Abstract
2型糖尿病は、過去20年の間に、2型糖尿病におけるβ細胞機能不全の役割が明確に2を確立されている。2013年382万人に影響を与える慢性疾患であり、2035年15.92億に上昇すると予想されます。研究の進歩は、膵島の単離のための方法が必要でした。野生型および糖尿病LEPR デシベル （DB / DB）マウスの両方から分離された膵島の収量と品質を向上させるためにいくつかの変更を加えて、ここでは他のグループからのプロトコルと共有多くの共通の手順を提示膵島単離のプロトコル。生細胞2光子イメージング方法は、次いで、膵島内のインスリン分泌の制御を研究するために使用することができるが提示されます。
Introduction
疾患におけるβ細胞機能不全の役割が広く3,4認識されています。このようなMIN6及びINS-1などの細胞株は、β細胞の挙動の生物学を理解するための便利なツールです。しかし、インスリン分泌の生理学的制御は、ランゲルハンス島内で起こります。これらの島は密に詰まったβ細胞の数千、ならびに血管および他の内分泌細胞型を含みます。膵島内のこの環境は、インスリン分泌に影響を与え、糖尿病において重要である可能性があります。したがって、インスリン分泌の生理学的制御、および疾患の病態生理を理解するためには、無傷島を研究することが必須です。
膵島単離
ヒト膵島ライブ及び、特に、2型糖尿病患者からのヒト膵島を得ることが困難です。また、ヒト膵島は、実験分子操作のための限られた可能性があります。研究者はそのためである使用してきました動物や2型糖尿病の動物モデルからすることができます。そのような疾患モデルは、DB / dbマウスです。これは、モデルが密接にヒトの疾患5,6と平行した表現型の進行と2型糖尿病自然突然変異です。糖尿病のdb / dbマウスの膵島単離のためにここで紹介するプロトコルは、より良好な収率、精製および強化された膵島の生存のためのいくつかの改良と、他のグループと共通の多くのステップがあります。
2光子イメージング
生細胞2光子アッセイは、ここで説明した数を定量化し、糖尿病7の多くの細胞および野生型の島8,9から単一のインスリン含有顆粒の特性を評価するために研究者を可能にします。
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Protocol
注：すべての本実験は（クイーンズランド大学、解剖学的バイオサイエンス倫理委員会によって承認された）クイーンズランド大学のローカル動物倫理手順に従って実施しました。
1.膵島単離
- 試薬調製
- 酵素の混合物
- 膵臓消化のために、リベラーゼおよびコラゲナーゼIV型の混合物を使用しています。リベラーゼTL DMEMの26ミリリットルとの5mg（低サーモリシン）1バイアル（ダルベッコ改変イーグル培地）を希釈します。
- 5mMのHEPES、0.5mMのCaCl 2を、は0.1mg / mlのDNA分解酵素とは1mg / mlウシ血清アルブミンを補充した0.5mgの/ mlであり、濃度のハンクス緩衝液中のコラゲナーゼIV型を準備します。
- すなわち 、（体積で）1 4ミリリットルのLiberase TL + 1ミリリットルのコラゲナーゼ：4の割合でリベラーゼTLとコラゲナーゼ溶液を混合。 -20℃でそれぞれ店舗を2.5ミリリットルする酵素の混合物を分取。
注：組織のインキュベーション時間は、V酵素のバッチ間のビット（30秒〜1分差）ARY。したがって、バッチ試験が必要とされ得ます。
- RPMIアイソレーションメディア
- 室温で水1LにRPMI 1640粉末の1つのバイアルを溶解し、2グラムのNaHCO 3、4.02グラムのHEPESで補います。
- 、マグネチックスターラーで混ぜ、大きな三角フラスコにRPMI分離媒体を組み合わせてNaOHでpHを7.4に調整し、フィルターを滅菌し、4℃で保存。
- RPMI培養培地
- 10％ウシ胎児血清および1％抗生物質（ 例えば 、ペニシリン100 U / mlのストレプトマイシンを100μg/ ml）を、RPMI培地を使用します。
- 酵素の混合物
- 膵島単離および培養
- 動物のいけにえ
- 地元の機関の倫理手順に従って、頸椎脱臼またはCO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げます。 70％エタノールで徹底的にマウス本体スプレー。
- 膵臓灌流
