Abstract
Le diabète de type 2 est une maladie chronique qui touche 382 millions de personnes en 2013, et devrait atteindre 592 millions d'ici 2035 1. Au cours des deux dernières décennies, le rôle de la dysfonction des cellules bêta dans le diabète de type 2 a été clairement établi 2. progrès de la recherche a nécessité des procédés pour l'isolement des îlots pancréatiques. Le protocole de l'isolement des îlots présenté ici part de nombreuses étapes communes avec des protocoles d'autres groupes, avec quelques modifications pour améliorer le rendement et la qualité des îlots isolés à la fois du type sauvage et db Lepr diabétique de souris (db / db). Un des cellules vivantes Procédé d'imagerie à 2 photons est ensuite présenté qui peut être utilisée pour étudier le contrôle de la sécrétion d'insuline des îlots à l'intérieur.
Introduction
Le rôle d'un dysfonctionnement des cellules bêta dans la maladie a été largement reconnu 3,4. Des lignées cellulaires telles que la MIN6 et INS-1 sont des outils utiles pour comprendre la biologie de comportement des cellules bêta. Toutefois, le contrôle physiologique de la sécrétion d'insuline a lieu dans les îlots de Langerhans. Ces îlots contiennent des milliers de cellules bêta serrées, ainsi que les vaisseaux sanguins et d'autres types de cellules endocrines. Cet environnement au sein de l'îlot influe sur la sécrétion d'insuline et est susceptible d'être important dans le diabète. Par conséquent, pour comprendre le contrôle physiologique de la sécrétion d'insuline, et la physiopathologie de la maladie, il est essentiel d'étudier îlots intacts.
isolement des îlots
Îlots humains vivants et, en particulier, des îlots humains provenant de patients atteints de diabète de type 2 sont difficiles à obtenir. En outre, des îlots humains ont des possibilités limitées pour la manipulation moléculaire expérimentale. Les chercheurs ont donc utilisé estpermet à partir d'animaux et des modèles animaux de diabète de type 2. Un tel modèle de la maladie est la souris db / db. Ceci est une mutation spontanée que les modèles diabète de type 2 avec une progression de phénotype qui se rapproche étroitement de la maladie humaine 5,6. Le protocole présenté ici pour isolement des îlots de souris db / db diabétiques comporte de nombreuses étapes en commun avec d'autres groupes avec quelques améliorations pour un meilleur rendement, la purification et le renforcement de la survie de l'îlot.
2 imagerie photonique
Le dosage des cellules vivantes 2 photons décrit ici permet aux chercheurs de quantifier le nombre et évaluer les caractéristiques des granulés contenant de l'insuline à partir de cellules simples de 7 et diabétique de type sauvage îlots 8,9.
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Protocol
NOTE: Toutes les expériences actuelles ont été réalisées conformément aux procédures locales d'éthique animale de l'Université de Queensland (approuvés par l'Université du Queensland, Comité d'éthique Biosciences anatomique).
1. Isolement îlots
- Préparation des réactifs
- Mélange d'enzymes
- Pour la digestion du pancréas, utilisez un mélange de libérase et de la collagénase de type IV. Diluer libérase TL (thermolysine bas) 1 flacon de 5 mg avec 26 ml de DMEM (milieu de Eagle modifié Dulbecco).
- Préparer la collagénase de type IV dans du tampon de Hank à une concentration de 0,5 mg / ml, supplémenté avec 5 mM de HEPES, 0,5 mM de CaCl2, 0,1 mg / ml de DNAse et de 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin.
- Mélanger la TL Libérase et des solutions de collagénase dans un rapport de 4: 1 (en volume), soit 4 ml Libérase TL + 1 ml de collagénase. Aliquoter le mélange d'enzymes pour 2,5 ml chacun et conserver à -20 ° C.
NOTE: Les temps d'incubation de tissu vvier un bit entre des lots d'enzyme (30 sec à 1 min de différence). Par conséquent, un essai de traitement par lots peut être nécessaire.
