Härledning av renat Cardiomyocytes från Human inducerade pluripotenta stamceller Använda småmolekylära-module Differentiering och Efterföljande Glukos Svält

Abstract

Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller som härrör hjärtmuskelceller (hiPSC-CMS) har blivit en viktig cellkälla att åtgärda bristen på primära kardiomyocyter som grundforskning och translationell applikationer. För att skilja hiPSCs till hjärtmuskelceller har olika protokoll inklusive embryoid kropp (EB) -baserad differentiering och tillväxtfaktor induktion utvecklats. Emellertid, dessa protokoll är ineffektiva och mycket varierande i sin förmåga att generera renade kardiomyocyter. Nyligen genomfördes en liten molekyl-baserat protokoll utnyttjar modulering av Wnt / β-catenin signalering visat att främja hjärt differentiering med hög effektivitet. Med detta protokoll, var större än 50% -60% av differentierade celler kardiellt troponin-positiva kardiomyocyter konsekvent observerats. För att ytterligare öka cardiomyocyte renhet, var de differentierade cellerna utsattes för glukos svält för att specifikt eliminera icke-kardiomyocyter baserade på den metaboliska skillnadens mellan kardiomyocyter och icke-hjärtmuskelceller. Med hjälp av denna urvalsstrategi, konsekventa resultat vi en ökning som är större än 30% i förhållandet kardiomyocyter till icke-kardiomyocyter i en population av differentierade celler. Dessa högrenade hjärtmuskelceller bör öka tillförlitligheten av resultaten från human iPSC-baserade in vitro sjukdomsmodelleringsstudier och narkotikascreeninganalyser.

Introduction

Primära humana kardiomyocyter är svåra att erhålla på grund av kravet på invasiva kardiologiska biopsier, svårighet att dissociera till enstaka celler, och på grund av dålig långtidscellöverlevnad i kultur. Givet denna brist på primära humana hjärtmuskelceller, patientspecifika människa inducerade pluripotenta stamceller som härrör cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknik har betraktats som ett kraftfullt alternativ cardiomyocyte källa för grundforskning samt kliniska och translation applikationer såsom sjukdomsmodellering och narkotika upptäckt ^en. Tidiga insatser i differentiering pluripotenta stamceller till kardiomyocyter anställd differentieringsprotokoll som använder embryoidkroppar (EBS), men denna metod är ineffektiv i producerande cardiomyocytes eftersom det ofta mindre än 25% av cellerna i en EB är att slå cardiomyocytes ^2,3. Jämförelsevis, ett monolager baserad differentiering protokollet använder cytokinerna Activin A och BMP4 visade en högre verkningsgrad än EBS, menDetta protokoll är fortfarande relativt ineffektiv, kräver dyra tillväxtfaktorer, och bara fungerar i ett begränsat antal mänskliga pluripotenta stamcellslinjer ^4. Nyligen var en mycket effektiv, hiPSC monobaserad cardiomyocyte differentiering protokoll som utvecklats genom att modulera Wnt / β-catenin signalering ^5. Dessa hiPSC-CM uttrycka kardiellt troponin T och alfa actinin, två sarcomeric proteiner som är standard markörer för hjärtmuskelceller ^6. Protokollet beskriver här är en anpassning av denna lilla molekyl-baserade, matarcellfritt, monolager differentiering metod ^5,7. Vi kan få slå cardiomyocytes från hiPSCs efter 7-10 dagar (Figur 1). Men efter en cardiomyocyte differentiering vilket resulterade i 50% slå celler, immunfärgning konsekvent visar att det finns en population av icke-hjärtmuskelceller som är negativa för cardiomyocyte specifika markörer såsom hjärtspecifika troponin T och alfa-actinin. Till further rena hjärtmuskelceller och eliminera icke-kardiomyocyter var heterogena differentierade cellpopulationer utsatt till glukos svält genom att behandla dem med en extremt låg glukosodlingsmedium för flera dagar (Figur 2). Denna behandling selektivt eliminerar icke-kardiomyocyter grund av möjligheten för hjärtmuskelceller, men inte icke-cardiomyocytes, att metabolisera laktat som primär energikälla för att överleva i en låg glukos miljö ^8. Efter detta reningssteg, är en ökning av kvoten mellan kardiomyocyter till icke-hjärtmuskelceller 40% observerats, (figur 3, Figur 4) och dessa celler kan användas för nedströms genuttrycksanalys, sjukdomsmodellering, och drogscreeninganalyser.