- UV字状のフラップを作るために腹部の皮膚と腹膜を通って横方向に2長いカットをSE。 、全体の腹腔を明らか腸を脇に置くと、総胆管（ 図1および図2）を明らかにする折り畳まれたティッシュペーパーによって所定の位置に肝臓を維持するために皮膚のフラップを引き上げます。その結果、外科医に向かって頭と尾離れ外科医から動物を置きます。
- 十二指腸（ 図1）に入るから注入された酵素をブロックするために十二指腸壁に膨大部で血管クランプを適用します。
注：それは注入された酵素が膵管に入ると（クランプ以上）注射部位に膵臓や逆流を灌流または十二指腸に入るかどうかを決定し、これは（クランプの下）重要なステップです。 - 共通の肝管と胆嚢管（ 図1）の接合部付近31 G針で総胆管にカニューレを挿入し、二回目の注射のための余地を残す番目の場合Eの膵臓は初めてを灌流することができません。ゆっくりと（〜10秒以上）マウス総胆管に冷たい酵素混合物の約2mlを注入。
注：クランプが正しい位置にある場合に膵臓が急速に灌流されます。 - 針が総胆管の内部にあるが、膵臓を灌流することができない場合（ すなわち 。クランプを超える場合は肝臓から少し離れてクランプを移動したり、クランプの下であれば肝臓に少しそれを下に移動）クランプ位置を調整します。
注：針が時々周囲のカプセルではなく、ダクトの内腔に入ります。注入する際、針が総胆管の内側にあるかどうかを確認するのに便利な記号は、ダクトの拡張です。膵臓が灌流するために失敗した場合、代替は、酵素混合物が予想より低い収率で膵臓の複数の部位に注入することができたです。膵臓（脾臓ローブ）の左サイトの灌流は、膵島収量の最大化のために重要です。 - 膵臓は、pした後erfused、すぐに、膵臓を除去バイアル（〜20ミリリットル、ガラス）に入れ、37℃の水浴中で〜19分間インキュベートします。
注：インキュベーション時間は、マウス株と年齢に応じてビットを変化させることができます。 - インキュベーション時間の後、〜冷分離培地を20mlを添加することによって、消化プロセスを停止します。膵臓を破壊し、滅菌50mlチューブに、通常の茶ふるい（1mmの孔径）を介して、それを注ぐ穏やかにバイアルを振ります。ブレーキをオフにして、4℃で1分間、400×gで分離培地と遠心でチューブをトップ。
- 再び分離培地でペレットを溶解した後、ブレーキをオフにして、4℃で1分間、400×gで遠心分離し、2 15ミリリットルチューブに移します。吸引上清後、ボルテックスまたはピペッティングによりチューブあたり密度勾配細胞分離媒体の6ミリリットル（ヒスト1077溶液）とよく2ペレットを混合します。そしてそっとの上にチューブの側面に分離培地の〜6ミリリットルを追加ブレーキをオフにして、4℃で15分間100×gでの密度勾配分離媒体および遠心分離機。
- 上部（分離媒体）に上清を収集し、3つの別々の皿の中央と下部（密度勾配細胞分離媒体）の層。解剖顕微鏡下でピペットを用いて、これら3つの皿で膵島を自分に都合の良いように選びます。
注：中間層は、島のほとんどが含まれています。膵島のサイズは約50〜500μmのコンパクトな構造（ 図3）として認識されています。我々は、WTマウスにおける〜200の島とされたdb / dbマウスにおける300- <100膵島を得ます。
- 膵島培養
- 島はライブ前に2日間酵素消化、5％/ 95％CO 2 / O 2、37℃、で6ミリリットルRPMI培地（10mMのグルコース）と25センチメートルシャーレで40島の文化·グループからの回復を支援するために、 2光子イメージングを-cell。毎日の培地を変更します。
- 動物のいけにえ
2。ライブセル2光子イメージング
- 試薬の調製
- 外バッファ
- 140のNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl 2を、1mMのMgCl 2、5mMのNaHCO 3および10mMのHEPESと2光子アッセイのためのナトリウムの豊富な細胞外のバッファを準備します。
- 外色素
- 2光子アッセイのために、細胞外のバッファの株式SRB 8ミリメートル、-20℃での小さなチューブやストアにアリコートを準備します。 0.8mmの作業濃度を得るために、新鮮な外のバッファにストックSRB 1:10に希釈します。
- 外バッファ
- 光子撮像
- まず、30分間3 mMのグルコースの細胞外緩衝液中で2日間培養した膵島を前インキュベートします。
注：私たちは、文化の中で2〜5日の間の島を使用しています。 - その後、顕微鏡ステージ上に搭載サーモ制御室にスライドガラスを配置します。液の漏れを防止するために、グリースを使用します。
- extracellの500μlのチャンバーをカバー異なるグルコース濃度0.8 mMのSRB（3ミリモル、6ミリモル、15ミリモル、20 mMグルコース）を含有する緩衝液ウラル。
- 次に、チャンバーの中央にプレインキュベート膵島を配置し、げっ歯類の小島で、インスリンについて免疫染色すると、ほとんどの細胞は、β細胞であることを示し、島に3-4細胞層に焦点を当てています。
注：SRBはすぐに島のすべての細胞膜を概説し、膵島は、画像への準備ができています。 - （ 例えば 、11のscanimage）60X油浸対物レンズ（NA 1.42）およびイメージングソフトウェアで2光子顕微鏡を使用して4は、典型的な顕微鏡の構成を示す図 。蛍光を有する膜880 nmのフェムト秒レーザーパルスによって励起された非透過性蛍光細胞外マーカーとしてSRBを使用して画像エキソサイトーシスのイベントは、550〜650 nmで検出しました。刺激に対する膵島の応答を記録します。
- 小さな蛍光スポットの突然の出現によって、単一の細胞外のイベントを識別（解像度10ピクセル/1; m）および関心領域（〜0.78μmの2）の上に、蛍光信号の高速立ち上がり段階で確定してください。
- まず、30分間3 mMのグルコースの細胞外緩衝液中で2日間培養した膵島を前インキュベートします。
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Representative Results
膵島収量および精製
正常な野生型マウスの場合、約200膵島が期待されます。健康な島は、明るく見える丸い形と滑らかな境界線を持っています。アンダー消化バッチが少ない膵島と腺房細胞取り付け膵島（ 図3）を有し、一方の上に消化分離バッチは通常小さく、ファジー島を持っています。より良い血糖マウスは100の下半透明の外観（と小さい島を持っているより悪い血糖マウスと比較して、より大きなより明るく膵島（最大300島を）持っていると糖尿病のdb / dbマウスは、膵島収量および外観は、疾患の進行に依存します膵島）
2光子アッセイ
2光子イメージングは、単一インスリン顆粒の融合のレベルでのインスリン分泌を測定するための間接的アッセイです。例えばグルコースまたは高カリウムなどの刺激に応答して、インスリン顆粒は、原形質膜と融合し、細胞外色素SRBは番目に入ります直径の急激な蛍光スポット〜400nmの外観をもたらす電子顆粒（ 図5）。様々な実験は、インスリン分泌の予想量と顆粒の融合事象の数を増加させる依存性グルコース用量のようなインシュリン含有顆粒の融合の測定値として2における応答細胞の一貫したサイズをこのアッセイを検証するために実施されていますβ細胞、2光子及び電子顕微鏡で測定類似の顆粒径、色素の取り込みおよびインスリン染色8の共局在化のそれと光子。
記録時間内に、刺激に応答して、すべてのエキソサイトーシスのイベントが（識別され、イベントの位置、出現時間、キス·アンド·ランまたは完全な融合のような融合事象の期間や種類を特徴としています図5、図6）。融合プロセスのこれらの特性は、評価するための価値があります 2型糖尿病のモデルにおける顆粒融合の欠陥。この方法を使用して、我々の以前の報告は、糖尿病のdb / dbの小島に欠陥が完全顆粒融合の損失ではなく、個々の顆粒融合7の動態の特性変化であることを示しています。さらに、我々は疾患におけるインスリン分泌の低下の最大の要因は、応答性細胞7の数の減少であることを示しています。
図1：クランプ及び注射部位の図は、一般的な肝管と胆嚢管の接合部付近総胆管に酵素を注入します。膵管に注入された酵素を容易にするために、血管クランプによってバルターの膨大部をクランプ。
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図2：マウスにおける射出工程 。トップ図は、バルターの膨大部で適用血管クランプで総胆管内部に針を示しています。一番下の図は、注射後リベラーゼ灌流膵臓を示しています。
図3：野生型とDB / DB孤立島の代表的な画像（A）野生型孤立した島。 （B）のdb / dbの単離された島。付着した腺房細胞（矢印）で膵島を消化アンダー（C）。 （D）小とファジー膵島（矢印）とオーバー消化小島。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4：カスタムメイド2光子顕微鏡の主な構成要素は、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5：2光子顕微鏡を用いて記録として単一インスリン顆粒融合事象の例左図は、（A）の前と後（B）のセルを表し15mMのグルコース刺激に応答して、エキソサイトーシス事象（矢印）の外観。それは細胞膜と融合するとき（C）は 、顆粒外に染料SRBの進入とSRB標識を示しています。 （D）は、エキソサイトーシスイベントの関心領域にわたって蛍光強度だけでなく、続唱を示していますこのエキソサイトーシスイベント（スケールバーは1μm）のL画像。ドゥら 2014 7から変更されたイメージ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6：外染料としてSRBと2光子顕微鏡下で、野生型および糖尿病のdb / dbの膵島の応答これらの実験では、15mMのグルコース刺激に応答したインスリン顆粒融合イベントが記録されています。黄色の円は、記録の20分の間、エキソサイトーシスのイベントのサイトです。画像は、DO ら 2014 7から変更します。
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Discussion
膵島単離の中で最も重要な要因は、膵臓の初期灌流です。かなり低い膵島収量の灌流膵臓結果の下に。他の要因も、このような消化時間と部分的に灌流のレベルを補うことができる振とうのレベルとして分離の質に影響を与えます。例えば、完全に灌流膵臓を静かに振盪しながら下には、膵臓が困難に振盪しながら〜20分の消化を必要とする可能性が消化対照的に、18分30秒〜37℃でインキュベートする必要があります。私たちの手に2つの消化酵素の混合物は、いずれか単独よりも優れ膵島単離を提供します。コラゲナーゼ唯一の方法は、消化時間は決定的に膵島収量とわずか30秒の時間差劇的に品質に影響を与える可能性に影響を与えます。歩留まりが許容可能であるが、下の消化が時々起こるリベラーゼの場合のみ、我々は、コラゲナーゼの添加がより良い結合組織を消化するのに役立つと考えています。
膵島を単離した後に行うことができる可能な多くの実験があります。単離された膵島を直ちに単離後、パラホルムアルデヒドまたはメタノールで固定し、10関心のあるタンパク質の位置を決定するために、免疫蛍光染色に使用することができます。単離された膵島は、単一細胞に分散させることができます。これは、膵島単離の同日に、または膵島培養の数日後に行われ得ます。単一細胞は、その後、プレーティングされ、それは、そのようなパッチクランプと全反射顕微鏡のような技術のための主力となっているこの製剤です。測定実験ではインスリン分泌、ならびに生細胞2光子イメージングのために、我々は、膵島が再現可能なデータを得るために培養物中で2日を必要とすることを見出しました。どの文化で起こっていることは十分に理解されていないが、分離と消化プロセスからの回復の期間であると考えられています。
ここで紹介する2光子技術は、無傷の膵島内の多くの細胞からの個々の顆粒の融合のレベルで画像にインスリン分泌プロセスを研究者を可能にします。我々は、顆粒の融合事象の数及びそれらのタイミングが量およびインスリン分泌8の時間プロファイルと一致していることを見出しました。これは、方法は、インスリン顆粒の融合事象の大部分を検出している示唆しています。定着顆粒の中の染料エントリは、我々はβ細胞において、インスリン顆粒融合を実証するために対照実験を行うために偉大な長さに行っているインスリン顆粒融合事象を検出するための具体的な方法ではないことを考えると7,8を検討されています
全てのイメージング手法に汎用されている2光子顕微鏡を用いて技術的な問題がいくつかあります。例えば、我々は慎重に私たちは、検出器のゲインを減少させるため、我々は、細胞の損傷を引き起こす膵島にあまり光を置くと、ノイズを低減することができるように膵島に十分な光を取得しようとしているの反対の要素のバランスをとります。我々のシステムでは、ポッケルスセルは、パルスレーザ（ 図3）を減衰させるために使用されます。すべての商用システムは、試料へ落ちる光の強度を変化させる機構を有しています。
要約すると、DB / Dの慎重な分離の組み合わせB膵島と全膵島インスリン分泌の過程を研究し、2型糖尿病における重要な欠陥素子を決定するために、2光子顕微鏡存在新たな機会。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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