Abstract
2型糖尿病是一种慢性疾病，影响到3.82亿人，2013年，预计将上升到5.92亿，到2035年1。在过去的二十年中，β细胞功能障碍的2型糖尿病患者已明确规定2的作用。研究进展所需的胰岛的分离方法。胰岛分离的协议这里提出股与来自其它组协议许多共同的步骤，具有一些修改，以提高来自野生型和糖尿病瘦素受体分贝 （的db / db）小鼠分离的胰岛的产量和质量。的实时小区2光子成像方法被提出可用于研究胰岛素分泌胰岛内的控制。
Introduction
在疾病的β细胞功能障碍中的作用已被广泛认可3,4。细胞系如MIN6和INS-1是有用的工具来理解的β细胞行为的生物学。然而，在生理控制胰岛素分泌的需要胰岛内进行。这些胰岛包含数千紧密包装的β细胞，以及血管和其它内分泌细胞类型。胰岛内这样的环境影响胰岛素分泌和很可能是在糖尿病重要。因此，要理解的生理控制胰岛素分泌，以及疾病的病理生理学，有必要研究完整的胰岛。
胰岛分离
从2型糖尿病患者活人胰岛和，特别是人胰岛是很难获得的。此外，人类的胰岛有实验分子操作的可能性有限。因此，研究人员使用的是允许从动物和2型糖尿病的动物模型。一个这样的疾病模型是的db / db小鼠。这是模型2型糖尿病的表型发展的非常类似于人类疾病5,6自发突变。从糖尿病db / db小鼠呈现此处胰岛分离的协议具有许多共同的步骤与其它基团的一些精炼为更好产量，纯化和增强胰岛存活。
2光子成像
此处描述的活细胞2光子检测使研究人员能够量化数和从糖尿病7和野生型胰岛8,9-许多细胞评估单含胰岛素的颗粒的特征。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有本实验是按照昆士兰大学的地方动物伦理规程（经昆士兰大学生物科学解剖伦理委员会）执行。
1.胰岛分离
- 试剂的准备
- 酶的混合物
- 对于胰腺消化，使用LIBERASE和IV型胶原酶的混合物。稀释LIBERASE TL（嗜热低）1瓶5毫克用26毫升的DMEM（贝科改良Eagle培养基）。
- 准备在Hank氏缓冲IV型胶原酶在浓度为0.5mg / ml的，补充有5mM的HEPES，0.5mM的氯化钙 ，为0.1mg / ml的DNA酶和1mg / ml的牛血清白蛋白。
- 混合LIBERASE TL和胶原酶溶液以4：1的比例（按体积计）， 即加入4ml LIBERASE TL +1毫升胶原酶。等分的酶的混合物在-20℃至2.5毫升每个和存储。
注：该组织孵化时间vARY酶批次之间的位（30秒到1分钟差）。因此，一批测试可能需要。
- RPMI媒体隔离
- 溶解的RPMI 1640中粉一个小瓶在1升水中在RT和补充与2g 碳酸氢钠 ，4.02克HEPES。
- 结合的RPMI隔离介质在一个大锥形瓶中，用磁力搅拌器混合，调节至pH7.4，用NaOH，过滤灭菌，并在4℃下存储。
- RPMI文化传媒
- 使用的RPMI培养基，含10％胎牛血清和1％抗生素（ 即 ，青霉素100U /毫升，链霉素100微克/毫升）。
- 酶的混合物
- 胰岛分离和培养
- 牲
- 牺牲小鼠根据当地机构的伦理程序颈椎脱位或CO 2窒息。用70％乙醇彻底喷鼠标主体。
- 胰腺灌注
- ü本身2长切口横向穿过腹部皮肤和腹膜，使V形翼板。拉扯皮肤向上的襟翼揭开整个腹腔，抛开肠和保持就位肝经折叠薄纸以显示胆总管（ 图1和2）。把动物使头部朝向外科医生和尾部远离外科医生。
- 应用血管钳在壶腹在十二指肠壁进入十二指肠（ 图1）阻断注射酶。
注意：这是一个重要的步骤，因为它决定了注入酶是否将进入胰管和灌注胰脏或回流到注射部位（超过钳位）或进入十二指肠（下夹子）。 - 导管插入胆总管有一个31 G针肝总管和胆囊管（ 图1）的交界处附近，留有余地，第二次注射，如果日Ë胰腺不能灌注的第一次。慢（超过约10秒）注资约冷酶混合物2毫升到小鼠胆总管。
注：胰腺将很快灌注如果夹具是在正确的位置。 - 调整夹子的位置，如果所述针是胆总管内但不能灌注胰脏（ 即 ，从肝脏如果超过夹紧向上移动夹具有点远或移动下来一点到肝脏如果下夹紧）。
注：针有时进入周围胶囊而非导管的内腔中。一种有用的标志来检查针是否是内部胆总管是导管注射时的膨胀。如果胰脏不能灌注，另一种是酶混合物可以注入到具有较低产量预期胰腺的多个站点。胰腺（脾叶）的左侧部位的灌注是胰岛的收获量的最大化很重要的。 - 后胰腺为perfused，迅速取出胰腺，放入小瓶（约20毫升，玻璃）和孵育〜19分钟，在37℃水浴。
