Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Lepr Published: May 11, 2015 doi: 10.3791/52632

Abstract

La diabetes tipo 2 es una enfermedad crónica que afecta a 382 millones de personas en 2013, y se espera que aumente a 592 millones en 2035 1. Durante las últimas 2 décadas, el papel de la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 se ha establecido claramente 2. Progreso de la investigación ha requerido métodos para el aislamiento de islotes pancreáticos. El protocolo del aislamiento de islotes presenta aquí comparte muchos pasos comunes con protocolos de otros grupos, con algunas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes aislados de tanto el tipo silvestre y db Lepr diabéticos (db / db) ratones. Un método de formación de imágenes 2-fotón de células vivas se presenta entonces que se puede utilizar para investigar el control de la secreción de insulina en islotes.

Introduction

El papel de la disfunción de las células beta en la enfermedad ha sido ampliamente reconocida 3,4. Las líneas celulares como el MIN6 e INS-1 son herramientas útiles para entender la biología del comportamiento de las células beta. Sin embargo, el control fisiológico de la secreción de insulina tiene lugar dentro de los islotes de Langerhans. Estos islotes contienen miles de células beta apretadas, así como los vasos sanguíneos y otros tipos de células endocrinas. Este entorno dentro del islote influye en la secreción de insulina y es probable que sea importante en la diabetes. Por lo tanto, para entender el control fisiológico de la secreción de insulina, y la fisiopatología de la enfermedad, es esencial para estudiar islotes intactos.

Aislamiento Islet

Islotes humanos vivos y, en particular, islotes humanos de los pacientes con diabetes tipo 2 son difíciles de obtener. Además, islotes humanos tienen limitadas posibilidades de manipulación molecular experimental. Por lo tanto, los investigadores han empleado esdeja de animales y modelos animales de diabetes tipo 2. Uno de estos modelos de la enfermedad es el ratón db / db. Esta es una mutación espontánea que los modelos de la diabetes tipo 2 con una progresión fenotipo que se asemeja mucho a la enfermedad humana 5,6. El protocolo que aquí se presenta para el aislamiento de los islotes de los ratones db / db diabéticos tiene muchos pasos en común con otros grupos con algunas opciones de mejor rendimiento, depuración y mejora la supervivencia de los islotes.

Imagen 2 de fotones

El ensayo de 2 fotones de células vivas se describe aquí permite a los investigadores para cuantificar el número y evaluar las características de los gránulos individuales que contiene insulina de muchas células del diabético 7 y de tipo salvaje islotes 8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: Todos los experimentos actuales se realizaron de acuerdo con los procedimientos de ética locales de animales de la Universidad de Queensland (aprobado por la Universidad de Queensland, Comité de Ética Biosciences anatómica).

