Abstract
Type 2-diabetes er en kronisk sykdom som rammer 382 millioner mennesker i 2013, og ventes å stige til 592 millioner i 2035 1. I løpet av de siste to tiårene, rollen beta-celle dysfunksjon ved type 2 diabetes har blitt klart etablert to. Forskning fremskritt har krevd fremgangsmåter for isolering av Langerhans øyer. Protokollen fra holmen isolasjon presenteres her deler mange vanlige fremgangsmåten med protokoller fra andre grupper, med noen endringer for å forbedre utbyttet og kvaliteten på isolerte øyer fra både villtype og diabetisk Lepr db (db / db) mus. En levende celle-2-foton avbildningsmetode blir deretter presentert som kan brukes til å undersøke regulering av insulinsekresjon innenfor holmer.
Introduction
Rollen som beta-celle dysfunksjon i sykdommen har blitt anerkjent 3,4. Cellelinjer som MIN6 og INS-1 er nyttige verktøy for å forstå biologien til beta celle atferd. Imidlertid tar den fysiologiske regulering av insulinsekresjon sted innenfor de Langerhanske øyer. Disse øyer inneholder tusenvis av tettpakkede beta-celler, så vel som blodkar og andre endokrine celletyper. Dette miljøet innenfor holmen påvirker insulinsekresjon og vil trolig være viktig i diabetes. Derfor, for å forstå den fysiologiske regulering av insulinsekresjon, og patofysiologien av sykdommen, er det viktig å studere intakte øyer.
Holme isolasjon
Levende menneskelige holmer og i særdeleshet menneskelige holmer fra type 2 diabetes pasienter er vanskelig å skaffe. I tillegg menneskelige holmer har begrensede muligheter for eksperimentell molekylær manipulasjon. Forskere har derfor ansatt erlar fra dyr og dyremodeller av type 2 diabetes. En slik sykdomsmodell er den db / db mus. Dette er en spontan mutasjon som modeller type 2 diabetes med en fenotype progresjon som tett paralleller menneskelig sykdom 5,6. Protokollen presenteres her for holme isolasjon fra diabetiske db / db mus har mange trinn felles med andre grupper med noen avgrensninger for bedre avkastning, rensing og forbedret holme overlevelse.
2 foton bildebehandling
Live-celle to-foton analysen beskrevet her gjør at forskere å kvantifisere antall og vurdere egenskapene til enkeltinsulinholdige partikler fra mange celler av diabetiker 7 og villtype holmer 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle nåværende forsøkene ble utført i henhold til lokale dyreetiske prosedyrer ved University of Queensland (godkjent av University of Queensland, Anatomisk biovitenskap Ethics Committee).
1. Islet Isolation
- Reagensklargjøring
- Blanding av enzymer
- For bukspyttkjertelen fordøyelsen, bruker en blanding av liberase og collagenase type IV. Fortynne liberase TL (termolysin lav) 1 hetteglass med 5 mg med 26 ml DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium).
- Forbered kollagenase type IV i Hanks-buffer ved en konsentrasjon på 0,5 mg / ml, supplert med 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNAse og 1 mg / ml bovint serum albumin.
- Bland liberase TL og kollagenase-løsninger i et forhold på 4: 1 (på volumbasis), dvs. 4 ml liberase TL + 1 ml kollagenase. Delmengde blandingen av enzymer til 2,5 ml hver og oppbevares ved -20 ° C.
MERK: vev inkuberingstider vAry litt mellom grupper av enzymet (30 sek til 1 min forskjell). Derfor kan en satsvis test være nødvendig.
- RPMI Isolation Media
- Oppløs en ampulle av RPMI 1640 pulver i en liter vann ved RT og supplere med 2 g NaHCO3, 4,02 g HEPES.
- Kombiner RPMI isolasjonsmedier i et stort konisk kolbe, bland med magnetrører, juster til pH 7,4 med NaOH, filter sterilisere og oppbevares ved 4 ° C.
- RPMI Culture Media
- Bruke RPMI kulturmedium med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika (for eksempel penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 ug / ml).
- Blanding av enzymer
- Holmen Isolering og dyrking
- Animal Sacrifice
- Ofre mus ved halshugging eller CO 2 kvelning i henhold til lokale institusjonens etiske prosedyrer. Spray musen kroppen grundig med 70% etanol.
- Bukspyttkjertelen Perfusjons
- USE to lange snitt fra siden gjennom abdominal hud og peritoneum for å lage en V-formet klaff. Trekk klaffen av huden opp for å avdekke hele bukhulen, satt til side i tarmen, og holde leveren på plass av en foldet silkepapir for å avdekke den felles gallegang (figur 1 og 2). Sett dyret slik at hodet mot kirurgen og halen bort fra kirurgen.
