Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

doi: 10.3791/52628 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) temel araştırma ve translasyonel uygulamaları için kullanılabilir birincil kardiyomiyositlerinin eksikliği gidermek için önemli bir hücre kaynağı haline gelmiştir. Kardiyomiyositlere hiPSCs ayırt etmek için, embriyoit gövdenin (EB) tabanlı türev ve büyüme faktörü indüksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokoller verimsiz ve saflaştırılmış kardiyomiyositlerde oluşturmak için yetenekleri açısından oldukça değişkendir. Son zamanlarda, Wnt / β-katenin sinyal, küçük bir molekül tabanlı bir protokol kullanılarak modülasyonu, yüksek verimlilik ile kardiyak farklılaşmasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu protokol ile, farklılaşmış hücrelerin% 50'den daha fazla -60% kardiyak troponin pozitif kardiyomiyositler sürekli gözlendi idi. Ayrıca kardiyomiyosit saflığını arttırmak için, farklılaşmış hücre spesifik, metabolik bir fark temelinde-kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak için açlık glikoz tabi tutuldukardiyomiyositler ve non-kardiyomiyositlere arasındaki s. Bu seçim strateji kullanarak, sürekli olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda olmayan kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 30'dan fazla bir artış elde edilmiştir. Bu son derece saflaştırılmış kardiyomiyositlerde nitro hastalık modelleme çalışmaları ve ilaç tarama tahlillerinde İnsan iPSC tabanlı sonuçların güvenilirliğini geliştirmek gerekir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Primer insan kardiyomiyositler nedeniyle invaziv kardiyak biyopsiler, çünkü kültür yoksul uzun vadeli hücre canlılığı tek hücrelere dissociating zorluk için gereğinin elde etmek zordur. Birincil insan kardiyomiyositler, hastaya özgü insan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit bu eksikliği göz önüne alındığında (hiPSC-CM) teknolojisi temel araştırma için güçlü bir alternatif kardiyomiyosit kaynağı yanı sıra hastalık modelleme ve ilaç olarak klinik ve translasyonel uygulamaları olarak kabul edilmiştir keşif 1. Kardiyomiyositlere pluripotent kök hücrelerin ayırt Erken çabaları embriyoid organları (EBS) ile farklılaşma protokolleri istihdam, ama bir EB hücrelerin genellikle az 25 den% kardiyomiyositlerde 2,3 yenerek çünkü bu yöntem üreten kardiyomiyositlerde verimsizdir. Nispeten, A ve BMP4 aktivin sitokinler kullanarak tek tabaka-tabanlı farklılaşma protokolü EBS daha yüksek verimlilik görüntülenen, ancakBu protokol, hala nispeten verimsizdir insan pluripotent kök hücre hatları 4, sınırlı sayıda pahalı büyüme faktörleri ve tek işlevleri gerektirir. Son zamanlarda, bir yüksek verimli, hiPSC tek tabaka-tabanlı kardiyomiyosit farklılaşma protokolü Wnt / β-katenin sinyal 5 modüle tarafından geliştirilmiştir. Bunlar hiPSC-CM'ler kardiyak troponin T ve alfa aktinin, kardiyomiyositlerinin 6 standart belirteçleri iki sarkomerik proteinleri ifade eder. protokol burada açıklamak bu küçük molekül tabanlı, besleyici, hücre içermeyen, tek tabaka farklılaşma yöntemi 5,7 bir uyarlamasıdır. Biz 7-10 gün (Şekil 1) sonra hiPSCs gelen kardiyomiyositlerde yenerek elde edebiliyoruz. Ancak,% 50 hücreleri yenerek sonuçlanan bir kardiyomiyosit farklılaşması takip, sürekli immün, kalp-özel troponin T ve alfa-aktinin olarak kardiyomiyosit-spesifik belirteçler için negatif olmayan kardiyomiyositlerin bir nüfusun varlığını göstermektedir. Fu içinrther kardiyomiyositlerde saflaştırılması olmayan kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak, heterojen farklılaşmış hücre popülasyonları birden fazla gün boyunca son derece düşük bir glikoz kültür ortamı (Şekil 2) ile muamele etmek suretiyle açlık glikoz tabi tutuldu. Bu tedavi seçici düşük glukoz ortamında 8 hayatta kalmak için birincil enerji kaynağı olarak laktat metabolize kardiyomiyositlerin yeteneği nedeniyle sigara kardiyomiyositlerde, ancak sigara kardiyomiyositler, ortadan kaldırır. Bu saflaştırma adımından sonra, sigara kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 40'lık bir artış (Şekil 3, Şekil 4), görülmektedir ve bu hücreler, aşağı doğru gen ifade analizi, hastalık modelleme ve ilaç tarama deneyleri için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler için Satıcı bilgileri Tablo 1'de listelenen olmuştur ve Malzeme Listesi. Hücrelerle temas Bütün çözeltiler ve ekipmanlar, steril olmalı ve aseptik teknik buna göre kullanılmalıdır. Aksi belirtilmediği sürece, bir nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka tüm kültür inkubasyon yapın. Bu protokol, her farklılıklar hangi hiPSCs tohumlanmış olan, 6 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Farklılaşması ve arıtılmasından sonra hücreleri kesilerek edilebilir ve aşağı doğru kullanımı için kaplandı.