1. Aislamiento Islet

  1. Preparación de los reactivos
    1. Mezcla de enzimas
      1. Para la digestión pancreática, utilizar una mezcla de Liberase y colagenasa tipo IV. Diluir Liberase TL (termolisina bajo) 1 vial de 5 mg con 26 ml de DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco).
      2. Preparar colagenasa tipo IV en tampón de Hank a una concentración de 0,5 mg / ml, complementado con HEPES 5 mM, 0,5 mM CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNasa y 1 mg / ml de albúmina de suero bovino.
      3. Mezclar la TL Liberase y soluciones de colagenasa en una proporción de 4: 1 (por volumen), es decir, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenasa. Alícuota la mezcla de enzimas de 2,5 ml cada una y se almacena a -20 ° C.
        NOTA: Los tiempos de incubación del tejido vary un poco entre lotes de enzima (30 seg a 1 min diferencia). Por lo tanto, puede ser necesario un ensayo de lote.
    2. RPMI Aislamiento Medios
      1. Disolver un vial de RPMI 1640 en polvo en 1 L de agua a RT y complementar con 2 g de NaHCO 3, 4,02 g de HEPES.
      2. Combine los medios de aislamiento RPMI en un matraz cónico grande, mezcla con un agitador magnético, se ajusta a pH 7,4 con NaOH, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
    3. RPMI Medios de Cultivo
    4. Usar medios de cultivo RPMI, con suero bovino fetal al 10% y 1% de antibióticos (es decir, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 g / ml).
  2. Aislamiento y cultivo Islet
    1. Sacrificio de Animales
      1. Sacrificar los ratones por dislocación cervical o asfixia de CO 2 de acuerdo a los procedimientos de ética de la institución local. Pulverizar el cuerpo del ratón a fondo con etanol al 70%.
    2. Perfusión de páncreas
      1. USE 2 cortes largos lateralmente a través de la piel abdominal y el peritoneo para hacer una solapa en forma de V. Tire de la solapa de la piel hacia arriba para descubrir toda la cavidad abdominal, dejar a un lado el intestino y mantener el hígado en su lugar por un pañuelo de papel doblado para revelar el conducto biliar común (Figuras 1 y 2). Ponga el animal de modo que la cabeza hacia el cirujano y la cola lejos de la cirujano.
      2. Aplicar una pinza vascular en la ampolla en la pared duodeno para bloquear las enzimas inyectadas de entrar en el duodeno (Figura 1).
        NOTA: Este es un paso importante, ya que determina si las enzimas inyectadas voy a entrar en el conducto pancreático y perfundir el páncreas o el reflujo de la zona de inyección (más de pinza) o entrar en el duodeno (menores de pinza).
      3. Canular la vía biliar común con una aguja de calibre 31 cerca de la unión del conducto hepático común y el conducto cístico (Figura 1) y dejar espacio para una segunda inyección si ªe páncreas no para perfundir la primera vez. Lentamente (más de ~ 10 seg) inyectar unos 2 ml de mezcla de enzimas fría en el ratón del conducto biliar común.
        NOTA: El páncreas se perfundieron rápidamente si la pinza está en la posición correcta.
      4. Ajuste la posición de la abrazadera si la aguja está dentro del conducto biliar común, pero no puede perfundir el páncreas (es decir., Ascender en la pinza un poco lejos del hígado si sobre sujetado o moverlo un poco al hígado si es menor sujetado).
        NOTA: La aguja a veces entra en la cápsula que rodea en lugar de la luz del conducto. Un signo útil para comprobar si la aguja está dentro del conducto biliar común es la dilatación del conducto cuando se inyecte. Si el páncreas no para perfundir, una alternativa es la mezcla de enzima podría ser inyectado a múltiples sitios de páncreas con menor rendimiento esperado. La perfusión del sitio izquierda del páncreas (el lóbulo esplénica) es importante para la maximización del rendimiento de los islotes.
      5. Después de que el páncreas es perfused, eliminar rápidamente el páncreas, lo puso en un vial (~ 20 ml, vidrio) y se incuba durante ~ 19 minutos en un baño de agua 37 ° C.
        NOTA: El tiempo de incubación puede variar un poco dependiendo de la cepa de ratón y la edad.
      6. Después del tiempo de incubación, detener el proceso de la digestión mediante la adición de ~ 20 ml de medios de aislamiento frío. Agitar el vial suavemente para interrumpir el páncreas y se vierte a través de un tamiz de té normal (diámetro de poro de 1 mm) en un tubo de 50 ml estéril. Rellenar el tubo con medios de aislamiento y se centrifuga a 400 xg durante 1 min a 4 ° C con freno de apagado.
      7. Disolver el precipitado en los medios de aislamiento de nuevo y transferir a dos tubos de 15 ml y centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C con freno de apagado. Después de la aspiración del sobrenadante, mezclar los dos gránulos bien con 6 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad (Histopaque solución 1,077) por tubo mediante agitación con vórtex o pipeteando arriba y abajo. A continuación, añadir suavemente ~ 6 ml de los medios de aislamiento para el lado del tubo en la parte superior delos medios de separación de gradiente de densidad y centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C con freno off.
      8. Recoger el sobrenadante en la parte superior (medios de aislamiento), medio e inferior (densidad medios de separación celular gradiente) de la capa 3 en platos separados. Handpick los islotes en estos 3 platos, usando una pipeta en un microscopio de disección.
        NOTA: La capa media contiene la mayoría de los islotes. Los islotes se reconocen como estructuras compactas de ~ 50 a 500 micras de tamaño (Figura 3). Obtenemos ~ 200 islotes en ratones WT y 300- <100 islotes en ratones db / db.
    3. El cultivo Islet
      1. Para ayudar a los islotes se recuperan de la digestión enzimática, grupos culturales de 40 islotes en un 25 cm placa de Petri con 6 ml de RPMI cultura de los medios (10 mM glucosa) a 37 ° C, 5% / 95% de CO 2 / O 2 durante 2 días antes en directo las células beta de imágenes 2-fotón. Cambie el medio de cultivo a diario.

2. Vivo Cell 2-Photon imágenes

  1. Preparación de los reactivos
    1. Extracelular Buffer
      1. Preparar el tampón extracelular de sodio rico para el ensayo 2-fotón con NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, 5 mM NaHCO 3 y 10 mM HEPES.
    2. Extracelular Tinte
      1. Para el ensayo de 2 fotones, preparar social SRB 8 mM en tampón extracelular, alícuota en pequeños tubos y almacenar a -20 ° C. Diluir el Stock SRB 1:10 en tampón extracelular fresco para obtener una concentración de trabajo de 0,8 mM.
  2. Imágenes de fotones
    1. En primer lugar, pre-incubar 2-día islotes cultivados en 3 mM de tampón extracelular de glucosa durante 30 min.
      NOTA: Nosotros usamos islotes entre 2 y 5 días en cultivo.
    2. Luego, colocar una lámina de vidrio en la cámara de control térmico montado en la platina del microscopio. Utilice grasa para evitar la filtración de solución.
    3. Cubra la cámara con 500 l de extracelulartampón ular que contiene 0,8 mM SRB con diferentes concentraciones de glucosa (3 mm, 6 mm, 15 mm y glucosa 20 mM).
    4. A continuación, colocar el islote pre-incubado en el centro de la cámara y se centran en 3-4 capas de células en el islote donde, en los islotes de roedores, la inmunotinción para la insulina muestra que la mayoría de las células son células beta.
      NOTA: El SRB será delinear toda la membrana de la célula del islote de forma rápida y el islote está listo para la imagen.
    5. Utilice un microscopio 2-fotón con un objetivo de inmersión en aceite 60X (NA 1,42) y el software de formación de imágenes (por ejemplo., Scanimage 11). La figura 4 ilustra una disposición típica microscopía. Imagen eventos exocytic utilizando SRB como una membrana impermeable fluorescente marcador extracelular excitados por pulsos láser de femtosegundo a 880 nm, con fluorescencia detectados a 550-650 nm. Anote las respuestas de los islotes a la estimulación.
    6. Identificar eventos exocytic individuales por la aparición repentina de una pequeña mancha fluorescente (resolución de 10 píxeles /1; m) y confirmar con la fase de rápido aumento de la señal fluorescente sobre una región de interés (~ 0,78 m 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rendimiento de los islotes y purificación

Para un tipo salvaje ratón normal, se espera que unos 200 islotes. Islotes sanos mirar brillante, forma redonda y tienen un borde liso. Un lote aislamiento digerido sobre-usualmente tiene islotes pequeños y difusos mientras que un lote bajo-digerido tiene menos islotes y células acinares adjunto islotes (Figura 3). Para los ratones db / db diabéticos, el rendimiento de los islotes y la apariencia depende de la progresión de la enfermedad con mejores ratones glucémico tienen grandes islotes, más brillantes y más (hasta 300 islotes) en comparación con los ratones glucémico peor que tienen islotes más pequeños con un aspecto translúcido (por debajo de 100 islotes)

Ensayo 2-fotón

Formación de imágenes 2-fotón es un ensayo indirecto para medir la secreción de insulina en el nivel de fusión único insulina gránulo. En respuesta a estímulos tales como glucosa o niveles altos de potasio, los gránulos de insulina se fusionan con la membrana plasmática y el colorante SRB extracelular entra THe gránulos que se traduce en la aparición de una repentina fluorescente punto de ~ 400 nm de diámetro (Figura 5). Varios experimentos han sido llevados a cabo para validar este ensayo como una medida de la fusión de los gránulos que contienen insulina como la dosis de glucosa dependiente de aumento del número de eventos de fusión de gránulos con la cantidad esperada de la secreción de insulina, el tamaño coherente de las células respondieron en el 2 fotón con la de una célula beta, el diámetro de gránulo similares medida por el 2 fotón y el microscopio electrónico, la colocalización de la absorción de colorante y la insulina tinción 8.

Dentro de la hora de la grabación, todos los eventos exocytic en respuesta al estímulo se identifican y la ubicación de los eventos, el tiempo de la aparición, la duración y tipo de los eventos de fusión como beso y fuga o fusión completa se caracterizan ( Figura 5, 6). Estas características del proceso de fusión son valiosos para la evaluación de cualquier defecto en la fusión de gránulos en modelos de diabetes tipo 2. Nuestro informe anterior utilizando este método demuestra que el defecto en islotes diabéticos db / db es la pérdida de la fusión de gránulos completa y no un cambio en las características de la cinética de la fusión de los gránulos individuales 7. Además, se muestra que el factor más importante en la disminución en la secreción de insulina en la enfermedad es una reducción en el número de células sensibles a 7.

Figura 1
Figura 1:. Un diagrama de los sitios de fijación e inyección Inyectar las enzimas en el conducto biliar común cerca de la unión del conducto hepático común y el conducto cístico. Abrazadera de la ampolla de Valter por una pinza vascular para facilitar la enzima inyectada para el conducto pancreático.

2632fig2.jpg "/>
Figura 2: El proceso de inyección en los ratones. Cifra superior ilustra la aguja en el interior del conducto biliar común con una pinza vascular aplicada a la ampolla de Valter. Cifra inferior muestra el páncreas Liberase-perfusión después de la inyección.

Figura 3
Figura 3: imágenes típicas de tipo salvaje y los islotes aislados db / db (A) islotes de tipo salvaje aislados.. (B) db / db islotes aislados. (C) Bajo-digerido islotes con células acinares adjuntos (flechas). (D) Más de digerido islotes con islotes pequeños y difusos (flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 Figura 4:. Los principales componentes del microscopio 2 fotones a medida Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Ejemplo de un solo evento de fusión de insulina gránulo como se registra con microscopía 2 fotón figura de la izquierda representa la célula antes (A) y después (B) la aparición de un evento exocytic (flecha) en respuesta a 15 mM estimulación de glucosa.. (C) ilustra el etiquetado SRB con la entrada de la SRB tinte extracelular en el gránulo cuando se fusiona con la membrana plasmática. (D) muestra la intensidad de fluorescencia sobre una región de interés de un evento exocytic así como la sequential imágenes de este evento exocítica (barra de escala 1 micras). Imagen modificada de Do et al 2014 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6:. Respuestas de los islotes de tipo salvaje y db / db diabéticos bajo el microscopio 2-fotón con SRB como el colorante extracelular En estos eventos de fusión gránulo experimentos de insulina en respuesta a la estimulación de glucosa 15 mM se registran. Círculos amarillos son los sitios de los eventos exocytic durante 20 minutos de grabación. Imagen modificada de Do et al 2014 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El factor más crítico en el aislamiento de islotes es la perfusión inicial del páncreas; un bajo perfundido páncreas resultados con un rendimiento de islotes considerablemente menor. Otros factores también afectan a la calidad de aislamiento tales como el tiempo de digestión y el nivel de agitación que podría compensar en parte el nivel de perfusión. Por ejemplo, tendrá que ser incubaron a 37 ° C durante ~ 18 min 30 sec mientras se agitaba suavemente, en un contraste bajo digerido páncreas pueden requerir ~ 20 min más difícil digestión con agitación un páncreas completamente perfundido. La mezcla de dos enzimas de digestión en nuestras manos proporciona un mejor aislamiento de islotes que uno solo. Para el único método de colagenasa, el tiempo de digestión afecta gravemente el rendimiento de los islotes y las diferencias de tiempo de tan sólo 30 segundos puede afectar drásticamente la calidad. Para Liberase solamente, el rendimiento es aceptable pero bajo-digestión sucede a veces, creemos que la adición de colagenasa ayuda a digerir el tejido conectivo mejor.

Hay una serie de posibles experimentos que se pueden realizar después de que se han aislado los islotes. Islotes aislados se pueden fijar en paraformaldehído o metanol inmediatamente después del aislamiento y utilizados en la tinción de inmunofluorescencia para determinar la ubicación de proteínas de interés 10. Islotes aislados se pueden dispersar en a células individuales. Esto se puede hacer en el mismo día de aislamiento de islotes o después de unos pocos días de cultivo de los islotes. Las células individuales se sembraron a cabo y es esta preparación que ha sido el pilar para técnicas tales como patch clamp y el total de microscopía de reflexión interna. En experimentos que midenla secreción de insulina, así como para la formación de imágenes de células vivas-2-fotón, hemos encontrado que los islotes requieren 2 días en cultivo con el fin de dar datos reproducibles. Lo que está ocurriendo en la cultura no es bien entendido, pero se piensa que es un período de recuperación del proceso de aislamiento y la digestión.

La técnica de 2 fotones que aquí se presenta permite a los investigadores a la imagen el proceso de secreción de insulina en el nivel de la fusión de gránulos individuales de muchas células dentro de islotes intactos. Hemos encontrado que el número de eventos de fusión de gránulos y su sincronización es consistente con las cantidades y el perfil temporal de la secreción de insulina 8. Esto sugiere que el método es la detección de la mayoría de los eventos de fusión de insulina gránulo. Teniendo en cuenta que la entrada colorante en los gránulos de fusión no es un método específico para la detección de eventos de fusión de los gránulos de insulina que hemos hecho grandes esfuerzos para llevar a cabo experimentos de control para demostrar que la fusión de insulina de gránulos en las células beta se están estudiando 7,8

Hay una serie de problemas técnicos con el microscopio de 2 fotones que son genéricos para todos los enfoques de formación de imágenes. Por ejemplo, podemos equilibrar cuidadosamente los factores de oposición de tratar de obtener suficiente luz en los islotes de modo que podamos reducir la ganancia de los detectores, y por lo tanto reducir el ruido, con poner tanta luz en los islotes que causan daño celular. En nuestro sistema, una célula Pockels se utiliza para atenuar el láser pulsado (Figura 3); todos los sistemas comerciales tienen mecanismos para alterar la intensidad de la luz que cae sobre la muestra.

En resumen, la combinación de cuidado aislamiento de db / db islotes y todo el islote de microscopía 2 fotones presentan nuevas oportunidades para estudiar los procesos de secreción de insulina y determinar los elementos defectuosos clave en la diabetes tipo 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TL 5 mg Roche -5401020001
Collagenase type IV-1g Gibco-Life Technologies 17104-019
Histopaque 1077 500 ml Sigma Aldrich 10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1L Sigma Aldrich R1383 to prepare isolation media
RPMI 1640 (1x) 500 ml Gibco-Life Technologies 21870-076 to prepare cultured media
Penicillin-Streptomycin 100 ml Gibco-Life Technologies 15140-122 to prepare cultured media 
Fetal bovine serum 500 ml Gibco-Life Technologies 10099-141 to prepare cultured media
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco-Life Technologies 11966-025 to dilute the liberase
Metamorph program Molecular Devices, USA to analyze the 2-photon images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).

Tags

Medicina Número 99 islotes pancreáticos Lepr Db / db aislamiento Liberase colagenasa imagen 2-fotón exocitosis la insulina las células beta la diabetes
Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P.More

Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets. J. Vis. Exp. (99), e52632, doi:10.3791/52632 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter