Abstract
Сахарный диабет 2 типа является хроническим заболеванием, поражающим 382 млн человек в 2013 году, и, как ожидается, возрастет до 592 млн к 2035 году 1. В течение последних 2 лет, роль дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа был четко определен 2. Исследования прогресс требуется методов выделения панкреатических островков. Протокол выделения островков, представленные здесь много общих шагов с протоколами от других групп, с некоторыми изменениями, чтобы улучшить урожайность и качество отдельных островков как из дикого типа и диабетической Lepr дБ (дБ / дБ) мышей. Способ визуализации 2-фотонов живых клеток затем представлены, которые могут быть использованы для исследования контроль секреции инсулина в течение островков.
Introduction
Роль дисфункции бета-клеток при болезни была широко признана 3,4. Клеточные линии, такие как MIN6 и INS-1 являются полезными инструментами, чтобы понять биологию поведения бета-клеток. Тем не менее, физиологический контроль секреции инсулина происходит в островках Лангерганса. Эти островки содержат тысячи плотно упакованных бета-клеток, а также кровеносные сосуды и другие эндокринные типы клеток. Эта среда в островок влияет секрецию инсулина и, вероятно, будет важным при диабете. Поэтому, чтобы понять физиологический контроль секреции инсулина и патофизиологии болезни, важно, чтобы изучить интактные островки.
Изоляция Островок
Живые человеческие островки и, в частности, человека островков от пациентов с диабетом типа 2 трудно получить. Кроме того, человека островки имеют ограниченные возможности для экспериментального молекулярной манипуляции. Исследователи поэтому используется впозволяет от животных и животных моделях диабета 2 типа. Одной из таких моделей болезнь дБ / дБ мыши. Это спонтанных мутаций, что модели сахарного диабета 2 типа с прогрессированием фенотипа, что тесно параллели болезни человека 5,6. Протокол, представленные здесь для изоляции островок с сахарным диабетом дБ / дБ мышей имеет много шагов, общих с другими группами с некоторыми уточнениями для лучшего урожая, очистки и расширения выживания островков.
Изображения 2 фотона
Живых клеток 2-фотон анализа, описанного здесь позволяет исследователям определить число и оценить характеристики отдельных инсулина гранул, содержащих от многих клетках диабетическая 7 и дикого типа островков 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все присутствующие были проведены эксперименты в соответствии с местными этики животных процедур в Университете Квинсленда (утвержденных в Университете Квинсленда, комитета по этике биологических наук Анатомические).
1. Островок Изоляция
- Подготовка реагентов
- Смесь ферментов
- Для поджелудочной пищеварение, использовать смесь Liberase и коллагеназы типа IV. Развести Liberase TL (низкий) термолизин 1 флакона 5 мг с 26 мл DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко).
- Подготовьте коллагеназы типа IV в буфере Хенкса до концентрации 0,5 мг / мл, с добавлением 5 мМ HEPES, 0,5 мМ CaCl 2, 0,1 мг / мл ДНКазы и 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина.
- Смешайте Liberase TL и коллагеназу решения в соотношении 4: 1 (по объему), т.е., 4 мл Liberase TL + 1 мл коллагеназы. Алиготе смесь ферментов 2,5 мл каждая и хранить при температуре -20 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации ткани VАры немного между партиями фермента (разница 30 сек до 1 мин). Таким образом, пробная партия может потребоваться.
- RPMI Выделение СМИ
- Растворите один флакон RPMI 1640 порошка в 1 л воды при комнатной температуре и дополнить 2 г NaHCO 3, 4,02 г HEPES.
- Смешайте изоляции носитель RPMI в большом коническую колбу, смешать с магнитной мешалкой, доведения рН до 7,4 с помощью NaOH, фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
- RPMI Культура Медиа
- Использование культуральной среды RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотиков (т.е., пенициллин 100 ед / мл, стрептомицин 100 мкг / мл).
- Смесь ферментов
- Островок изоляции и культивирования
- Жертвоприношение животных
- Жертвоприношение мышей от рака шейки дислокации или CO 2 удушья в соответствии с процедурами, этики местного учреждения. Спрей тело мыши тщательно с 70% этанола.
- Поджелудочной перфузии
- USE 2 длинных сокращений сбоку через кожу живота и брюшину, чтобы сделать V-образный клапан. Потяните лоскут кожи до раскрыть всю полость живота, отложить в сторону кишечника и держать печень в месте сложенном папиросной бумаги, чтобы раскрыть общий желчный проток (рис 1 и 2). Положите животное так, чтобы голова к хирургу и хвост от хирурга.
- Нанесите сосудистой зажим на ампулы на стене двенадцатиперстной блокировать ферменты инъекционные въезд в двенадцатиперстную кишку (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг, поскольку он определяет, будет ли введенные ферменты идти в проток поджелудочной железы и заливать поджелудочной железы или рефлюкс в месте инъекции (более зажим) или перейти в двенадцатиперстной кишке (при зажиме). - Иглу общего желчного протока с 31 G иглой недалеко от перекрестка общего печеночного протока и пузырного протока (рис 1) и оставить место для второй инъекции, если йе поджелудочная железа не заливать в первый раз. Медленно (в течение ~ 10 сек) вводят около 2 мл холодной смеси ферментов в мыши общий желчный проток.
ПРИМЕЧАНИЕ: поджелудочная железа будет озарен быстро, если зажим в нужном положении. - Отрегулируйте положение зажима, если игла находится внутри общего желчного протока, но не может заливать поджелудочной железы (т.е.., Двигаться вверх зажим немного от печени, если в течение зажат или переместить его немного в печени, если под зажат).
Примечание: Игла иногда переходит в окружающей капсулу, а не в просвет протока. Полезно знак, чтобы проверить игла находится внутри общего желчного протока является расширение протока при введении. Если поджелудочная железа не заливать, альтернативой является смесь ферментов может быть введен в нескольких участках поджелудочной железы с низким выходом ожидаемого. Перфузии левого участка поджелудочной железы (селезенки доли) имеет важное значение для максимизации выхода островков. - После поджелудочной железы рerfused, быстро удалить поджелудочную железу, положить его в пробирку (~ 20 мл, стеклянный) и инкубировать в течение ~ 19 мин в водяной бане при 37 °.
ПРИМЕЧАНИЕ: время инкубации может немного отличаться в зависимости от штамма мыши и возраста. - После инкубационного периода, остановить процесс пищеварения, добавляя ~ 20 мл холодной изоляции сред. Встряхнуть флакон нежно сорвать поджелудочную железу и залить его через обычный чай сито (диаметр пор 1 мм) в стерильную пробирку 50 мл. Пополните трубку с изолирующими средствами массовой информации и центрифуги при 400 мкг в течение 1 мин при 4 ° С с тормозом выкл.
- Растворить осадок в изоляции сред снова и передать до двух 15 мл пробирки, затем центрифуги при 400 мкг в течение 1 мин при 4 ° С с вынул. После аспирации супернатант, смешайте две гранулы хорошо с 6 мл разделения градиента плотности клеток СМИ (Histopaque 1077 раствор) в трубке встряхиванием или пипетки вверх и вниз. Затем осторожно добавить ~ 6 мл изоляции сред к стороне трубки сверхуСМИ разделения градиент плотности и центрифуги при 100 мкг в течение 15 мин при 4 ° С с тормозом выкл.
- Соберите супернатант в верхнем (изоляции), средств массовой информации средний и нижний (градиент плотности клеток СМИ разделения) слой в 3 отдельных блюд. Handpick островки в этих 3 блюд, с помощью пипетки при вскрытии микроскопом.
Примечание: средний слой содержит большую часть островков. Островки признаются компактных структур ~ 50 до 500 мкм в размере (рисунок 3). Мы получим ~ 200 островков у мышей дикого и 300- <100 островков в БД / DB мышей.
- Островок Культивирование
- Чтобы помочь островки восстановиться после ферментативного расщепления, культуры группы 40 островков в 25 см чашки Петри с 6 мл культуральной среды RPMI (10 мМ глюкозы) при 37 ° С, 5% / 95% СО 2 / О 2 в течение 2 дней перед живой -клетка 2-Фотон изображений. Изменение питательных сред в день.
- Жертвоприношение животных
2, Живая ячейка 2-Фотон изображений
- Подготовка реагентов
- Внеклеточной буфера
- Подготовка натрия богатых внеклеточного буфера для 2-фотонного анализа с 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ NaHCO 3 и 10 мм HEPES.
- Внеклеточной красителя
- Для 2-фотонного анализа, подготовки акций SRB 8 мм внеклеточного буфера, Алиготе в трубочки и хранить при температуре -20 ° C. Развести фондовом SRB 1:10 в свежем внеклеточного буфера, чтобы получить рабочую концентрацию 0,8 мм.
- Внеклеточной буфера
- Фотон изображений
- Во-первых, предварительно инкубируют 2-дневные культивируемые островки в 3 мМ глюкозы внеклеточного буфера в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем островки между 2 и 5 дней в культуре. - Затем поместите предметное стекло на термо-контрольной камеры установленного на столике микроскопа. Использование смазки, чтобы предотвратить утечку раствора.
- Обложка камеру с 500 мкл extracellулар буфер, содержащий 0,8 мМ SRB с различными концентрациями глюкозы (3 мм, 6 мм, 15 мм и 20 мМ глюкозы).
- Далее, поместите предварительно инкубировали островок в середине камеры и фокус на 3-4 слоев клеток в островке, где, в грызунов островков, иммунным к инсулину показывает, что большинство клеток в бета-клетки.
Примечание: SRB будут изложены все клеточную мембрану островок быстро и островок готов изображения. - Используйте 2-фотонной микроскопии с 60X иммерсионным объективом (NA 1,42) и изображений (например., ScanImage 11). Рисунок 4 иллюстрирует типичное расположение микроскопии. Image exocytic события, используя SRB в качестве мембраны impermeant флуоресцентный маркер внеклеточного возбуждается фемтосекундных лазерных импульсов на 880 нм, с флуоресценции обнаружена на 550-650 нм. Запишите островковых ответов на стимуляцию.
- Определить отдельные exocytic события внезапным появлением небольшого флуоресцентного месте (разрешение 10 пикселей /1; м) и подтвердить с помощью быстрый рост фазы флуоресцентного сигнала по области интереса (~ 0,78 мкм 2).
- Во-первых, предварительно инкубируют 2-дневные культивируемые островки в 3 мМ глюкозы внеклеточного буфера в течение 30 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Островок выход и очистка
Для нормальной мыши дикого типа, около 200 островков, как ожидается. Здоровые островки выглядят ярко, круглой формы и иметь гладкую границу. Над усваивается изоляция партия, как правило, имеет небольшие островки и нечеткие, а под усваивается партия имеет меньше островков и островков клеток прилагается ацинарные (рисунок 3). Для диабетических дБ / дБ мышей, выход островок и внешний вид зависит от прогрессирования заболевания с лучшими гликемический мыши имеют большие, яркие и больше островков (до 300 островков) по сравнению с худшей гликемическим мышей, которые имеют меньшие островки с полупрозрачной появления (при 100 островки)
2-фотон анализ
Изображения 2-фотон косвенным анализа для измерения секреции инсулина на уровне одного инсулина гранул слияния. В ответ на стимулы, такие как глюкоза или высокой калия, гранулы инсулина сливаются с плазматической мембраной и SRB краситель поступает внеклеточный йе гранулы, которые приводит к появлению внезапной флуоресцентного пятна ~ 400 нм в диаметре (Рисунок 5). Различные эксперименты были проведены для проверки этого анализа в качестве измерения синтеза инсулина гранул, содержащих как дозы глюкозы зависит от увеличения количества событий гранул слитых с ожидаемым количеством секреции инсулина, последовательного размера ответы клеток в 2 фотонов с тем из бета-клеток, подобный диаметр гранул измеряется с помощью фотона 2 и электронного микроскопа, колокализация поглощение красителя и инсулина окрашивания 8.
В момент записи, все exocytic события в ответ на стимул идентифицированы и место событий, время появления, продолжительности и типа событий термоядерных как поцелуй-и-счете или полной слияния характеризуются ( На рисунке 5, 6). Эти характеристики процесса синтеза являются ценными для оценки любой дефект в гранулы слияния в моделях диабета 2 типа. Наш предыдущий отчет, используя этот метод показывает, что дефект в диабетических дБ / дБ островков потери полного слияния гранул, а не изменение характеристик кинетики индивидуального гранул слияния 7. Кроме того, мы показываем, что самый важный фактор в снизились в секреции инсулина при болезни является снижение количества чувствительных клеток 7.
Рисунок 1:. Схема сайтах зажима и инъекций Вводят ферменты в общий желчный проток недалеко от перекрестка общего печеночного протока и пузырного протока. Зажмите ампула Вальтера по сосудистый зажим для облегчения вводят фермент в проток поджелудочной железы.
2632fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Процесс впрыска у мышей. Топ рисунке иглу внутри общего желчного протока с сосудистый зажим применяется на ампуле Вальтера. Нижняя цифра показывает Liberase-перфузии поджелудочной железы после инъекции.
Рисунок 3: Типичные изображения дикого типа и дБ / дБ изолированных островков (А) изолированных островков дикого типа.. (B), дБ / дБ, изолированные островки. (С) В усваивается островки с навесными ацинарные клеток (стрелки). (D), более усваивается островки с малого и нечеткие островков (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Основные компоненты заказ 2 фотона микроскопом Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Пример одного события к инсулину гранул синтеза в качестве записанного с 2 фотона микроскопии слева цифра представляет собой ячейку до (А) и после (б) появление exocytic события (стрелка) в ответ на 15 мм стимуляции глюкозы.. (С) иллюстрирует SRB маркировку с внесением в SRB внеклеточной красителя в гранулы, когда она сливается с плазматической мембраной. (D) показывает интенсивность флуоресценции по области интереса в случае exocytic а также sequentiaл образы этой exocytic случае (масштаб бар 1 мкм). Редактировался Do др 2014 7 Изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рис. 6: Ответы дикого типа и диабетических дБ / дБ островков под 2-фотонного микроскопа с SRB как внеклеточный краситель в этих экспериментах гранулы инсулина событий синтеза в ответ на стимуляцию глюкозой 15 мм записаны. Желтые круги сайтах exocytic событий в течение 20 мин записи. Изображение редактировался ли соавт 2014 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным фактором в изоляции островков является начальным перфузии поджелудочной железы; под перфузии поджелудочной железы приводит к значительно более низким выходом островков. Другие факторы также влияют на качество изоляции, таких как время варки и уровнем встряхивании, которые могут частично компенсировать уровень перфузии. Например, полностью перфузии поджелудочной железы необходимо будет инкубировали при 37 ° С в течение ~ 18 мин 30 сек при встряхивании осторожно, в отличие под переваривается поджелудочной железы может потребовать ~ 20 мин труднее пищеварение с встряхивании. Смесь из двух ферментов пищеварения в руках обеспечивает лучшую изоляцию островков, чем либо только один. Для коллагеназы только метод, время переваривания критически влияет на выход островок и разницу во времени только 30 секунд может резко повлиять на качество. Для Liberase только выход является приемлемым, но под пищеварения иногда случается, мы считаем, что добавление коллагеназы помогает переваривать соединительной ткани лучше.
Есть целый ряд возможных экспериментов, которые могут быть выполнены после того, как островки были выделены. Изолированные островки могут быть зафиксированы в параформальдегида или метанола сразу же после выделения и используется в иммунофлуоресцентного чтобы определить местоположение интерес белков 10. Изолированные островки могут быть диспергированы в отдельные клетки с. Это может быть сделано в тот же день изоляции островок или через несколько дней островок культуры. Отдельные клетки затем высевали, и именно это препарат, который был основой для методов, таких как патч зажима и полного внутреннего отражения микроскопии. В экспериментах, измеряющихсекреции инсулина, а также для живых клеток изображений 2-фотонов, мы обнаружили, что островки требуют 2 дней в культуре, чтобы дать воспроизводимые данные. То, что происходит в культуре не очень хорошо понимал, но думал, что будет период восстановления от процесса выделения и пищеварения.
Техника 2-фотон, представленные здесь позволяет исследователям изображение процесса секреторную инсулина на уровне отдельной гранулы слияния с многих клеток в неповрежденных островков. Мы обнаружили, что количество гранул синтеза событий и их сроках согласуется с суммами и временной профиль секреции инсулина 8. Это предполагает метод обнаружения большинство событий синтеза инсулина гранул. Учитывая, что вступление в краситель, чтобы гранул взрывателей не конкретный метод для обнаружения инсулина гранул фьюжн события мы пошли на многое, чтобы проводить контрольные эксперименты, чтобы продемонстрировать, что инсулин гранул слияние в бета-клетках изучаются 7,8
Есть ряд технических проблем, связанных с 2-фотонного микроскопа, что являются общими для всех подходов изображений. Например, мы тщательно сбалансировать противоположные факторы в попытке получить достаточно света, чтобы островков, так что мы можем уменьшить коэффициент усиления детекторов, и, следовательно, снизить уровень шума, с вводом столько света, чтобы островков, что мы вызывающих повреждение клеток. В нашей системе, клетки Покельса используется для ослабления импульсного лазера (рисунок 3); Все коммерческие системы имеют механизмы для изменения интенсивности света, который падает на образец.
Таким образом, сочетание тщательного выделения дБ / дб островки и вся-островок 2 фотона микроскопии открывают новые возможности для изучения процессов секреции инсулина и определить ключевые элементы в дефектных диабета 2 типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TL 5 mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1x) 500 ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100 ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500 ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
- Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
- Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
- Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
- Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
- Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
- Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).