1. Orta Hazırlık

  1. E8 ortam için, her bir orta bileşeni için bir stok çözelti (NaHCO 3, L-askorbik asit 2-fosfat, sodyum selenit, transferin, insülin, FGF2, TGFb1) bu -20 ° C'de çözüm saklayın. DMEM / F12 şişesine stok çözümleri uygun miktarda ekleyin ve sterilize etmek filtre. Çözelti ConcentrHisse senedi bileşenleri ve E8 orta tirme ve reaksiyon kurulum Tablo 1'de bulunabilir.
  2. Hücre-dışı matris solüsyon için, 4 ° CO / H de (genellikle 10 mg / ml'de verilir) taban membran matrisi eritin. Insan pluripotent kök hücreleri, alfa-6-p-1 integrini 9 kullanarak bu malzemeye de bağlı olabilir, çünkü Matrigel yaygın pluripotent kök hücre kültürü için kullanılmıştır. Bir kez buz soğukluğunda pipet uçları ve tüpler buz üzerinde 2.25 mg (250 | il) alikotları sağlamak ve -80 ° C'de alikot saklamak çözülmüş.
    1. ECM'li plakaları ön kaplanması yaparken, çözülme ve buz üzerinde hücre dışı matriks solüsyonu (ECMS) bölmeyin. 1 oranında ECM ve buz soğukluğunda, DMEM / F12 ortamı karıştırma: 200 buz üzerinde. Erken ECMS katılaşma önlemek için serin tutun.
  3. Insülin ortamı, RPMI / B27 için, RPMI ortamı, 500 ml B27 eksi İnsülin 10 mi ekleyin.
  4. Orta (insülin) ile RPMI / B27 için, Insuli ile (B27 Supplement 10 ml ekleyinn) ve RPMI ortamı 500 ml Pen-strep antibiyotik 5 mi.
  5. Düşük glukoz ortamı için, B27 eki 10 ml ve glikoz bulunmayan RPMI ortamı 500 ml Pen-strep antibiyotik 5 ml ilave ediniz.
  6. : 1 oranında dondurma / dondurarak saklama ortamı, bir 9 dimetilsülfoksit (DMSO) ile birlikte fetal sığır serumu karıştırın. dondurma ortamı 4 ° C'de 1 aya kadar saklanabilir.
    Not: Tüm ortamlar filtrelenmiş ve depolanmış 4 ° C ve, aksi belirtilmediği sürece, 2 hafta içerisinde kullanılmalıdır. Aksi belirtilmediği sürece aşağıda kullanılan tüm reaktif / çözeltisi hacimleri, 6-çukurlu plaka içindeki tek bir oyuk için tasarlanmıştır.

2. ECM'li 6 oyuklu levhalar Ön kaplama

  1. Daha sonra 6-delikli plaka için her bir oyuğa taze ECMlerin 2 ml uygulanır 200: 1 lik bir oranda buz soğukluğunda DMEM / F12 ortamında (örneğin, Matrigel) bazal membran matrisi karıştırılmasıyla ECMler sağlayın. Oyuk, 6 oyuklu plaka içerisinde her bir yaklaşık olarak 90 mg ECMler alacaktır.
  2. ECM inkübeS, 37 ° C'de 1 saat boyunca plakaları kaplama. Her çukurdan, aspirat DMEM / F12 çözeltisi hücreleri kaplama hemen önce. Plakalar daha sonra hücrelerin almaya hazır olacaktır.

3. Çözülme Dondurulmuş hiPSCs

NOT: optimal kültürleme ve donma / çözülme döngüsü aşağıdaki hiPSC-CMS içine hiPSCs mansap farklılaşmasına neden olabilir yakından bu prosedürü izleyin.