- Påfør en vaskulær klemme på ampullen på tolvfingertarmen veggen for å blokkere de injiserte enzymer fra å komme inn i tolvfingertarmen (figur 1).
MERK: Dette er et viktig skritt som det avgjør om de injiserte enzymer vil gå inn i bukspyttkjertelen kanalen og perfuse bukspyttkjertelen eller reflux på injeksjonsstedet (i løpet klemme) eller gå inn i tolvfingertarmen (under klemmen). - Cannulate felles gallegang med en 31 G nål nær krysset av den felles levergang og gallegangs (figur 1), og gi rom for en ny injeksjon hvis the bukspyttkjertel unnlater å perfuse første gang. Langsomt (i løpet av ~ 10 sek) injisere ca. 2 ml kald enzymblanding i musen felles gallegang.
MERK: bukspyttkjertelen vil bli dynket raskt hvis klemmen er i riktig posisjon. - Juster klemmen posisjonen hvis nålen er inne i felles gallegang men kan ikke perfuse bukspyttkjertelen (ie., Flytte opp klemmen litt bort fra leveren hvis over klemmes eller flytte det ned litt til leveren hvis under klemt).
MERK: Nålen noen ganger går over i den omgivende kapsel i stedet for lumen av kanalen. En nyttig skilt for å kontrollere om nålen er inne i felles gallegang er utvidelse av kanalen ved injisering. Dersom bukspyttkjertelen unnlater å perfuse, er en alternativ enzymblandingen kan injiseres til flere steder i bukspyttkjertelen med lavere utbytte forventet. Perfusjon av venstre side i bukspyttkjertelen (milt lapp) er viktig for maksimering av holmen yield. - Etter bukspyttkjertelen er perfused, raskt fjerne bukspyttkjertelen, sette det inn i et hetteglass (~ 20 ml, glass) og inkuberes i ~ 19 min i en 37 ° C vannbad.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere litt avhengig av musestamme og alder. - Etter inkubasjonstiden, stanse nedbrytningsprosessen ved tilsetning av ~ 20 ml kaldt isolasjonsmedier. Hetteglasset rystes forsiktig for å forstyrre bukspyttkjertelen og helle den gjennom en vanlig te sil (pore diameter på 1 mm) inn i et sterilt 50 ml rør. Fyll opp røret med isolasjonsmateriale og sentrifuger ved 400 xg i 1 min ved 4 ° C med brems.
- Oppløs pelleten i isolasjons mediet igjen, og overføre til to 15 ml-rør, og deretter sentrifuger ved 400 x g i 1 minutt ved 4 ° C med brems. Etter aspirasjon av supernatanten, bland de to pellets godt med 6 ml densitetsgradient celleseparasjonsmedia (Histopaque 1077 løsningen) per rør ved virvling eller pipettering opp og ned. Deretter tilsett ~ 6 ml av isolasjonsmedier til siden av røret på toppen avdensitetsgradienten separasjonsmedier og sentrifuger ved 100 xg i 15 min ved 4 ° C med brems.
- Utlevering av væsken i det øvre (isolasjonsmedier), midtre og nedre (densitetsgradient celleseparasjonsmedia) laget i tre separate retter. Håndplukker holmer i disse tre retter, ved hjelp av en pipette under et dissekere mikroskop.
MERK: Det midterste laget inneholder det meste av holmer. Holmer er anerkjent som kompakte strukturer av ~ 50 til 500 mikrometer i størrelse (figur 3). Vi får ~ 200 holmer i WT mus og 300- <100 holmer i db / db mus.
- Holme Dyrking
- For å hjelpe holmer gjenopprette fra enzymoppslutning, kultur grupper av 40 holmer i en 25 cm petriskål med 6 ml RPMI kulturmedium (10 mM glucose) ved 37 ° C, 5% / 95% CO 2 / O 2 i 2 dager før den faktiske -celle to-foton imaging. Endre kulturen media daglig.
- Animal Sacrifice
2. Levende celle 2-Photon Imaging
- REAGENSFREMSTILLING
- Ekstracellulære Buffer
- Klargjør natriumrike ekstracellulære buffer for to-foton-analysen med 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3 og 10 mM HEPES.
- Ekstracellulære Dye
- For to-foton analysen, forberede lager SRB 8 mm ekstracellulære buffer, delmengde i små rør og oppbevares ved -20 ° C. Utvanne aksjen SRB 1:10 i frisk ekstracellulære buffer å få en fungerende konsentrasjon på 0,8 mm.