Protocol

OBS: Vendor information för alla reagenser som används i detta protokoll har listade i tabell 1 och Materiallista. Alla lösningar och utrustning som kommer i kontakt med cellerna måste vara steril, och aseptisk teknik skall användas i enlighet med detta. Utför alla odlings inkubationer i en fuktad 37 ° C, 5% _CO2 inkubator om inte annat anges. I detta protokoll är alla skillnader utförs i 6-brunnars plattor, i vilka hiPSCs sås. Efter differentiering och rening, kan cellerna dissocieras och replated för användning nedströms.

1. Medium Framställning

1. För E8 mediet, en stamlösning för varje medium komponent (NaHCOs _3, L-askorbinsyra 2-fosfat, natriumselenit, transferrin, insulin, FGF2, TGFB1) och lagra lösningarna vid -20 ° C. Lägg lämplig mängd stamlösningar till flaskan DMEM / F12 och filtrera sterilisera. Lösningen concentration och reaktions setup för aktie komponenter och E8-medium återfinns i tabell 1.
2. För den extracellulära matrislösning, tina basalmembranmatrisen (vanligen levereras vid 10 mg / ml) vid 4 ° CO / N. Matrigel är vanligen används för pluripotenta stamcellkultur eftersom humana pluripotenta stamceller kan vidhäfta väl till detta material med användning av alfa-6-beta-1-integrin ^9. När tinats, gör 2,25 mg (250 pl) portioner på is med hjälp is kallt pipettspetsar och rör och lagra alikvoter vid -80 ° C.
   1. När förbeläggning plattor med ECM, tina och delprov den extracellulära matrisen lösningen (ECM) på is. Blanda av ECM: n och iskall DMEM / F12-medium i ett förhållande av 1: 200 på is. Förvaras svalt att förhindra för tidig ECM stel.
3. För RPMI / B27 utan insulin medium, tillsätt 10 ml B27 Minus Insulin i 500 ml RPMI-medium.
4. För RPMI / B27 (med insulin) medium, tillsätt 10 ml B27 supplement (med insulin) och 5 ml av pen-strep-antibiotika i 500 ml RPMI-medium.
5. För låg glukosmediet, tillsätt 10 ml B27 supplement och 5 ml Pen-strep antibiotika i 500 ml glukosfritt RPMI-medium.
6. För frysning / kryokonservering mediet, blanda fetalt bovint serum tillsammans med dimetylsulfoxid (DMSO) vid en 9: 1-förhållande. Den frysmedium kan lagras upp till 1 månad vid 4 ° C.
   OBS: Alla media bör filtreras och lagras i 4 ° C och användes inom 2 veckor om inte annat anges. Alla volymer reagens / lösning som används nedan är avsedda för en enda brunn i en 6-brunnsplatta, om inte annat anges.

2. Pre-beläggning 6-hålsplattor med ECM

1. Gör ECM genom att blanda basalmembranet matris (t.ex. Matrigel) med iskall DMEM / F12 media i förhållandet 1: 200, sedan tillämpa 2 ml nybakade ECM till varje brunn för en 6-brunnar. Varje brunn i en 6-brunnar erhåller cirka 90 mg ECM.
2. Inkubera ECMS belagda plattorna under 1 h vid 37 ° C. Omedelbart före plätering celler, aspirera DMEM / F12 lösning från varje brunn. Plattorna kommer sedan att vara redo att ta emot celler.

3. Upptining de frysta hiPSCs

OBS: Följ noga denna procedur eftersom det kan leda till optimal odling och nedströms differentiering av hiPSCs i hiPSC-CM efter frys / tö cykeln.