  1. 6 gözlü bir plakanın her bir için hiPSCs bir şişe çözülme. Her bir şişeye, kaya inhibitörü (10 uM) ile, soğuk E8 ortamın 9 ml, 15 ml lik konik bir tüp hazırlanır. ROCK inhibitörü kriyopreservasyona 10 aşağıdaki hiPSCs sağkalım geliştirir. Yaklaşık 5 mm çapında buz kristali kalana kadar hücreleri çözülme için 37 ° C su banyosu içinde şişeleri tutun.
  2. % 70 etanol ile şişelerin dış püskürtün. Steril laminer kaput onları geçmeden önce kağıt mendil ile silin şişeleri.
  3. Hazırlanan konik tüp içine hücreleri aktarın. T durulayınO E8 ortamının 500 ul ile bir kez şişe ve aynı konik tüp çözülmüş hücreleri içeren ortam transfer. 200 x g'de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje.
  4. Santrifüj işleminden sonra süpernatan aspire yavaşça ROCK inhibitörü (10 uM) ile E8 ortamının 2 ml hücre pelletini. 6 yuvalı plaka ECMler ile önceden kaplanmış bir oyuğuna yeniden süspansiyon haline hücreleri aktarın.
  5. Kültürleme 24 saat sonra ROCK inhibitörü olmadan E8 ortamı ile orta değiştirin. Hücreler bu zamana kadar yapıştırılır olmalıdır.

HiPSCs 4. pasaj

  1. Tipik olarak, bir 6-yuvalı plaka içinde% 75 -80% Ortak akışkanlığa eriştikten sonra geçit hiPSCs. Kültür ortamı aspire. Hızlı bir şekilde, steril 1 ml RT PBS ile yıkayın. Aspire PBS.
    1. 500 0.5 mM EDTA ul ya da 1 x hücre ayırma çözeltisi (ör Accutase) ilave edilir ve oda sıcaklığında 1-7 dakika inkübe edilir. EDTA inkübasyon için uygun zaman hiPSC hattı ile değişir. Görünür kıvırma o görmek için bekliyoruzkenarlarda kolonilerin r kalınlaşma, bu o EDTA veya hücre dekolmanı çözümü gösterecektir olarak kaldırılacak hazırdır.
  2. EDTA veya hücre dekolmanı çözümü aspire. 10 uM KAYA inhibitörü ile takviye edilmiş E8 ortamın 1 ml ilave edilir. Tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme ve P1000 pipet ile koloniler kapalı püskürtülerek kuyudaki hiPSC kolonileri yerinden. Koloniler tamamlanmasından sonra 5-10 hücre kümeleri içine kırılmış olmalıdır.
  3. 15 ml konik bir tüp içine ROCK inhibitörü ile E8 1 ml ortam maddesi içinde süspansiyon haline getirilmekte koloniler aktarın.
  4. E8 orta küçük kümeleri içine büyük hücre kümeleri bozar. Hücreleri sulandırmak için hücre süspansiyonu önleyicisi ile E8 ortamın uygun bir hacim. seyreltme için eklemek için ortam hacmi hücre yoğunluğuna bağlıdır ve kuyuların sayısının numaralı seribaşı olan. İdeal olarak, hiPSCs tek,% 80 konfluent de 1:12 seyreltilmelidir.
    1. Ce mevcut 1 ml ROCK inhibitörü ile 11 ml E8 orta ekledaha önce zikredilen 15 ml konik bir tüp içinde ll çözelti 1:12 seyreltme elde edildi.
  5. Ayrıca (Her fragmanı 50-200 hücreleri iyi civarında) küçük hücreli parçalara hücre kümeleri çiğnemek. Bu hücre sağkalım azaltır kaçının aşırı triturating.
  6. Aspire önceden kaplanmış plakalar gelen ECMS ve her kuyuya yeniden süspanse hücrelerin 2 ml ekleyin. 6-çukurlu plaka içinde çukur başına yaklaşık 100,000 hücre idealdir. Iyi merkezindeki hücrelerin kümeleme önlemek için kuyu etrafına eşit hücreleri dağıtmak hedefliyoruz.
  7. Kültür, 24 saat sonra, ROCK inhibitör olmadan E8 ortamı ile orta yerine. Hücreler% 80 konfluent hale gelene kadar kültür ortamı, her 24 saat değiştirin. Sonra, hücreler yine geçit hazırız. Genellikle% 80 konfluent ulaşmak için ayrılmış geçitlerin arasında yer 3-6 gün sürer.