- RPMI Isolation médias
- Dissoudre un flacon de poudre dans du milieu RPMI 1640 1 L d'eau à la température ambiante et compléter avec 2 g de NaHCO 3, 4,02 g d'HEPES.
- Combiner les médias d'isolement RPMI dans une grande fiole conique, mélanger avec un agitateur magnétique, ajuster à pH 7,4 avec NaOH, filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
- RPMI Culture Media
- Utilisation des milieux de culture RPMI avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% d'antibiotiques (par exemple, de la pénicilline 100 U / ml, streptomycine 100 pg / ml).
- Mélange d'enzymes
- Isolement et culture des Islet
- Sacrifice des animaux
- Sacrifiez la souris par dislocation cervicale ou CO 2 asphyxie selon les procédures d'éthique de l'institution locale. Vaporiser le corps de la souris à fond avec de l'éthanol 70%.
- Perfusion pancréatique
- USE 2 coupes longues latéralement à travers la peau de l'abdomen et du péritoine pour faire un rabat en forme de V. Tirez le rabat de la peau vers le haut pour découvrir la totalité de la cavité abdominale, mettre de côté l'intestin et de garder le foie en place par un mouchoir en papier plié pour révéler le canal cholédoque (figures 1 et 2). Mettez l'animal de sorte que la tête vers le chirurgien et la queue loin du chirurgien.
- Appliquer une pince vasculaire à l'ampoule sur la paroi du duodénum pour bloquer les enzymes injecté de pénétrer dans le duodénum (Figure 1).
NOTE: Ceci est une étape importante car elle détermine si les enzymes injectées iront dans le canal pancréatique et perfuser le pancréas ou de reflux au site d'injection (plus de pince) ou aller dans le duodénum (sous serre). - Cathétériser le canal cholédoque avec une aiguille 31 G près de la jonction du canal hépatique commun et canal cystique (Figure 1) et laisser la place à une deuxième injection si èmee pancréas ne parvient pas à perfuser la première fois. Lentement (~ 10 sec) injecter environ 2 ml de mélange d'enzymes froid dans la souris canal cholédoque.
NOTE: Le pancréas seront perfusés rapidement si la pince est dans la bonne position. - Ajustez la position de serrage si l'aiguille est à l'intérieur du canal cholédoque, mais ne peut pas perfuser le pancréas (ie., Se déplacer jusqu'à la pince un peu loin du foie si plus serré ou vers le bas un peu pour le foie si, en vertu serré).
REMARQUE: L'aiguille va parfois dans la capsule qui entoure au lieu de la lumière du conduit. Un signe utile de vérifier si l'aiguille est à l'intérieur du canal cholédoque est la dilatation du canal lors de l'injection. Si le pancréas ne parvient pas à perfuser, une alternative est le mélange d'enzymes peut être injecté à plusieurs sites du pancréas avec un rendement plus faible prévu. La perfusion de l'emplacement gauche du pancréas (le lobe splénique) est important pour la maximisation du rendement d'îlots de Langerhans. - Après le pancréas est perfused, enlever rapidement le pancréas, le mettre dans un flacon (~ 20 ml, verre) et incuber pendant ~ 19 min dans un bain d'eau à 37 C ° de.
NOTE: Le temps d'incubation peut varier un peu en fonction de la souche de souris et de l'âge. - Après le temps d'incubation, arrêter le processus de digestion en ajoutant ~ 20 ml de milieux d'isolement froid. Agiter doucement le flacon pour perturber le pancréas et le verser dans un tamis de thé normal (diamètre de pore de 1 mm) dans un tube de 50 ml stérile. Compléter le tube avec les médias d'isolement et centrifuger à 400 g pendant 1 min à 4 ° C avec frein off.
- Dissoudre le culot dans les médias de l'isolement et de transférer à nouveau à deux tubes de 15 ml, puis centrifuger à 400 g pendant 1 min à 4 ° C avec frein off. Après aspiration du surnageant, mélanger les deux pastilles bien avec 6 ml de milieu de séparation des cellules de gradient de densité (Histopaque 1077 solution) par tube au vortex ou aspiration et refoulement. Puis ajouter délicatement ~ 6 ml de milieux d'isolement sur le côté du tube au-dessus deles milieux de séparation de gradient de densité et centrifuger à 100 g pendant 15 min à 4 ° C avec frein off.
- Recueillir le surnageant dans le (milieux d'isolement) supérieure, moyenne et inférieure (densité cellulaire gradient milieux de séparation) couche en 3 plats séparés. Retirez à la main les îlots dans ces trois plats, en utilisant une pipette sous un microscope à dissection.
NOTE: La couche intermédiaire contient la plupart des îlots. Les îlots sont reconnus comme des structures compactes de ~ 50 à 500 um de taille (Figure 3). Nous obtenons ~ 200 îlots de souris WT et 300 à <100 îlots de souris db / db.
- La culture Islet
- Pour aider les îlots se remettre de la digestion enzymatique, des groupes de culture de 40 îlots dans une boîte de Pétri de 25 cm avec 6 ml RPMI milieux de culture (10 mM de glucose) à 37 ° C, 5% / 95% de CO 2 / O 2 pendant 2 jours avant en direct -cell 2 photons imagerie. Changer les milieux de culture quotidienne.
- Sacrifice des animaux
2. Live Cell 2-Photon Imaging
- Préparation des réactifs
- Extracellulaire Buffer
- Préparer le tampon de sodium extracellulaire riche pour le dosage de deux photons avec 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de NaHCO 3 et 10 mM de HEPES.
- Extracellulaire Dye
- Pour le test 2-photon, préparer stocks SRB 8 mM dans un tampon extracellulaire, aliquote dans des petits tubes et conserver à -20 ° C. Diluer le stock SRB 1:10 dans un tampon extracellulaire frais pour obtenir une concentration de travail de 0,8 mm.
- Extracellulaire Buffer
- photon Imaging
- Tout d'abord, pré-incubation de 2 jours îlots cultivés en 3 mM de tampon glucose extracellulaire pendant 30 min.
NOTE: Nous utilisons îlots entre 2 et 5 jours dans la culture. - Ensuite, placez une lame de verre sur la chambre thermo-commande monté sur la platine du microscope. Utiliser de la graisse pour empêcher la fuite de solution.
- Couvrir la chambre avec 500 pi de extracellparti- tampon contenant 0,8 mM SRB avec des concentrations de glucose différentes (3 mm, 6 mm, 15 mm et 20 mM de glucose).
- Ensuite, placer l'îlot pré-incubées dans le milieu de la chambre et de se concentrer à 3-4 couches de cellules dans l'îlot où, dans les îlots de rongeurs, immunocoloration pour l'insuline montre que la plupart des cellules sont des cellules bêta.
NOTE: Le SRB décrira tous la membrane cellulaire de l'îlot rapidement et l'îlot est prêt à l'image. - Utilisation d'un microscope à 2 photons avec un objectif 60X à immersion dans l'huile (1,42 NA) et un logiciel d'imagerie (par exemple., ScanImage 11). La figure 4 illustre un dispositif de microscopie classique. Image des événements d'exocytose utilisant SRB comme une membrane impermeant marqueur extracellulaire fluorescente excitée par des impulsions laser femtosecondes à 880 nm, avec fluorescence détectée à 550-650 nm. Notez les réponses des îlots à la stimulation.
- Identifier les événements d'exocytose simples par l'apparition soudaine d'une petite tache fluorescente (résolution de 10 pixels /1; m) et confirmer par la phase de montée rapide du signal fluorescent sur une région d'intérêt (~ 0,78 um 2).
- Tout d'abord, pré-incubation de 2 jours îlots cultivés en 3 mM de tampon glucose extracellulaire pendant 30 min.