1. Tina en ampull av hiPSCs för varje brunn i en 6-brunnsplatta. Förbered en 15 ml koniska rör med 9 ml kall E8 medium med ROCK-hämmare (10 ^ M) för varje flaska. ROCK-hämmare förbättrar hiPSCs överlevnad efter frysförvaring ^10. Förvara injektionsflaskorna i 37 ° C vattenbad för att tina cellerna tills en ca 5 mm is diameter kristall är kvar.
2. Spraya utsidan av rören med 70% etanol. Torka rören med mjukpapper innan du flyttar dem till den sterila laminärt huven.
3. Överför cellerna i den förberedda koniska rör. Skölj than flaskan en gång med 500 | il av E8-medium och överföra mediet innehållande de upptinade cellerna till samma koniska rör. Centrifugera vid RT under 4 min vid 200 x g.
4. Aspirera supernatanten efter centrifugering och försiktigt resuspendera cellpelleten med 2 ml av E8-medium med ROCK-inhibitor (10 | iM). Överför de resuspenderade cellerna till en brunn i en 6-brunnsplatta förbelagd med ECM.
5. Byt medium med E8 medium utan ROCK-hämmare efter 24 h av odling. Celler bör ha anslutit sig vid det här laget.

4. Passaging av hiPSCs

1. Typiskt passage hiPSCs Efter att ha nått 75% -80% konfluens i en 6-brunnsplatta. Aspirera odlingsmediet. Snabbt tvätta brunnarna med 1 ml steril, RT PBS. Aspirera PBS.
   1. Lägg 500 pl av 0,5 mM EDTA eller 1x celllösgörlösningen (t.ex., Accutase) och inkubera under 1-7 min vid rumstemperatur. Lämplig tid för EDTA inkubation varierar med hiPSC linjen. Räkna med att se synliga curling or förtjockning av kolonier runt kanterna, är redo att tas bort eftersom detta indikerar att EDTA eller cell lossnar lösning.
2. Aspirera EDTA eller cell lossnar lösningen. Tillsätt 1 ml E8-medium kompletterat med 10 | iM ROCK-inhibitor. Förskjutning hiPSC kolonier i brunnen genom att upprepade gånger pipettera upp och ned och spraya kolonier med en P1000 pipett. Kolonier bör delas in i 5-10 cellklumpar efter färdigställande.
3. Överför de kolonier som är suspenderade i 1 ml E8 medium med ROCK-inhibitor i en 15 ml koniska rör.
4. Sönder stora cellklumpar i små klumpar i E8-medium. Lägg en lämplig volym av E8 media med hämmare till cellsuspensionen att späda cellerna. Medievolymen att lägga för utspädning beror på celltäthet och antalet brunnar som ska seedas. Helst bör ett enda, 80% sammanflytande väl av hiPSCs spädas 1:12.
   1. Lägg 11 ml E8 medium med ROCK hämmare till de befintliga 1 ml cell lösning i ovannämnda 15 ml koniskt rör för att få en 1:12 utspädning.
5. Ytterligare mal sönder cellklumpar i små cellfragment (ca 50-200 celler i varje fragment är bäst). Undvik över finfördelning eftersom detta minskar cellöverlevnad.
6. Sug ECM från pre-belagda plattor och tillsätt 2 ml resuspenderade celler i varje brunn. Cirka 100.000 celler per brunn i en 6-brunnars platta är idealiskt. Sikta att dispensera cellerna jämnt runt brunnen för att undvika anhopning av celler i mitten av brunnen.
7. Efter 24 h av odling, byt medium med E8 medium utan ROCK-hämmare. Ändra odlingsmediet varje 24 h tills cellerna blir 80% konfluenta. Därefter cellerna är redo för passage igen. Det brukar ta 3-6 dagar mellan passager för att nå 80% sammanflytning.

5. Frys hiPSCs

OBS: Följ noga denna procedur eftersom det kan leda till optimal odling och nedströms differentiering av höftenKaster in hiPSC-CM efter frys / tö cykeln.