5. Donma hiPSCs

NOT: optimal kültürleme ve kalça mansap farklılaşmasına neden olabilir yakından bu prosedürü takipHiPSC-CMS içine SC'ler donma / çözülme döngüsü aşağıdaki.

  1. Hücre hattı adı, hücre tipi, geçit numarası ve donma tarih kriyojenik tüpler etiketleyin. Genel bir kural olarak, bir 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna için, bir şişe kullanılır. KAYA inhibitörü (10 uM) ile E8 ortamın 9 ml ile dolu bir 15 ml'lik konik bir tüp hazırlanır. % 90 FBS ve% 10 DMSO içeren ortam dondurma hazırlamak ve kullanmak için hazır olana kadar 4 ° C 'de orta tutun.
  2. Kültür ortamı aspire 500 0.5 mM EDTA ul ya da 1 x hücre ayırma çözeltisi eklenmekte ve oda sıcaklığında 2-7 dakika inkübe edilir. EDTA ya da hücre ayırma çözeltisi maruz kalma süresi hücre çizgisi için hücre hattından değişir.
  3. Aspire EDTA veya hücre dekolmanı çözümü. E8 ortamın 1 ml ilave edilir.
  4. Yukarı ve aşağı pipetleme ve P1000 pipet ile koloniler kapalı püskürtülerek kuyudaki hiPSC kolonileri yerinden. Koloniler 100'den küçük hücre kümeleri kırık olmamalıdır. E8 içeren hazırlanmış konik tüp askıya hücreleri aktarın. Ar SantrifüjT 200 x g'de 4 dakika karıştırıldı.
  5. Süpernatant aspire ve pelet soğuk dondurma orta 500 ul ekleyin. 1-2 kez pipetleme pelletini. Hücre canlılığı, iri topaklar hücreleri tutarak artırıldı.
  6. Etiketlenmiş bir kriyojenik tüp içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın. Hızlı bir şekilde yavaş yavaş soğutulması için sağlayacak bir dondurma konteyneri içeren izopropanol içine şişeleri hareket eder. Daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen hücreleri transferi, 24 saat süre ile, -80 ° C'de hücrelerle tutun.

İnsan IPSC 6. Kardiyak Farklılaşma

NOT: ilave bütün ortam oda sıcaklığında en az olmalıdır.

  1. EDTA veya 1x hücre ayırma çözeltisi ile ayrıldıktan sonra, yaklaşık olarak 100,000 farklılaşması için ECMlerin kaplanmış 6 oyuklu kültür plakaları, insan iPSCs (hücre pasajı prosedürler ile aynı) adımlarını tohum. Hücreler% 85 confluency ulaştığında, 6 ile insülin orta olmadan RPMI / B27 orta değiştirmekuM GSK3-beta önleyicisi CHIR99021 (CHIR) ve 48 saat boyunca muhafaza edilir.
  2. 48 saat sonra, insülin ortamı, RPMI / B27 CHIR-içeren kültür ortamı yerine ve (3. gün kadar) 24 saat süre ile, tek başına bırakın.
  3. 3. günde, 5 mcM Wnt inhibitörü IWR1 ile insülin olmadan RPMI / B27 medya değiştirmek ve (5 gün kadar) 48 saat boyunca muhafaza edilir.
    Not: Daha önceki çalışmalarda 11'de tarif edildiği gibi, Wnt engelleme, aynı zamanda, diğer küçük molekül bileşikleri kullanılarak denenebilir. IWR1 nedeniyle Wnt 11 sinyal önlenmesinde etkili olduğu gösterilmiş olan artmış dizi diğer küçük molekül önleyicileri, Wnt üzerinde seçildi.
  4. 5. günde, insülin ortamı olmadan geri RPMI / B27 orta değiştirebilir ve (7 nci gün kadar) 48 saat süre ile bırakın.
  5. 7. günde, (insülin) ile RPMI / B27 ortamı ile orta yerine ve aynı ortam her bundan 3 gün sonra orta yerine. Kardiyomiyositlerin Spontan dayak ilk günden yaklaşık günde 8 görünür olmalıdır10.