注：孵育时间可以改变一点取决于小鼠品系和年龄。 - 后的培养时间，加入约20毫升冷的隔离介质的停止消化过程。摇动小瓶轻轻地破坏胰腺，并通过正常的茶筛（1毫米孔径）倒入一个无菌的50ml管中。顶部与隔离媒体和离心管400 XG在4℃下1分钟，摘下。
- 再次溶解在隔离介质颗粒与传输两个15ml试管，然后离心，在400×g离心1分钟，在4℃下与制动切断。吸出上清液后，通过涡旋或上下抽吸混合两种粒料以及用6ml密度梯度细胞分离介质（的Histopaque 1077溶液）每管中。然后轻轻加〜6毫升隔离介质在管的侧面上的顶密度梯度分离介质和离心机在100×g离心15分钟，在4℃下与制动切断。
- 收集在上部（分离介质）上清，中部和下部（密度梯度细胞分离介质）层在3个不同的菜肴。精选在这些三个培养皿胰岛，用解剖显微镜下的吸移管。
注：中间层包含了大多数的胰岛。胰岛被认为是约50至500微米的尺寸紧凑的结构（ 图3）。我们获得〜200胰岛在WT小鼠和db / db小鼠300- <100小岛。
- 胰岛培养
- 为了帮助胰岛从酶消化回收，40胰岛中的25cm培养皿6毫升的RPMI培养基中（10mM葡萄糖）培养基，在37℃，5％/ 95％的CO 2 / O 2]为前活2天-cell双光子成像。每天更换培养基。
- 牲
2。活细胞-2-光子成像
- 试剂准备
- 外缓冲区
- 制备的钠丰富细胞外缓冲器用于与140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，2.5mM的氯化钙 ，1mM的MgCl 2的，5mM的碳酸氢钠和10mM HEPES的2光子检测。
- 外染料
- 对于双光子测定中，准备股票SRB 8mM的胞外缓冲液，分装成小管并储存在-20℃。稀释股票SRB 1:10新鲜外缓冲器得到的0.8毫米的工作浓度。
- 外缓冲区
- 光子成像
- 首先，预孵育2天的培养的胰岛在3毫米的葡萄糖胞缓冲液30分钟。
注：我们在培养2至5天使用的小岛。 - 然后，将载玻片上的热控制腔装在显微镜载物台上。使用润滑脂以防止溶液泄漏。
- 覆盖用500μl细胞外的腔室ular缓冲器含有0.8毫SRB具有不同葡萄糖浓度（3mM的，6毫15 20mM和20mM葡萄糖）。
- 下一步，将预孵育的胰岛到室的中部和聚焦在3-4细胞层进入胰岛，其中，在啮齿动物胰岛，免疫染色胰岛素表明大部分细胞是β细胞。
注：SRB将概述胰岛所有细胞膜迅速，胰岛准备图像。 - 使用双光子显微镜用60X油浸物镜（NA 1.42）和图像处理软件（ 例如 ，ScanImage 11）。 图4示出了一个典型的显微结构。在550-650纳米的检测采用SRB作为膜透性荧光标记物外，在880 nm光激发飞秒激光脉冲图片胞吐事件，有荧光。记录胰岛反应的刺激。
- 由小荧光点的突然出现识别单胞吐事件（分辨率10像素/1;米），并通过荧光信号的快速上升阶段确认在感兴趣的区域）（〜0.78μm2以下。
- 首先，预孵育2天的培养的胰岛在3毫米的葡萄糖胞缓冲液30分钟。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
胰岛产量和纯化
对于一个正常的野生型小鼠，大约200胰岛预期。健康的胰岛看起来明亮，圆形并有光滑的边框。过消化隔离批次通常具有小和模糊胰岛而一个下消化批次具有较少的胰岛和腺泡细胞附着胰岛（ 图3）。糖尿病db / db小鼠，胰岛的收获量和外观取决于疾病进展具有更好的血糖小鼠具有更大，更明亮，更胰岛（高达300胰岛）相比，更坏的血糖小鼠具有较小的胰岛具有半透明的外观（在100胰岛）
2光子检测
2光子成像是一种间接测定法来测量胰岛素分泌以单一胰岛素颗粒融合的水平。响应于刺激，例如葡萄糖或高钾，胰岛素颗粒熔合质膜和细胞外染料SRB进入第Ë颗粒，这导致突然荧光斑点〜400nm的直径的外观（ 图5）。各种实验已经进行了验证该测定作为融合含有胰岛素的颗粒，如葡萄糖剂量依赖性增加的颗粒融合事件数目与胰岛素分泌的期望量，所述响应单元中的2的大小一致的的测量光子与β细胞的，由2光子和电子显微镜测得的类似颗粒直径，染料摄取和胰岛素的共定位染色8。
内记录时，响应于刺激识别和事件的像吻 - 运行或全融合的融合事件的位置，外观的时间，持续时间和类型的所有胞吐事件的特征（ 图5，6）。在融合过程中，这些特性可用于评估有价值在2型糖尿病模型的颗粒融合的任何缺陷。我们使用这种方法以前的报告显示，在糖尿病的db / db胰岛缺陷为满颗粒融合的损失，而不是在单个颗粒融合7动力学的特性的变化。此外，我们表明，在降低胰岛素分泌的疾病的最大因素是在应答细胞7的数量的减少。
图1：夹紧和喷射的部位的图注入的酶的肝总管和胆囊管的交界处附近的胆总管。夹紧瓦尔特壶腹通过血管钳，以方便注射酶到胰管。
2632fig2.jpg“/>
图2：在小鼠中的注入过程 。顶部图说明胆总管施加在瓦尔特壶腹血管钳内的针。下图显示了注射后LIBERASE灌注胰腺。
图3：野生型和的db / db胰岛典型图像（A）野生型胰岛。 （B）的db / db孤立小岛。 （C）在消化胰岛附带腺泡细胞（箭头）。 （ 四）在消化胰岛小和模糊的小岛（箭头）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：订造2光子显微镜的主要组成部分 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：为记录有2光子显微镜单一胰岛素颗粒融合事件的实施例左数据代表前（A）和后（B）一种胞吐事件（箭头）响应于15mM的外观葡萄糖刺激的细胞。 （C）表示与细胞外染料SRB的进入颗粒的SRB标记，当它与质膜融合。 （D）示出以上的胞吐事件的感兴趣区域的荧光强度以及sequentia此事件胞吐（比例尺1微米）的L-图像。图片来源做等人 2014年7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：双光子显微镜用SRB作为细胞外染料下的野生型和糖尿病的db / db胰岛的响应 。在这些实验中胰岛素颗粒融合事件响应于15mm的葡萄糖刺激被记录。黄色圆圈是胞吐事件的过程中记录的20分位点。图片来源做等 2014 7修改。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在胰岛分离中最关键的因素是胰腺的初始灌注;一个下灌注胰脏结果在相当低的胰岛的收获量。其它因素也影响了隔离质量如消化时间和摇晃可能部分弥补灌注的水平的水平。例如，一个完全灌注胰脏将需要在37℃下被孵育〜18分30秒，轻轻振动，与此相反的下消化胰，可能需要约20分钟的消化与较硬晃动。两种酶消化我们手中的混合物提供更好的胰岛分离比任何一个单独的。对于胶原酶唯一方法，消化时间主要影响胰岛产量只有30秒的时间差，可以显着地影响质量。对于LIBERASE只，产量是可以接受的，但在消化有时会发生，我们认为，在加入胶原酶有助于消化结缔组织更好。
有若干可在胰岛已经分离之后进行可能的实验。胰岛可以固定在分离之后立即多聚甲醛或甲醇与用于免疫荧光染色，以确定感兴趣的10种蛋白的位置。胰岛可以分散在单细胞。这可以在胰岛分离的同一天或之后胰岛培养几天来完成。然后将单细胞铺板出来，这是该制剂已经作为支柱如膜片钳和全内反射显微技术。在该实验中测量胰岛素的分泌，以及用于活细胞2光子成像，我们已发现，胰岛需要在培养2天以得到再生的数据。什么是发生在文化不是很清楚，但被认为是一个周期从隔离和消化过程的恢复。
这里介绍的双光子技术使研究人员能够图像的胰岛素分泌过程在单个颗粒融合从完整的胰岛内的许多细胞中的水平。我们已发现，颗粒融合事件和它们的定时的数量是与量和胰岛素分泌8的时间曲线相一致。这表明该方法的检测的大多数胰岛素颗粒融合事件。鉴于在到定影颗粒染料项不是正在研究7,8检测，我们已经竭尽全力胰岛素颗粒融合事件进行对照实验证明β细胞胰岛素颗粒融合的具体方法
有许多的技术问题与双光子显微镜是通用于所有的成像方法。例如，我们仔细平衡试图获得足够的光线中的胰岛，使我们能够降低探测器的增益的对立因素，因此降低噪音，与把这么多的光中，我们造成细胞损伤胰岛。在我们的系统中，Pockels盒用来衰减脉冲激光（ 图3）;所有商业系统有某种机制来调节光的落在到试样的强度。
总之，仔细隔离分贝的组合/ Db胰岛和全胰岛2光子显微镜本新的机会来研究胰岛素分泌的方法，并确定在2型糖尿病的主要故障元件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