1. Märk kryogena rör med cellinje namn, celltyp, passagenummer, och frysdatum. Som en allmän riktlinje, använd en flaska för varje brunn i en 6-brunnar. Förbered en 15 ml koniskt rör fyllt med 9 ml E8-medium med ROCK-hämmare (10 M). Förbered frysmedium med 90% FBS och 10% DMSO, och hålla temperatur på 4 ° C tills den ska användas.
2. Aspirera odlingsmedia, tillsätt 500 pl 0,5 mM EDTA eller 1x cell lossnar lösning och inkubera 2-7 min vid RT. Varaktigheten av EDTA eller cell lossnar lösning exponeringen varierar från cellinje till cellinje.
3. Aspirera EDTA eller celllösgörlösning. Tillsätt 1 ml E8 medium.
4. Förskjutning hiPSC kolonier i brunnen genom att pipettera upp och ned och sprutning kolonier med en P1000 pipett. Kolonier bör inte delas upp i mindre än 100 cellklumpar. Överför suspenderade cellerna till den förberedda koniska rör som innehåller E8. Centrifugera vid RT för 4 min vid 200 x g.
5. Aspirera supernatanten och tillsätt 500 | il kall frysmediet till pelleten. Resuspendera pelleten genom att pipettera 1-2 gånger. Cellöverlevnad är förbättrad genom att hålla cellerna i stora klumpar.
6. Överför resuspenderade cellerna i ett märkt kryogen rör. Snabbt flytta flaskorna i en frysning behållare innehållande isopropanol, vilket kommer att möjliggöra en gradvis avkylning. Förvara behållaren med cellerna vid -80 ° C under 24 h, sedan överföra cellerna till flytande kväve för långtidslagring.

6. Hjärtat Differentiering av Human iPSC

OBS: Alla medier bör vara minst vid RT när de läggs.

1. Efter dissociation med EDTA eller 1x cell lossnar lösning, utsäde cirka 100.000 mänskliga iPSCs på ECM belagda 6-brunnars odlingsplattor för differentiering (samma steg som cellaging förfaranden). När cellerna når 85% konfluens, ändra på medellång till RPMI / B27 utan insulin medium med 6iM GSK3-beta-hämmare CHIR99021 (CHIR) och bibehålla under 48 timmar.
2. Efter 48 timmar, byt CHIR-innehållande odlingsmedium med RPMI / B27 utan insulin medium och lämna ensam för 24 timmar (till dag 3).
3. På dag 3, ändra media till RPMI / B27 utan insulin med 5 iM Wnt-hämmaren IWR1 och underhålla under 48 timmar (till dag 5).
   OBS: Wnt inhibering kan också försökas med användning av andra små molekyler, såsom beskrivs i tidigare studier ^11. IWR1 valdes framför andra små molekyler Wnt-hämmare på grund av den ökade utbudet där det har visat sig vara effektiva i att hämma Wnt signalering ^11.
4. Vid dag 5, ändra mediet tillbaka till RPMI / B27 utan insulin medium och låt stå i 48 timmar (till dag 7).
5. Vid dag 7, byt mediet med RPMI / B27-medium (med insulin) och byt medium var 3 dagar därefter med samma medium. Spontan misshandeln av hjärtmuskelceller bör först vara synlig vid ungefär dag 8 till dag10.

7. Rening av mänskliga Cardiomyocytes genom Glukos Svält

1. Vid dag 10 efter differentiering, ändra mediet i varje brunn i 6-brunnars platta till 2 ml med låg glukosmedium och upprätthålla cellerna i detta medium under 3 dagar (till dag 13).
2. Vid dag 13, återvänder celler till RPMI / B27-medium (med insulin).
3. Eventuellt förnyad utbredning cardiomyocytes före den andra omgången av glukos svält för att hjälpa till att lossa icke-kardiomyocyter från odlingsplattan, vilket möjliggör enklare dissociation av icke-hjärtmuskelceller under glukos svält.
   1. Vid dag 13, aspirera mediet, tvätta en gång med PBS och dissociera cellerna i enstaka celler med användning av 500 | il av cell disassociation enzym under 5 minuter vid 37 ° C. Specifikt efter 5 min av enzymbehandling, använd en 1.000 l pipett att manuellt dissociera hjärtmuskelceller från 6-brunnar genom att upprepade gånger dra upp cell disassociation enzymet och spraya den mot cardiomyocyte monolager. Upp till 30 pipetter upprepningar kan krävas för att dissociera kardiomyocyterna i enskilda celler.
   2. Efter det att cellerna dissocieras och är i encelliga formen, samla alla celler i ett 15 ml koniskt rör fylldes med 5 ml RPMI / B27-medium med insulin för att späda ut cellen disassociation enzymet och centrifugera i 4 min vid 200 x g. Sug och kassera supernatanten.
   3. Återuppslamma cellerna med 2 ml RPMI / B27 medium och platta till en ny ECM-belagda 6-brunnar. Vanligtvis högre confluency av kardiomyocyter hjälper till med cellöverlevnad under omstryka. Sikta på att förnyad utbredning 2 miljoner celler per ny 6-bra maträtt för optimal överlevnad under omstryka.
4. Vid dag 14, ändra mediet tillbaka till 2 ml låg glukosmedium för en andra glukos deprivation cykel. Kultur cellerna i denna låga glukostillstånd för ytterligare 3 dagar. De flesta av de icke-cardiomyocytes kommer att dö i denna låg glukos kultur skick.
5. Vid dag 17, ändra på medellång till 2 ml RPMI / B27 medium med insulin. De återstående cellerna blir högrenade kardiomyocyter. Dessa kardiomyocyter kan användas för genuttrycksanalys, drogscreening, metabolisk analys och olika andra nedströms analyser.