Glikoz Açlık ile İnsan kardiyomiyositlerde 7. saflaştırılması

  1. 10. günde sonrası farklılaşma olarak, 6-çukurlu plaka 2 mi düşük glukoz ortamı her bir gözündeki aracını değiştirme ve (günlük 13 kadar), 3 gün boyunca bu ortamda hücreleri korumak.
  2. Gün 13'te, (insülin) ile RPMI / B27 ortamı, hücreleri döndürür.
  3. İsteğe bağlı olarak, glukoz açlık sırasında sigara kardiyomiyositlerin kolay ayrılması için izin kültür plaka olmayan kardiyomiyositlerde gevşetmek yardımcı glukoz açlık ikinci turda önce kardiyomiyositlerde Replate.
    1. 13. günde, aspirat ortam içinde, bir kez PBS ile yıkanır ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca, hücre ayrışma enzim 500 ul kullanılarak tek tek hücreler içine hücreleri ayırmak. Özellikle, enzim işlemi, 5 dakika sonra, el ile art arda hücre ayrışma enzim çekerek ve cardiomyo karşı püskürtülerek 6-çukurlu plaka kardiyomiyositlerde ayırmak için 1000 ul pipet kullanıncyte tek tabaka. 30 pipetleme tekrar kadar tek tek hücreler içine kardiyomiyositlerde ayırmak için gerekli olabilir.
    2. Hücreler ayrılmış ve tek hücreli bir formda olduğu sonra x g 200 ° C'de 4 dakika süreyle hücre ayrışma enzimi ve santrifüj sulandırmak için insülin ile RPMI / B27 ortamı, 5 ml ile dolu bir 15 ml'lik konik bir tüp içine, tüm hücreleri toplamak. Aspire ve süpernatant atın.
    3. Yeni ECMS kaplı 6-plaka üzerine 2 ml RPMI / B27 orta ve plaka hücreleri yeniden askıya. Tipik olarak, kardiyomiyositlerinin yüksek confluency şarjı sırasında hücre sağkalım ile yardımcı olur. Şarjı sırasında optimum hayatta kalmak için yeni 6-kuyu tabak başına 2 milyon hücre Replate hedefliyoruz.
  4. 14. günde, ikinci bir glikoz yoksunluğu döngüsü için tekrar düşük glikoz ortamında 2 ml orta değiştirin. Kültür 3 gün daha, bu düşük glukoz halinde olan hücreler. Olmayan kardiyomiyositlerin çoğu bu düşük glikoz kültür durumda ölecek.
  5. Günün 17 at, R orta 2 ml değiştirmekInsülin PMI / B27 ortamıdır. kalan hücreler yüksek derecede saflaştırılmış kardiyomiyositler olacaktır. Bu kardiyomiyositlerde gen ifade analizi, ilaç tarama, metabolik analizi ve çeşitli alt-tahliller için de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

hiPSC farklılaşma sırasında morfolojik değişimler.

besleyici içermeyen plakalarda kültürlenmiştir hiPSC olarak düzlemsel ve iki boyutlu koloniler büyüdü. Yaklaşık% 85 konfluent hale geldikten sonra, hiPSCs farklılaşması (Şekil 1A) 6 uM CHIR ile muamele edilmiştir. Hücre ölümü, normal ve normal bir durum, önemli miktarda CHIR tedavi 24 saat sonra gözlenmiştir. CHIR tedavisinin iki gün sonra, hiPSCs bir mezodermal kaderi doğru ayırt devam etti. HiPSC koloniler hücrelere kıyasla, bu gün 2 hücreleri için hücre boyutu artmıştır. Hücre sayısı, aynı zamanda, hücre bölünmesi (Şekil 1B) daha da artmıştır. 5. günde, mezodermal hücreler kalp soy (kardiyak mezoderm) yönelik edildi. Bu zamanda, hücreler, birleştirici ve karakteristik, dal-benzeri yapılar (Şekil 1C) oluşturulması başlar. 10. günde, şube benzeri yapılar son derece belirgin ve kardiyomiyositler yıldız edildited kendiliğinden (Şekil 1D) yenerek. Terminal farklılaşmış kardiyomiyositler bu noktanın ötesinde çoğalırlar olmaz. Farklılaşma protokolün bir zaman çizelgesi, Şekil 2 'de gösterilmiştir.

Gösterdi immün ve sonuçları flow sitometri kardiyomiyositler glukoz açlık ile arıtılmış bulundu.