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Representative Results
Rendement Islet et la purification
Pour un type sauvage souris normale, environ 200 îlots sont attendus. Îlots sains regarder lumineux, de forme ronde et avoir une frontière lisse. Un lot d'isolement sur digéré a généralement petites et floues îlots tandis qu'un lot de sous-digéré a moins îlots et attachée cellules îlots acineuses (Figure 3). Pour les souris diabétiques db / db, le rendement de l'îlot et l'apparence dépend de la progression de la maladie avec de meilleures souris glycémique ont de plus grands, îlots lumineux et plus (jusqu'à 300 îlots) par rapport à des souris glycémique pire qui ont îlots plus petits avec un aspect translucide (moins de 100 îlots)
Test 2-photon
Imagerie 2-photons est un test indirect pour mesurer la sécrétion d'insuline au niveau de fusion unique d'insuline de granules. En réponse à des stimuli tels que le glucose ou riche en potassium, en granulés d'insuline fusionnent avec la membrane plasmique et le colorant SRB extracellulaire pénètre èmee granules qui se traduit par l'apparition d'un coup fluorescente place ~ 400 nm de diamètre (figure 5). Diverses expériences ont été réalisées afin de valider ce test comme une mesure de la fusion de granules contenant de l'insuline tels que la dose de glucose dépendant du nombre d'événements granule de fusion augmente avec la quantité prévue de la sécrétion d'insuline, la taille uniforme des cellules répondu à la 2 photon à celle d'une cellule bêta, le diamètre du granule similaire mesuré par le photon 2 et au microscope électronique, la co-localisation de l'absorption de colorant et de l'insuline coloration 8.
Dans le moment de l'enregistrement, tous les événements d'exocytose en réponse au stimulus sont identifiés et l'emplacement des événements, le moment de l'apparition, la durée et le type des événements de fusion comme kiss-and-run ou pleine fusion sont caractérisés ( Figure 5, 6). Ces caractéristiques du procédé de fusion sont utiles pour évaluer tout défaut de la fusion des granules dans des modèles de diabète de type 2. Notre rapport précédent en utilisant cette méthode montre que le défaut dans les îlots diabétiques db / db est la perte de la pleine fusion de granules et non un changement dans les caractéristiques de la cinétique de granule individuel fusion 7. En outre, nous montrons que le facteur le plus important dans la diminution de la sécrétion d'insuline dans la maladie est une réduction du nombre de cellules sensibles 7.
Figure 1:. Un schéma des sites de serrage et d'injection Injecter les enzymes de la voie biliaire commune près de la jonction du canal hépatique commun et canal cystique. Fixer l'ampoule de Valter par un clamp vasculaire de faciliter l'enzyme injectée pour le canal pancréatique.
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Figure 2: Le processus d'injection chez les souris. Top figure illustre l'aiguille à l'intérieur du canal cholédoque avec un clamp vasculaire appliquée à l'ampoule de Valter. Figure du bas montre le pancréas libérase perfusé après l'injection.
Figure 3: images typiques de type sauvage et db db / îlots isolés (A) de type sauvage des îlots isolés.. (B) db / db des îlots isolés. (C) îlots Sous-digéré avec des cellules acineuses attachés (flèches). (D) Plus digéré îlots avec les petites et floues îlots (flèches). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Les principales composantes de la 2 photons microscope sur-mesure S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Exemple d'un événement insuline granule de fusion unique tel qu'enregistré par microscopie 2 photons figure de gauche représente la cellule avant (A) et après (B) l'apparition d'un événement d'exocytose (flèche) en réponse à 15 mM stimulation glucose.. (C) illustre l'étiquetage SRB avec l'entrée de la SRB extracellulaire de colorant dans le granulé quand il fusionne avec la membrane plasmique. (D) représente l'intensité de fluorescence sur une région d'intérêt d'un événement d'exocytose ainsi que la sequential images de cet événement exocytose (barre d'échelle 1 um). Image modifiée de Do et al 2014 7. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Les réponses de type sauvage et les îlots db / db diabétiques sous le microscope à 2 photons avec le colorant SRB extracellulaire Dans ces événements granule expériences de fusion d'insuline en réponse à une stimulation 15 mM de glucose sont enregistrées. Cercles jaunes sont des sites d'événements d'exocytose pendant 20 min d'enregistrement. Image modifiée de Do et al 2014 7.
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Discussion
Le facteur le plus critique dans l'isolement d'îlots est la perfusion initiale du pancréas; un sous perfusion du pancréas résultats avec un rendement d'îlots considérablement plus faible. D'autres facteurs affectent également la qualité de l'isolation tel que le temps de digestion et le niveau d'agitation qui peut compenser en partie au niveau de la perfusion. Par exemple, un pancréas perfusés pleinement devra être incubées à 37 ° C pendant ~ 18 min 30 sec tout en agitant doucement, à la différence d'une sous digéré pancréas peuvent nécessiter ~ 20 min digestion difficile à secouer. Le mélange de deux enzymes de digestion dans les mains permet un meilleur isolement des îlots de soit une seule. Pour la collagénase seule méthode, le temps de digestion affecte gravement le rendement d'îlots de Langerhans et des différences de temps de 30 secondes seulement peut considérablement affecter la qualité. Pour libérase seulement, le rendement est acceptable, mais sous-digestion arrive parfois, nous croyons que l'ajout de la collagénase aide à mieux digérer le tissu conjonctif.
Il ya un certain nombre d'expériences possibles qui peuvent être effectuées après les îlots ont été isolés. Îlots isolés peuvent être fixées dans le paraformaldehyde ou le methanol immédiatement après l'isolement et utilisés en coloration par immunofluorescence pour déterminer l'emplacement des 10 protéines d'intérêt. Îlots isolés peuvent être dispersées dans des cellules simples. Cela peut se faire le même jour de l'isolement d'îlots ou au bout de quelques jours de culture d'îlots de Langerhans. Les cellules individuelles sont ensuite étalées et il est de cette préparation, qui a été le pilier de techniques telles que la microscopie patch clamp et de réflexion interne totale. Dans les expériences qui mesurentla sécrétion d'insuline, ainsi que pour les cellules vivantes 2 photons imagerie, nous avons constaté que îlots nécessitent 2 jours en culture afin de fournir des données reproductibles. Ce qui se passe dans la culture ne sont pas bien compris, mais est pensé pour être une période de reprise du processus d'isolement et la digestion.
La technique deux photons présenté ici permet aux chercheurs de l'image le processus de sécrétion de l'insuline au niveau individuel de fusion des granulés à partir de plusieurs cellules à l'intérieur des îlots intacts. Nous avons constaté que le nombre d'événements granule de fusion et leur synchronisation est en accord avec les montants et le profil temporel de la sécrétion d'insuline 8. Ceci suggère que le procédé détecte la plupart des événements de fusion des granules d'insuline. Étant donné que l'entrée de colorant dans les granules de fusion est pas une méthode spécifique pour détecter l'insuline granules événements de fusion, nous avons fait de grands efforts pour mener des expériences de contrôle pour démontrer que l'insuline granule fusion dans les cellules bêta sont étudiés 7,8
Il ya un certain nombre de problèmes techniques avec le microscope 2-photon qui sont génériques à toutes les approches d'imagerie. Par exemple, nous équilibrons attentivement les facteurs opposés d'essayer d'obtenir assez de lumière dans les îlots de sorte que nous pouvons réduire le gain des détecteurs, et donc de réduire le bruit, avec mettre tant de lumière dans les îlots que nous endommagent les cellules. Dans notre système, une cellule de Pockels est utilisée pour atténuer le laser pulsé (figure 3); tous les systèmes commerciaux ont des mécanismes pour modifier l'intensité de la lumière qui tombe sur l'échantillon.
En résumé, la combinaison d'isolation soigneuse de db / db îlots et îlots entiers microscopie 2 photons offrent de nouvelles possibilités pour étudier les processus de sécrétion d'insuline et de déterminer les éléments défectueux clés dans le diabète de type 2.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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