Representative Results

De morfologiska förändringar under hiPSC differentiering.

Den hiPSC odlas i matarfria plåtar växte som platta, tvådimensionella kolonier. På att nå omkring 85% sammanflytades hiPSCs behandlades med 6 iM CHIR för differentiering (Figur 1A). Betydande mängder av celldöd, ett normalt och vanligt fenomen, observerades efter 24 h av CHIR behandling. Efter två dagar av CHIR behandling, de hiPSCs fortsatte att differentiera mot en mesodermalt öde. I jämförelse med celler i hiPSC kolonier, cellstorlek för dessa dag 2 celler ökade. Cellnummer ökade också genom celldelning (Figur 1B). Vid dag 5 ades mesodermala cellerna riktade mot hjärt härstamning (hjärt mesoderm). Vid denna tid, börjar cellerna växa samman och bildar karakteristiska, grenlika strukturer (Figur 1C). Vid dag 10, var grenlika strukturer mycket uttalad, och kardiomyocyter stjärnated spontant slående (Figur 1D). Terminalt differentierade cardiomyocytes kommer inte föröka bortom denna punkt. En tidslinje av differentieringsprotokollet visas i figur 2.

Immunfärgning och flödescytometri resultaten visade kardiomyocyter renades med glukos svält.

Efter 10 dagar av differentiering, är mer än 50% av cellområden slå. Men ibland slår cellblad är också samsas med icke-hjärtmuskelceller. För att undersöka cardiomyocyte renhet, var celler med immunfärgning mot cardiomyocyte markör cardiac troponin-T (cTnT) karakteriseras att finna att de flesta celler var cTnT positiva. Emellertid, i ett orenat population av differentierade celler, ett antal celler saknade också uttryck av cTnT, vilket antyder närvaron av icke-kardiomyocyter som denna differentierade population vid dag 13 (figur 3A). Emellertid, med glukos svält,nästan alla återstående cellerna var cTnT positiva vid dag 13 (figur 3B), vilket indikerar en framgångsrik rening av hjärtmuskelceller efter glukos svält. Dessa data bekräftas ytterligare med hjälp av flödescytometri analys. En population av differentierade celler vid dag 13 efter differentiering innehöll cirka 50% TNNT2 + celler, vilka inte glukos svalt (Figur 4A). En parallell differentiering fördes också, men med en 3 dagars glukosbrist börjar på dag 10 efter differentiering. I motsats till den unstarved differentiering ledde glukos deprivation till en renad population innehållande 90% TNNT2 + celler vid dag 13 (Figur 4B).

Figur 1. De sekventiella morfologiska förändringar under hiPSC differentiering mot hjärt härstamning. (A) diverse hiPSCsvid dag 0 uppvisar typiska kolonimorfologi och nådde cirka 85% sammanflytning. (B) På dag 2, celler efter behandling med CHIR två dagar nådde 100% konfluens och gick in i mesodermal härstamning. (C) På dag 5, cellerna efter behandling med IWR1 för två dagar in i hjärt mesoderm steget. Vissa celler började smälta och bilda karakteristiska grenliknande morfologier (indikeras med pilar). (D) Dag 7-10, grenlika strukturer är mycket uppenbart, och hjärtmuskelceller börjar spontant slående. Bar = 200 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Timeline av hiPSC-CM differentiering protokoll och efterföljande glukos svält process. Seger cardiomyocytes a re vanligtvis först observeras vid ungefär dagar 7-10. Två omgångar av glukos svält kommer att resultera i en renad population av hjärtmuskelceller efter dag 17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Immunofluorescens avslöjar rening av hjärtmuskelceller efter glukos svält. (A) orenad celler efter 13 dagar av differentiering färgades med Cardiac Troponin T (cTnT). De flesta celler har differentieras till hjärtmuskelceller och var cTnT positiva, men ett antal icke-kardiell, cTnT negativa cellerna är också närvarande. (B) I kontrast, efter en tre dagars glukos svält med början vid dag 10, nästan alla av de överlevande cellerna var cTnT positiva vid dag 13. Skalstreck = 200 | im.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Flödes avslöjar cytometry rening av hjärtmuskelceller efter glukos svält. (A) Efter 13 dagar av hjärt differentiering utan glukos svält, en population av celler uppvisade ungefär 50% TNNT2 + kardiomyocyter. Rött indikerar den differentierade cellpopulationen och blått indikerar odifferentierade hiPSCs som en negativ kontroll. (B) Efter 10 dagar av hjärt differentiering och följt av 3 dagars glukos svält, var en population av celler från samma parti differentier renas för att innehålla 90% TNNT2 + hjärtmuskelceller. Klicka här för attvisa en större version av denna siffra.

Kompositionerna för E8-medium
E8	Volym: 1 L	Företag	Katalognummer
DMEM / F12 med glutamin och HEPES	1000 ml	Invitrogen	11330-032
NaHCOs 3 (7,5%, 75 mg / ml)	7,24 ml	Invitrogen	25080-094
L-askorbinsyra 2-fosfat (64 mg / ml)	1 ml	Sigma	A8960
natriumselenit (70 | ig / ml)	200 | il	Sigma	S5261
transferrin (50 mg / ml)	214 | il	Sigma	T3705
insulin (4 mg / ml) 5 ml	Invitrogen	12585-014
FGF2 (200 ng / l)	500 | il	Peprotech	100-18B
TGFB1 (100 ng / ul)	20 | il	Peprotech	100-21

Stamlösningarna för E8 kompositioner
L-askorbinsyra-2-fosfat (64 mg / ml)	3,2 g i 50 ml ultrarent vatten, lagra 500 | il alikvoter vid -20 ° C
Transferrin (50 mg / ml)	500 mg i 10 ml ultrarent vatten, lagra 107 | il alikvoter vid -20 ° C
Natrium selenit (70 | ig / ml)	35 mg natriumselenit i 500 ml ultrarent vatten, lagra 100 | il alikvoter vid -20 ° C
FGF2 (200 ng / l)	1 mg i 5 ml kallt D-PBS, lagra 250 | il alikvoter vid -20 ° C
TGFB1 (100 ng / ul)	100 | ig i 1 ml kall 10 mM citronsyra, pH 3, lagra 10 | il alikvoter vid -20 ° C

Tabell 1. Sammansättning av E8 Medium.

Discussion

Skaffa en stor mängd högrenade hiPSC-derived kardiomyocyter är avgörande för grundläggande hjärtforskning samt kliniska och translationapplikationer. Hjärtdifferentieringsprotokoll har genomgått enorma förbättringar under de senaste åren, övergår från embryoidkroppar kroppsbaserade metoder som utnyttjar kardiogen tillväxtfaktorer ^2, till matrissandwichmetoder ^12, och slutligen till små molekyl-modulerad och monolager-baserade metoder ^5. Av de ovannämnda protokollen, det protokoll som beskrivs här visas den högsta och mest reproducerbara hjärt differentiering effektivitet för olika hiPSC cellinjer genom att modulera Wnt / β-catenin signalering med hjälp av små molekyler Chir och IWR ^5,7. Specifikt var odifferentierade hiPSCs inducerade att genomgå mesodermal differentiering med GSK3-beta-hämmare CHIR och efterföljande hjärt differentiering med signalering hämmare IWR1 Wnt. Dessa sekventiella stegen attWnt signalering modulering, med hjälp av insulin utarmning under hjärt härstamning induktionsfasen, ledde till mycket effektiv hjärt differentiering. CHIR är en vanlig liten molekyl GSK3-beta-hämmare som används för mesodermal induktion, men andra små molekyler för GSK3-beta-hämning har testats i cardiomyocyte differentieringsprotokoll ^11. Flera alternativ används också för den efterföljande småmolekylära Wnt-hämmare. Till exempel, en nyligen publicerad fokus på kemiskt definierade differentiering av pluripotenta stamceller till hjärtmuskelceller använder 2 iM Wnt-C59 för effektiv Wnt-hämning och hjärt mesoderm induktion ^11.

Dessutom, de differentierade kardiomyocyter med en glukos svält metod renades ytterligare, som drar fördel av den distinkta glukos metaboliska flödes existerande mellan kardiomyocyter och icke-kardiomyocyter ^8. Det är viktigt att notera att effektiviteten i glukos svält metoden är density beroende (dvs, differentieringar som gav högre halter av hjärtmuskelceller är mer benägna att uppnå större cardiomyocyte överlevnad). Emellertid är övergången till den låga glukosmedium även ett stresstillstånd för kardiomyocyter. Det är viktigt att ändra cellerna tillbaka till den vanliga RPMI / B27 med insulin medium efter 3 dagar av glukos svält. I detta protokoll, var en matarfria tillväxtsystem utnyttjas, där pluripotenta stamceller inte odlades på matar mus embryonala fibroblaster (MEF). Dock har tidigare hjärtdifferentieringsprotokoll utnyttjade feeder-baserade system för att producera hjärtmuskelceller från pluripotenta stamceller ^fem. Likaså har tidigare protokoll används också mTeSR1 medium för stamcells underhåll, men E8 media och matare fritt system utnyttjas här är överlägsen på grund av dess enkelhet och brist på överskott xenogena komponenter såsom bovinserumalbumin och mus embryonala fibroblaster.

För närvarande,pluripotenta stamceller differentiering mot cardiomyocyte härstamningar är till stor del robust, men ändå lider hiPSC line-to-line variation i fråga om effektivitet. Detta är fortfarande en viktig fråga i hjärt differentiering område och kommer att kräva ytterligare studier. Differentiereffektiviteten förbättras genom korrekt underhåll av hiPSC linjer, och i synnerhet, förebygga overconfluency under hiPSC underhåll. Ytterligare variation uppstår från cell sådd under aging processen, som ett jämnt seedad monolager av hiPSCs tenderar att ge upphov till de bästa övergripande differentieringar. Här, en mushärledda, Matrigel-baserade ECM för cellsådd under cellodling framgångsrikt utnyttjats, men ett eventuellt övergång till xeno-fria substrat rekommenderas. I fråga om att cellsådd på ECM, resulterar ojämn sådd ofta i ojämn fördelning av hjärtmuskelceller inom en viss väl. Till exempel, om hiPSCs ympas ojämnt, kan kanterna av en brunn i en sex-brunnars platta ge upphov till highennes antalet hjärtmuskelceller än mitten av brunnen. Dessa ojämna seeding förhållanden kan ge upphov till lågeffektiva indelningar och ett större antal icke-cardiomyocyte, mesodermala derivat såsom fibroblaster och glatta muskelceller. Vi har också observerat att låg effektivitets indelningar (under 50%) är mycket svårare att rena med hjälp av glukos deprivation process som nämns här. En annan bieffekt av långsiktig glukos svält är en potentiell förlust i cardiomyocyte livskraft. Även om cardiomyocytes kan metabolisera laktat i frånvaro av glukos, finner vi att denna övergång till en låg glukos miljö är stressande för cellerna. Celler kan sluta spontant slående, och några cellförlust kan observeras om glukos svält förlängs utöver den rekommenderade tiden. Denna förbättrade känslighet för glukos deprivation kan vara reflekterande av väletablerade utvecklings, funktionella, och elektrofysiologiska omognad stamcells härrörande cardiomyocytes i jämförelse med verklig vuxna cardiomyocytes ^13.

Sammanfattningsvis protokollet beskrivs här kombinerar den lilla molekylen baserade, hiPSC monolager hjärt differentiering metod med en cardiomyocyte renande glukos svält metod. Detta protokoll möjliggör reproducerbar generationen av högt renade hjärtmuskelceller och bör underlätta olika nedströms analyser som är relevanta för hjärt modellering sjukdomen och drogscreening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel (9-12 mg/ml)	BD Biosciences	354277
RPMI media	Invitrogen	11835055
Glucose free RPMI media	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (w/ insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-strep antibiotic	Invitrogen	15140122
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Cell lifter	Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (NUNC tubes)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011