Farklılaşma 10 gün sonra, hücre alanları arasında% 50'den fazla yenerek. Ancak, dayak, hücre sayfaları bazen de olmayan kardiyomiyositlere ile harmanlanmıştır. Kardiyomiyosit saflığını incelemek için, kardiyomiyosit işaretleyici kalp Troponin-T (cTnT) karşı immün hücreler çoğu hücre cTnT pozitif olduğunu bulmak için karakterize edildi. Bununla birlikte, farklılaşmış hücreler bir saflaştırılmamış popülasyonunda bir hücre sayısı da gün 13 (Şekil 3A), bu farklı popülasyonda olmayan kardiyomiyositlerin varlığına işaret cTnT'nin ekspresyonunu yoktu. Bununla birlikte, glikoz, açlık ile,Hemen hemen tüm diğer hücreler, glükoz açlık aşağıdaki kardiyomiyositlerin saflandırılmasında gösteren, 13. günde (Şekil 3B) ile cTnT'nin pozitifti. Bu veriler daha fazla analiz flow sitometri kullanılarak doğrulanmıştır. Gün 13 sonrası farklılaşma ile farklılaşmış bir hücre popülasyonu açlıktan (Şekil 4A), glikoz değil, yaklaşık% 50 TNNT2 + hücresi içermektedir. Paralel farklılaşma da yapılan ancak 3 gün glikoz yoksunluğu ile farklılaşma gün sonra 10 de başlamıştı. Unstarved farklılaşma aksine, glikoz yoksunluğu 13. günde (Şekil 4B) 'de% 90 TNNT2 + hücrelerini içeren, saflaştırılmış bir popülasyonuna neden olmuştur.

Şekil 1,
Şekil 1. kardiyak soy doğru hiPSC farklılaşma sırasında sıralı morfolojik değişimler. (A) ayrım hiPSCsGün 0 sergi tipik koloni morfolojisi de ve% 85 confluency etrafında ulaştı. 2 gün (B), CHIR ile muamele edildikten sonra hücreler iki gün boyunca% 100 birleşmeye ulaşınca ve mezodermal soy girdi. 5. günde (C), hücreler IWR1 ile muamele edildikten sonra 2 gün kalp mezoderm aşamaya girdi için. Bazı hücreler kaynaştırmak ve (oklarla gösterilen) karakteristik şube benzeri morfolojileri oluşmaya başladı. Günün 7-10 At (D), şube benzeri yapılar oldukça belirgindir ve kardiyomiyositler kendiliğinden dayak başlar. Bar = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
HiPSC-CM farklılaşma protokolü ve sonraki glukoz açlık sürecinin Şekil 2. Timeline. Kardiyomiyositlerde bir Dayak yeniden tipik olarak ilk önce yaklaşık olarak günde 7-10 gözlenmiştir. Glikoz açlık İki tur günden 17 ile kardiyomiyositlerin saflaştırılmış nüfus neden olacaktır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. İmmünofloresan glukoz açlık aşağıdaki kardiyomiyositlerin saflaştırılması ortaya koymaktadır. (A) farklılaşma 13 gün Kardiyak Troponin T (cTnT) ile boyandı sonra Saglikli hücreler. Birçok hücre kardiyomiyositlere farklılaştırılmış ve pozitif cTnT vardı, ama non-kardiyak, cTnT-negatif hücre sayısı da mevcut var. Buna karşılık, (B) 10. günde başlayarak 3 gün glikoz açlığından sonra, hemen hemen tüm hayatta kalan hücrelerin cTnT'nin gün 13. Ölçek çubuğu = 200 um ile pozitif bulundu.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52628/52628fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Akış sitometrisi glikoz, açlık aşağıdaki kardiyomiyositlerin saflaştırılmasını göstermektedir. (A), glikoz, açlık, kardiyak farklılaşma 13 gün sonra, hücreler popülasyonu yaklaşık% 50 TNNT2 + kardiyomiyositlerde sergiledi. Kırmızı farklılaşmış hücre popülasyonu gösterir ve mavi bir negatif kontrol olarak farklılaşmamış hiPSCs gösterir. Kalp farklılaşma 10 gün sonra (B) ve glikoz, açlık 3 gün sonra, farklılaşma, aynı partiden bir hücre nüfusunun% 90 'TNNT2 + kardiyomiyositlerde içeren saflaştırılmıştır. için lütfenBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.

E8 orta bileşimler
E8 Cilt: 1 L'lik Şirket Katalog numarası
Glutamin ve HEPES ile DMEM / F12 1000 mi Invitrogen 11330-032
NaHCO 3 (% 7.5, 75 mg / ml) 7.24 mi Invitrogen 25080-094
L-askorbik asit 2-fosfat (64 mg / ml) 1 mi Sigma A8960
sodyum selenit (70 ug / ml) 200 ul Sigma S5261
transferin (50 mg / ml) 214 ul Sigma T3705
insülin (4 mg / mL) 5 mi Invitrogen 12585-014
FGF2 (200 ng / | il), 500 ul Peprotech 100-18B
TGFb1 (100 ng / | il), 20 ul Peprotech 100-21
E8 kompozisyonlar için stok çözümleri
L-askorbik asit-2-fosfat (64 mg / ml) 50 mi ultra-saf su içinde 3.2 g, depo 500 ul alikot 20 ° C'de
Transferin (50 mg / ml) -20 ° C'de ultra-saf su deposu 107 ul alikotları, 10 ml içinde 500 mg
Sodyum selenit (70 ug / ml) -20 ° C'de 500 mi, aşırı saf su, depo 100 ul alikotları içine 35 mg sodyum selenit
FGF2 (200 ng / | il), 5 ml soğuk D-, 1 mgPBS deposu 250 ul alikot 20 ° C'de
TGFb1 (100 ng / | il), -20 ° C'de 1 ml soğuk 10 mM sitrik asit, pH 3, depo 10 ul tam bölünen miktarları, 100 ug

E8 Orta Tablo 1. Bileşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yüksek ölçüde saflaştırılmış hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin büyük miktarda elde temel kardiyak araştırmalar ve klinik ve çeviri uygulamalar için kritik önem taşır. Kalp farklılaşma protokolleri küçük molekül-modüle ve tek tabaka-temelli yöntemler 5 nihayet kardiyojenik büyümeyi kullanan embriyoid vücut temelli yöntemlerden geçiş, son yıllarda muazzam gelişmeler geçirmiş sandviç yöntemleri 12 matris, 2 faktörleri, ve var. Anılan protokol, burada açıklanan protokol yüksek ve küçük moleküller CHIR ve aktiftir 5,7 kullanarak Wnt / β-katenin sinyal modülasyonu ile farklı hiPSC hücre hatları için en tekrarlanabilir kalp farklılaşma verimliliği görüntülenir. Özellikle, farklılaşmamış hiPSCs Wnt sinyal inhibitörü IWR1 ile GSK3'un-beta inhibitörü CHIR ve sonraki kalp farklılaşma ile mezodermal farklılaşmasını geçmesi uyarıldı. Bu sıralı adımlarıWnt sinyal modülasyonu, kalp soy indüksiyon aşamasında insülin tükenmesi ile destekli, yüksek verimli kalp farklılaşma yol açtı. CHIR mezodermal indüksiyonu için yaygın olarak kullanılan bir küçük molekül, GSK3-beta önleyicisi, ancak GSK3-P engellenmesi için diğer küçük moleküller, kardiyomiyosit farklılaşma mekanizmalarının 11 de test edilmiştir. Çoklu seçenekleri de sonraki küçük molekül Wnt inhibitör için kullanılır. Örneğin, son yayın kardiyomi pluripotent kök hücrelerin kimyasal tanımlanmış farklılaşma odaklanan etkili Wnt önlenmesi ve kardiyak mezoderm indüksiyon 11 2 mcM Wnt-C59 kullanır.

Buna ek olarak, bir glikoz açlık yöntemi ile farklılaştırılmış kardiyomiyositlerde kardiyomiyositlerde ve non-kardiyomiyositlerde 8 arasında mevcut olan akış belirgin glükoz metabolik yararlanır, daha başka saflaştırıldı. Bu glikoz açlık yönteminin etkinliği d unutmayın esastırdensite-bağımlı (yani, kardiyomiyositlerin yüksek oranlarda vermiştir farklılaşmaları daha kardiyomiyosit sağkalım elde etmek için daha olasıdır). Ancak, düşük glukoz ortamına geçiş de kardiyomiyositlere için stresli bir durumdur. Bu glikoz açlık 3 gün sonra geri insülin ortamı düzenli RPMI / B27 hücreleri değiştirmek önemlidir. Bu protokol, besleyici içermeyen bir büyüme sistemi olan pluripotent kök hücreler besleyici fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen değil, kullanılmıştır. Ancak önceki kalp farklılaşma protokolleri pluripotent kök hücrelerinden 5 den kardiyomiyositlerde üretmek için besleyici-tabanlı sistemler kullanmışlardır. Aynı şekilde, önceki protokoller de kök hücre bakım için mTeSR1 ortamı kullanmış, ancak burada kullanılan E8 medya ve besleyici-free sistemi sayesinde sadeliği ve sığır serum albümin ve fare embriyonik fibroblastlar gibi aşırı ksenojeneik bileşenlerin eksikliği üstündür.

