 매트릭스, 2 인자하고있다. 전술 한 프로토콜, 여기에서 설명한 프로토콜은 최고 및 소분자 치르 및 IWR 5,7-을 사용의 Wnt / β 카테닌 신호를 변조함으로써 hiPSC 상이한 세포주에 대한 가장 재현성 심장 분화 효율 표시. 특히, 미분화 hiPSCs는 Wnt 신호 억제제 IWR1와 GSK3 베타 억제제 치르 이후 심장 차별화 중배엽 차별화를 받아야하도록 유도했다. 이러한 순차적 인 단계Wnt 신호 변조, 심장 계통의 유도 단계에서 인슐린 결핍에 힘 입어, 고효율의 심장 분화되었다. 치르가 중배엽 유도에 사용되는 공통의 소분자 GSK3 베타 억제제이지만, GSK3 베타 억제하기위한 다른 소분자 심근 분화 프로토콜 (11)에서 테스트되었다. 여러 옵션은 후속의 Wnt 소분자 억제제에 사용된다. 예를 들어, 최근의 간행물 심장 근세포로 다 능성 줄기 세포를 화학적으로 정의 된 분화에 집중 효과의 Wnt 억제 심장 중배엽 유도 (11)가 2 μM의 Wnt-C59을 사용한다.

또한, 글루코스 고갈 방법 분화 된 심근 심근 및 비 심근 8 사이에 존재하는 유동 구별 포도당 대사를 활용하는 추가의 정제 하였다. 이는 글루코스 고갈 방법의 효과를 d가 유의하는 것이 필수적이다ensity에 의존하는 (즉, 심근 세포의 높은 비율을 산출 차별화 큰 심근 생존을 달성 할 가능성이 높다). 그러나, 저 포도당 매체로의 전이는 또한 심근 대한 스트레스 조건이다. 그것은 포도당 기아 3 일 후에 다시 인슐린 매체와 일반 RPMI / B27에 셀을 변경하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 피더가없는 시스템은 성장하는 다 능성 줄기 세포를 피더 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에)상에서 성장되지 않았다 이용 하였다. 그러나, 종래의 심장 분화 프로토콜은 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포 (5)를 생성하기 위하여 피더 기반 시스템을 이용했다. 마찬가지로, 종래의 프로토콜은 또한 줄기 세포 유지를위한 mTeSR1 매체를 이용했지만, 여기에 이​​용 E8 매체 및 피더가없는 시스템은 단순함과 같은 소 혈청 알부민 및 마우스 배아 섬유 아세포와 같은 과잉의 이종 성분의 부족으로 우수하다.

현재,심근 세포 계통쪽으로 다 능성 줄기 세포의 분화는 대체로 견고하지만, 여전히 효율성의 관점에서 hiPSC 선간 가변성에서 겪고있다. 이것은 심장 차별화 필드에 큰 문제가 남아 있고 더 많은 연구가 필요합니다. 분화 효율 hiPSC 라인의 적절한 유지함으로써 개선, 특히 유지 보수 중에 hiPSC overconfluency 방지된다. hiPSCs의 균일 시드 단분자막 최상의 전체 분화를 야기하는 경향이 같은 추가적인 변화는 공정 동안 계대 세포 시딩에서 발생한다. 여기, 세포 배양시 세포 시드 마우스 유래, 마트 리겔 기반 ECMS 성공적으로 활용되었지만, 최종 전환은 이종-무료로 기판을 권장합니다. ECMS에 셀 시드에 관해서, 고르지 시드 종종 특정 아니라 내 심근 세포의 편재가 발생합니다. hiPSCs 고르지 시딩 경우, 예를 들어, 여섯 웰 플레이트에서 웰의 가장자리는 HIG를 야기 할 수있다잘의 중심보다 심근 그녀의 번호. 이러한 불균일 한 시드 조건 저효율 분화를 야기하고 비 심근 더 많은 수의, 예컨대 섬유 아세포 및 평활근 세포와 같은 중배엽 유도체를 수득 할 수있다. 또한 저효율 분화 (50 % 이하)를 훨씬 더 어렵게 언급 글루코스 부족 공정을 이용하여 정제하는 것을 발견했다. 장기간의 포도당 기아의 또 다른 부작용은 심근 세포 생존 능력의 손실 가능성이다. 심근 세포가 포도당의 부재 젖산을 대사 할 수 있지만, 우리는 낮은 혈당 환경이 스위치가 세포 스트레스 것을 알게. 세포는 치고 자발적으로 중지하고 포도당 기아가 권장 시간 이상 연장되는 경우 일부 셀 손실이 관찰 될 수있다. 포도당 박탈이 향상된 감도는 줄기 세포 유래 cardiomyocy의 잘 설립, 개발 기능, 및 전기 생리 미성숙을 반영 할 수있다TES 진정한 성인에 비해 13 심근.

요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 심근 정화 글루코스 고갈 방법 소분자 기반 hiPSC 단층 심장 미분법을 결합한다. 이 프로토콜은 고도로 정제 된 심근 세포의 재생 가능한 생성을 허용하고 심혈관 질환 모델링 및 약물 검사에 관련된 다양한 다운 스트림 분석을 용이하게한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

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References

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작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도
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Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

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