- Ekstracellulære Buffer
- foton Imaging
- Først, pre-inkuberes 2-dagers dyrkede øyer i 3 mM glukose ekstracellulært buffer i 30 min.
MERK: Vi bruker holmer mellom to og fem dager i kultur. - Deretter plasserer en glass-slide på termo-kontroll kammer montert på mikroskopet scenen. Bruk fett for å hindre lekkasje av oppløsningen.
- Dekk kammer med 500 mL av extracellmessig buffer inneholdende 0,8 mM SRB med forskjellige glukosekonsentrasjoner (3 mm, 6 mm, 15 mm og 20 mM glukose).
- Deretter plasserer preinkubert holme midt inn i kammeret og fokus på 3-4 cellelag til holmen der, i gnager holmer, farging for insulin, viser at de fleste celler er betaceller.
MERK: SRB vil skissere alle cellemembranen av holmen raskt og holmen er klar til bildet. - Bruk en 2-foton mikroskop med 60x oljeneddyppingsobjektivet (NA 1.42) og bildebehandling (f.eks., ScanImage 11). Figur 4 illustrerer en typisk mikros arrangement. Bilde exocytic hendelser ved hjelp av SRB som membran impermeant fluorescerende ekstracellulært markør opphisset av femtosecond laser pulser på 880 nm, med fluorescens oppdaget på 550-650 nm. Spill øyen respons på stimulering.
- Identifisere enkelt exocytic hendelser av den plutselige tilsynekomsten av en liten fluorescerende sted (oppløsning 10 piksler /1; m) og bekreft ved hurtig stigende fasen av det fluorescerende signal over et område av interesse (~ 0.78 mikrometer 2).
- Først, pre-inkuberes 2-dagers dyrkede øyer i 3 mM glukose ekstracellulært buffer i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Holmen yield og rensing
For en normal villtype mus, forventes omtrent 200 øyer. Sunn holmer ser lyse, rund og har en jevn kant. En over-fordøyd isolasjon batch har vanligvis små og fuzzy holmer mens en under-fordøyd batch har færre holmer og acinøse celler festet holmer (figur 3). For diabetiske db / db mus, holmen yield og utseende er avhengig av sykdomsutviklingen med bedre glykemisk mus har større, lysere og mer holmer (opp til 300 holmer) sammenlignet med dårligere glykemisk mus som har mindre holmer med et gjennomsiktig utseende (under 100 holmer)
2-foton assay
To-foton avbildning er en indirekte analyse for å måle insulinsekresjon ved nivået for enkelt insulin granule fusjon. Som svar på stimuli som glukose eller høyt kalium, insulin granulater fusjonere med plasmamembranen og ekstracellulære dye SRB går the granuler som resulterer i fremkomsten av en plutselig fluorescerende flekk ~ 400 nm i diameter (figur 5). Forskjellige forsøk har blitt utført for å bekrefte denne analysen som et mål på fusjon av insulin-inneholdende granuler som den doseavhengige glukosemengden øker granule fusjonsbegivenheter med den forventede mengde av insulinsekresjon, konsekvent størrelsen av cellene responderte på 2 foton med som en beta-celle, tilsvarende granulatdiameter målt ved hjelp av to foton og elektronmikroskop, av colocalization av fargestoff opptak og insulin flekker 8.
Innen den tid for opptak, er alle exocytic hendelser i respons på stimuli er identifisert og plasseringen av hendelsene, den tiden av utseende, varighet og type av fusjons hendelser som kiss-and-run eller full fusjon preget ( Figur 5, 6). Disse karakteristika for fusjonsprosessen er verdifulle for å vurdere eventuelle feil i granulat fusjon i modeller av type 2 diabetes. Vår forrige rapport ved hjelp av denne metoden viser at feilen hos diabetes db / db holmer er tap av full granule fusjon og ikke en endring i egenskapene til de kinetikk av individuelle granulat fusion 7. Videre viser vi at den største faktoren i redusert i insulinsekresjon i sykdom er en reduksjon i antallet av responsive celler 7.
Figur 1:. Et diagram av områdene av klem og injeksjon Sprøyt enzymer til felles gallegang nær krysset av den felles levergang og gallegangs. Klem ampulla av Valter av en vaskulær klemme for å lette den injiserte enzymet til pankreasgang.
2632fig2.jpg "/>
Figur 2: Injeksjonsprosessen i mus. Top Figuren illustrerer nålen inne i felles gallegang med en vaskulær klemme søkt på ampulla av Valter. Bottom Figuren viser liberase-perfusert bukspyttkjertel etter injeksjon.
Figur 3: Typiske bilder av Wild type og db / db isolerte øyer (A) Wild typen isolerte øyer.. (B) db / db isolerte øyer. (C) Under-fordøyd holmer med vedlagt akinærceller (piler). (D) Over fordøyd holmer med små og fuzzy holmer (piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. De viktigste komponentene i skreddersydde to foton mikroskop Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempel på en enkelt insulin granule fusjon arrangement som er tatt opp med to fotonmikroskopi venstre figuren representerer cellen før (A) og etter (B) utseende av en exocytic hendelse (pil) som respons på 15 mM glukose stimulering.. (C) illustrerer SRB merking med inngangen av det ekstracellulære SRB fargestoff inn i granulat når den smeltes sammen med plasmamembranen. (D) viser fluorescens intensitet over et område av interesse i en hendelse exocytic samt Sequential bilder av denne exocytic hendelse (skala bar 1 mikrometer). Bilde modifisert fra Do et al 2014 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Responser av villtype og diabetiske db / db holmer under to-foton mikroskop med SRB som den ekstracellulære fargestoff I disse eksperimentene insulin granule fusjonsbegivenheter som respons på 15 mM glukose stimulering blir registrert. Gule sirklene er områder av exocytic hendelser under 20 minutter med opptak. Bilde modifisert fra Do et al 2014 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske faktoren i holmen isolasjon er den første perfusjon i bukspyttkjertelen; en under perfusert bukspyttkjertel resulterer i en betydelig lavere holme utbytte. Andre faktorer som også påvirker isolasjonskvaliteten slik som koketiden og graden av rystelsene som delvis kunne kompensere for nivået av perfusjon. For eksempel vil en fullt perfusert bukspyttkjertel må inkuberes ved 37 ° C i ~ 18 minutter 30 sekunder under forsiktig rysting, i motsetning til en under spaltet bukspyttkjertel kan kreve ~ 20 min spaltning med hardere risting. Blandingen av to fordøyelsesenzymer i våre hender gir bedre holme isolasjon enn ett alene. For kollagenase eneste metoden, fordøyelsen tiden kritisk påvirker holmen yield og tidsforskjeller på bare 30 sek kan dramatisk påvirke kvaliteten. For liberase bare er utbyttet akseptabelt, men under-fordøyelsen skjer noen ganger, tror vi at tillegg av kollagenase bidrar til å fordøye bindevev bedre.
Det finnes en rekke mulige forsøk som kan utføres etter at bitene er blitt isolert. Isolerte øyer kan festes i paraformaldehyd eller metanol umiddelbart etter isolering og anvendt i immunofluorescens-farging for å bestemme plasseringen av proteiner av interesse 10. Isolerte øyer kan være spredt på enkeltceller. Dette kan gjøres på samme dag av holmen isolasjon eller etter et par dager med holme kultur. De enkelte celler blir deretter sådd ut, og det er dette preparatet som har vært mest for teknikker som patch clamp og total intern refleksjon mikroskopi. I forsøk som målerinsulinsekresjon, så vel som for levende celler 2-foton avbildning, er det funnet at bitene krever to dager i kultur for å gi reproduserbare data. Det som skjer i kultur er ikke godt forstått, men antas å være en periode på utvinning fra isolasjon og fordøyelsen.
Den to-foton teknikk som presenteres her muliggjør forskere å avbilde insulinsekresjonsfunksjonen prosessen på nivået av individuelle granuler fusjon fra mange celler i intakte øyer. Vi har funnet at antall granulat fusjonsbegivenheter og timingen er i samsvar med de mengder og tidsmessige profil av insulinsekresjon 8. Dette tyder på at fremgangsmåten er å detektere majoriteten av insulin granulatfusjonsbegivenheter. Gitt at fargestoff oppføring i til fikse granulater er ikke en bestemt metode for påvisning av insulin granule fusjons hendelser vi har gått langt for å gjennomføre kontroll eksperimenter for å demonstrere at insulin granulat fusjon i betacellene blir undersøkt 7,8
Det finnes en rekke tekniske problemer med to-foton mikroskop som er felles for alle avbildnings tilnærminger. For eksempel, vi nøye balansere motstridende faktorer for å prøve å få nok lys i til holmer, slik at vi kan redusere gevinsten av detektorene, og dermed redusere støy, med å sette så mye lys inn på holmene at vi forårsaker celleskade. I vårt system, er en Pockels-celle benyttes for å dempe den pulserende laser (figur 3); alle kommersielle systemer har mekanismer for å endre intensiteten av lys som faller på siden av prøven.
I sammendraget, kombinasjonen av forsiktig isolering av db / db holmer og hel-holmen to foton mikros presentere nye muligheter til å studere prosessene i insulinsekresjon og avgjøre viktige defekte elementer i type 2 diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