Şu anda,kardiyomiyosit soy doğru pluripotent kök hücre farklılaşması, büyük ölçüde sağlam, ancak yine de verimlilik açısından hiPSC hat ile hat arası değişkenlik uğrar. Bu kalp farklılaşma alanında önemli bir sorun olmaya devam ve daha fazla çalışma gerektirir. farklılaşma verimliliği hiPSC hatlarının uygun bakım tarafından geliştirilen, ve özelde, hiPSC bakım sırasında overconfluency engelliyor. HiPSCs bir eşit seribaşı tek tabaka en iyi genel farklılaşmalar yol eğilimi gibi ek değişkenlik, Pasajlanması işlemi sırasında hücre tohumlama kaynaklanmaktadır. Burada, hücre kültürü sırasında hücre tohumlama için bir fare-türevli, Matrigel-tabanlı ECMS başarıyla kullanılmıştır, ancak nihai bir geçiş kseno ücretsiz substratlar tavsiye edilir. ECM'ler hücre tohumlama gelince, düzensiz ekim genellikle belirli bir kuyunun içinde kardiyomiyositlerin dengesiz dağılımı ile sonuçlanır. HiPSCs eşit tohumlanır Örneğin, altı oyuklu plaka içinde bir kuyu kenarları HIG yol açabilirKuyunun merkezinin daha kardiyomiyositlerin onu sayıları. Bu eşit olmayan tohum şartlar, düşük verimlilik farklılıklara neden olmayan kardiyomiyosit daha büyük bir sayı, fibroblastlar ve düz kas hücreleri gibi mezodermal türevleri verebilir. Ayrıca düşük verimlilik farklılıklar (% 50 altında) çok daha zor burada belirtilen glikoz yoksunluğu işlemi kullanılarak arıtılması için olduğu gözlenmiştir. Uzun vadeli glikoz açlık başka yan etkisi kardiyomiyosit canlılığı potansiyel bir kayıptır. Kardiyomiyositler glikoz yokluğunda laktat metabolize edebiliyoruz rağmen, biz düşük glikoz ortamına bu anahtar hücreleri için stresli olduğunu bulmak. Hücreler yenerek kendiliğinden durabilir ve glukoz açlık önerilen zamanın ötesine uzatılır, bazı hücre kaybı görülebilir. Glikoz yoksunluk Bu gelişmiş hassasiyet kök hücre kaynaklı cardiomyocy köklü, gelişimsel, işlevsel ve elektrofizyolojik immatüritenin yansıtıcı olabilirtes gerçek yetişkin kıyasla 13 kardiyomiyositlerin.

Özetle, burada açıklanan protokol kardiyomiyosit arıtma glukoz açlık yöntemi ile küçük molekül tabanlı, hiPSC tek tabaka kalp farklılaşma yöntemi birleştirir. Bu protokol, yüksek saflaştırılmış kardiyomiyositlerin tekrarlanabilir nesil için izin verir ve kardiyovasküler hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması ile ilgili çeşitli mansap deneyleri kolaylaştırmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel (9-12 mg/ml) BD Biosciences 354277
RPMI media Invitrogen 11835055
Glucose free RPMI media Invitrogen 11879-020
B27 Minus Insulin Invitrogen A1895601
B27 Supplement (w/ insulin) Invitrogen 17504-044
Pen-strep antibiotic Invitrogen 15140122
Fetal bovine serum BenchMark 100-106
DMSO Sigma D-2650
ROCK inhibitor Y-27632 EMD Millipore 688000
CHIR99021 Thermo Fisher 508306
IWR1 Sigma I0161
EDTA Invitrogen 15575-020
Accutase Millipore SCR005
Cell lifter Fisher 08-100-240
Cryovial Fisher (NUNC tubes) 375418
TrypLE Select Enzyme Invitrogen 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, (6), 150 (2013).
  2. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, (3), 407-414 (2001).
  3. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104, (4), e30-e41 (2009).
  4. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  5. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  6. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115, (6), 556-566 (2014).
  7. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (1), 162-175 (2013).
  8. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, (12), 127-137 (2013).
  9. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28, (6), 611-615 (2010).
  10. Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17, (6), 1079-1085 (2008).
  11. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11, (8), 855-860 (2014).
  12. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  13. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).More

Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J. Vis. Exp. (97), e52628, doi:10.3791/52628 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter