Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Lepr Published: May 11, 2015 doi: 10.3791/52632

Abstract

A diabetes tipo 2 é uma doença crónica que afecta 382 milhões de pessoas em 2013, e espera-se aumentar para 592 milhões até 2035 1. Durante as últimas duas décadas, o papel da disfunção da célula beta em diabetes tipo 2 tem sido claramente estabelecida 2. O progresso da pesquisa tem necessários métodos para o isolamento de ilhéus pancreáticos. O protocolo de isolamento de ilhotas apresentado aqui compartilha muitos passos comuns com protocolos de outros grupos, com algumas modificações para melhorar o rendimento e qualidade de ilhotas isoladas, tanto do tipo selvagem e db Lepr diabético (db / db) camundongos. Uma célula-vivo método de imagem 2-fótons é então apresentado que possa ser usado para investigar o controlo da secreção de insulina dentro de ilhotas.

Introduction

O papel da disfunção da célula beta em doenças tem sido amplamente reconhecida 3,4. As linhas celulares tais como o MIN6 e INS-1 são ferramentas úteis para compreender a biologia do comportamento das células beta. No entanto, o controlo fisiológico da secreção de insulina tem lugar dentro das ilhotas de Langerhans. Estas ilhotas conter milhares de células beta embaladas apertadamente, assim como os vasos sanguíneos e outros tipos de células endócrinas. Este ambiente dentro do ilhéu influencia a secreção de insulina e é provável que seja importante na diabetes. Portanto, para compreender o controlo fisiológico da secreção de insulina, e a patofisiologia da doença, que é essencial para estudar ilhotas intactas.

Isolamento de ilhotas

Ilhotas humanos vivos e, em particular, ilhotas humanas de pacientes com diabetes tipo 2 são difíceis de obter. Além disso, ilhotas humanos têm possibilidades limitadas de manipulação molecular experimental. Os investigadores têm, por conseguinte, é empreguepermite que a partir de animais e em modelos animais de diabetes do tipo 2. Um modelo de doença, tais é o rato db / db. Esta é uma mutação espontânea que os modelos de diabetes tipo 2 com uma progressão fenótipo que se aproxima bastante doença humana 5,6. O protocolo apresentado aqui para isolamento de ilhotas de ratos db / db diabéticos tem muitas etapas em comum com outros grupos com alguns refinamentos para melhor rendimento, purificação e aumento da sobrevida das ilhotas.

Imaging dois fótons

A célula de ensaio directo de 2-fótons descrito aqui permite aos investigadores para quantificar o número e avaliar as características de grânulos individuais contendo insulina a partir de células de muitos diabéticos do tipo selvagem e 7 ilhotas 8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: Todos os presentes experimentos foram realizados de acordo com procedimentos de ética de animais locais da Universidade de Queensland (aprovados pela Universidade de Queensland, Comitê de Ética Biociências anatômica).

1. Isolamento Islet

  1. Preparação de reagentes
    1. Mistura de enzimas
      1. Para a digestão pancreática, utilizar uma mistura de Liberase e colagenase tipo IV. Diluir TL Liberase (termolisina baixo) 1 frasco de 5 mg com 26 ml de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
      2. Prepare a colagenase de tipo IV, em tampão de Hank com uma concentração de 0,5 mg / mL, suplementada com 5mM de HEPES, 0,5 mM de CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNase e 1 mg / ml de albumina de soro bovino.
      3. Misturar o TL Liberase e soluções de colagenase em uma proporção de 4: 1 (em volume), ou seja, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenase. Alíquota da mistura de enzimas para cada 2,5 ml e armazenar a -20 ° C.
        NOTA: Os tempos de incubação tecido vary um pouco entre os lotes de enzima (30 s a 1 min diferença). Portanto, um lote de ensaio pode ser necessária.
    2. RPMI Isolamento de mídia
      1. Dissolve-se um frasco de meio RPMI 1640 em pó em 1 litro de água à temperatura ambiente e completar com 2 g de NaHCO3, 4,02 g de HEPES.
      2. Combinar a meios de isolamento RPMI num grande frasco cónico, misture com agitador magnético, ajustar o pH a 7,4 com NaOH, filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C.
    3. RPMI Meios de Cultura
    4. Utilizar o meio de cultura RPMI, com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (isto é, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 ug / ml).
  2. A cultura e isolamento de ilhotas
    1. Sacrifício de Animais
      1. Sacrifique ratos por deslocamento cervical ou asfixia com CO2 de acordo com procedimentos de ética da instituição local. Pulverizar o corpo do rato cuidadosamente com etanol a 70%.
    2. Perfusão pâncreas
      1. VOCÊse duas longas cortes lateralmente através da pele abdominal e do peritoneu para fazer uma aba em forma de V. Puxe a aba da pele até descobrir toda a cavidade abdominal, pôr de lado o intestino e manter o fígado no lugar por um lenço de papel dobrado para revelar o ducto biliar comum (Figuras 1 e 2). Coloque o animal de modo que a cabeça na direção do cirurgião e da cauda longe do cirurgião.
      2. Aplicar uma pinça vascular na ampola na parede do duodeno para bloquear as enzimas injectados de entrar no duodeno (Figura 1).
        NOTA: Este é um passo importante, pois determina se as enzimas injetadas vai para o ducto pancreático e perfundir o pâncreas ou refluxo no local da injecção (mais de pinça) ou ir para o duodeno (sob braçadeira).
      3. Canular do ducto biliar comum com uma agulha G 31 perto da junção do ducto hepático comum e ducto cístico (Figura 1) e deixar espaço para uma segunda injecção se the pâncreas não para perfundir a primeira vez. Lentamente (mais de ~ 10 seg) injetar cerca de 2 ml de mistura de enzimas frio para o rato do ducto biliar comum.
        NOTA: Os pâncreas perfundido será rapidamente se a braçadeira está na posição direita.
      4. Ajuste a posição da braçadeira se a agulha está dentro do ducto biliar comum, mas não pode perfundir o pâncreas (ie., Mover para cima a braçadeira um pouco longe do fígado se sobre apertada ou movê-lo um pouco para baixo para o fígado se sob apertada).
        NOTA: A agulha, por vezes, vai para dentro da cápsula, em vez de em torno do lúmen da conduta. Um sinal útil para verificar se a agulha está dentro do ducto biliar comum é a dilatação do duto, aquando da injecção. Se falhar o pâncreas para perfundir, uma alternativa é a mistura de enzimas pode ser injectado para múltiplos sítios do pâncreas com menor rendimento esperado. A perfusão do local esquerda do pâncreas (lóbulo esplénica) é importante para a maximização do rendimento da ilhota.
      5. Depois do pâncreas é perfused, remover rapidamente o pâncreas, colocá-lo em um frasco (~ 20 ml, vidro) e incubar durante ~ 19 min num banho de água a 37 ° C.
        NOTA: O tempo de incubação pode variar um pouco dependendo da estirpe do mouse e idade.
      6. Após o tempo de incubação, parar o processo de digestão por adição de ~ 20 mL de meio de isolamento frio. Agitar suavemente o frasco para interromper o pâncreas e derramá-lo através de um peneiro normal chá (diâmetro de poro de 1 mm) em um tubo estéril de 50 ml. Encher o tubo com meios de isolamento e centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora.
      7. Dissolve-se o sedimento no meio de isolamento e transferir novamente para dois tubos de 15 ml, em seguida, centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora. Após a aspiração do sobrenadante, misturar as duas pelotas bem com 6 ml de meio de separação celular gradiente de densidade (Histopaque 1077 solução) por tubo em vórtice ou pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicionar suavemente ~ 6 ml do meio de isolamento para o lado do tubo na parte superior deos meios de separação por gradiente de densidade e centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C com freio fora.
      8. Recolhe-se o sobrenadante no (meio de isolamento) superior, média e inferior (densidade meios de separação de células gradiente) camada em três pratos separados. Handpick as ilhotas nestes três pratos, com uma pipeta sob um microscópio de dissecação.
        NOTA: A camada do meio contém a maioria dos ilhéus. As ilhotas são reconhecidos como estruturas compactas de ~ 50 a 500 um de tamanho (Figura 3). Obtemos ~ 200 ilhotas em camundongos WT e entre 300 e <100 ilhotas em ratinhos db / db.
    3. A cultura ilhéu
      1. Para ajudar as ilhotas recuperar a partir da digestão enzimática, grupos de cultura de 40 ilhéus em 25 cm de placa de Petri com 6 ml de RPMI meio de cultura (10 mM de glucose) a 37 ° C, 5% / 95% de CO2 / O2 durante 2 dias antes vivo -cell imaging dois fótons. Alterar o meio de cultura diária.

2. Vivo celular 2-Photon Imagens

  1. Preparação do Reagente
    1. Tampão extracelular
      1. Preparar o tampão de sódio extracelular rico para o ensaio de 2-fótons com 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de NaHCO3 e 10 mM de HEPES.
    2. Extracelular Dye
      1. Para o ensaio de 2-fótons, preparar estoque SRB 8 mM em tampão extracelular, alíquota em pequenos tubos e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a SRB estoque 1:10 em tampão extracelular fresco para obter uma concentração de trabalho de 0,8 mM.
  2. Photon Imagens
    1. Em primeiro lugar, pré-incubar 2 dias em cultura ilhotas em tampão extracelular de glucose 3 mM durante 30 min.
      NOTA: Nós usamos ilhotas entre 2 e 5 dias de cultura.
    2. Em seguida, colocar uma lâmina de vidro para a câmara de controlo térmico montado na platina do microscópio. Use massa para evitar o vazamento de uma solução.
    3. Cubra a câmara com 500 mL de extracelulartampão ular contendo 0,8 mM SRB com diferentes concentrações de glicose (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mM de glicose).
    4. Em seguida, colocar a ilhota pré-incubados no meio da câmara, e se concentrar em 3-4 camadas de células na ilhota onde, nas ilhotas de roedores, a imunocoloração para a insulina mostra que a maioria das células são células beta.
      NOTA: O SRB vai delinear toda a membrana da célula da ilhota rapidamente e a ilhota está pronto para a imagem.
    5. Usar um microscópio 2-fótons com uma objectiva 60X de imersão em óleo (1,42 NA) e software de imagem (por exemplo., Scanimage 11). A Figura 4 ilustra uma disposição típica de microscopia. Imagem eventos exocíticas usando SRB como uma membrana extracelular marcador fluorescente impermeant excitados por pulsos de laser de femtossegundos a 880 nm, com fluorescência detectada em 550-650 nm. Grave as respostas à estimulação de ilhotas.
    6. Identificar eventos exocíticas único pela súbita aparição de uma pequena mancha fluorescente (resolução de 10 pixels /1; m) e confirme a fase de rápido crescimento do sinal fluorescente sobre uma região de interesse (~ 0,78 mm 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Islet rendimento e purificação

Para um rato normal de tipo selvagem, são esperados cerca de 200 ilhotas. Ilhotas saudáveis ​​olhar brilhante, em forma redonda e tem uma borda lisa. Um lote de isolamento over-digerido tem geralmente pequenas e difusas ilhotas enquanto um lote digerido-under tem menos ilhotas e ilhéus celulares ligados acinares (Figura 3). Para ratinhos db / db diabéticos, o rendimento da ilhota e aparência depende da progressão da doença com melhores ratos glicémicos têm maiores, mais brilhantes e mais ilhéus (até 300 ilhéus) em comparação com ratinhos glicémico pior que tem ilhéus com um aspecto translúcido (100 sob ilhotas)

Ensaio 2-fótons

Imaging dois fótons é um ensaio indireto de medir a secreção de insulina ao nível da fusão grânulo insulina único. Em resposta a estímulos, tais como a glicose ou alta de potássio, grânulos de insulina fundir com a membrana plasmática e o corante SRB extracelular entra the grânulos o que resulta no aparecimento de uma mancha fluorescente súbita ~ 400 nm de diâmetro (figura 5). Várias experiências foram realizadas para validar este ensaio como uma medida da fusão dos grânulos contendo insulina como a dose de glucose dependente de aumento do número de eventos de fusão dos grânulos com o valor esperado da secreção de insulina, o tamanho consistente das células reagiram no 2 fotões com a de uma célula beta, o diâmetro dos grânulos semelhante medido pelo 2 fotões e o microscópio electrónico, a co-localização da absorção do corante e insulina coloração 8.

Durante a duração de gravação, todos os eventos exocíticas em resposta ao estímulo são identificados e a localização dos eventos, a altura do aparecimento, a duração e tipo de eventos de fusão como Kiss-and-run ou fusão completa são caracterizados ( A Figura 5, 6). Estas características do processo de fusão são valiosas para a avaliação qualquer defeito na fusão grânulo em modelos de diabetes tipo 2. O nosso relatório anterior, utilizando este método mostra que o defeito em ilhotas db / db diabéticos, é a perda de fusão grânulo completo e não uma alteração das características da cinética de fusão dos grânulos individuais 7. Além disso, mostra-se que o maior factor na diminuição da secreção de insulina na doença é uma redução do número de células que respondem a 7.

Figura 1
Figura 1:. Um diagrama dos locais de fixação e injeção Injectar as enzimas para o ducto biliar comum perto da junção do ducto hepático comum e ducto cístico. Fixar a ampola de Valter por uma pinça vascular para facilitar a enzima injectado para o canal pancreático.

2632fig2.jpg "/>
Figura 2: O processo de injecção em ratinhos. Top figura ilustra a agulha dentro do ducto biliar comum com uma pinça vascular aplicado na ampola de Valter. A figura inferior mostra o pâncreas perfundido-Liberase após a injecção.

Figura 3
Figura 3: imagens típicas de tipo selvagem e ilhotas db db / isolados (A) do tipo selvagem ilhotas isoladas.. (B) db / db ilhotas isoladas. (C) ilhotas de Sub-digerido com células acinares associadas (setas). (D) Over-digerido ilhotas com pequenas e difusas ilhotas (setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 Figura 4:. Os principais componentes do microscópio dois fótons feito por encomenda Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Exemplo de um único evento de fusão dos grânulos de insulina tal como registado com microscopia de dois fotões figura da esquerda representa a célula antes (A) e após (B) o aparecimento de um evento exocitico (seta) em resposta ao estímulo da glucose 15 mM.. (C) ilustra a rotulagem SRB com a entrada do corante SRB extracelular para dentro do grânulo quando se funde com a membrana plasmática. (D) mostra a intensidade de fluorescência ao longo de uma região de interesse de um evento exocitico, bem como o Sequential imagens deste evento exocítica (barra de escala 1 mm). Imagem modificado a partir Do et al 2014 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6:. As respostas do tipo selvagem e ilhotas db / db diabéticos sob o microscópio 2-fótons com SRB, como o corante extracelular Nestas experiências insulina eventos de fusão dos grânulos, em resposta a estimulação de glicose 15 mM são registados. Círculos amarelos são os locais dos eventos exocíticas durante 20 min de gravação. Imagem modificado a partir Do et al 2014 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O factor mais importante no isolamento de ilhotas é a perfusão inicial do pâncreas; sob um pâncreas perfundido resultados com um rendimento de ilhotas consideravelmente inferior. Outros factores também afectam a qualidade de isolamento, tais como o tempo de digestão e o nível de agitação que pode compensar parcialmente o nível de perfusão. Por exemplo, um pâncreas perfundido totalmente terá de ser incubadas a 37 ° C durante ~ 18 min 30 seg, agitando suavemente, em contraste sob uma digerido pâncreas pode necessitar de ~ 20 min de digestão com mais agitação. A mistura de duas enzimas de digestão nas nossas mãos proporciona um melhor isolamento de ilhotas do que qualquer um deles sozinho. Para a colagenase único método, o tempo de digestão afeta criticamente o rendimento de ilhotas e diferenças de tempo de apenas 30 segundos pode afetar drasticamente a qualidade. Para Liberase única, o rendimento é aceitável, mas sub-digestão por vezes acontece, nós acreditamos que a adição de colagenase ajuda para digerir o tecido conjuntivo melhor.

Há um número de possíveis experiências que podem ser realizadas depois de as ilhotas foram isolados. Isolado ilhotas pode ser fixado em paraformaldeído ou metanol e imediatamente depois do isolamento utilizado na coloração de imunofluorescência para determinar a localização de proteínas de interesse 10. Isolado ilhotas pode ser disperso em que células individuais. Isto pode ser feito no mesmo dia de isolamento de ilhotas ou depois de alguns dias de cultura das ilhotas. As células isoladas são então semeadas e é esta preparação, que tem sido o esteio de técnicas, tais como microscopia de fixação de membranas e de reflexão interna total. Em experiências que medema secreção de insulina, assim como para células vivas 2-fótons de imagem, verificou-se que requerem ilhotas 2 dias em cultura, a fim de fornecer dados reprodutíveis. O que está a acontecer na cultura não é bem compreendido, mas pensa-se ser um período de recuperação a partir do processo de isolamento e digestão.

A técnica 2-fótons aqui apresentada permite aos investigadores a imagem do processo de secreção de insulina ao nível de fusão dos grânulos individuais de muitas células dentro ilhotas intactas. Verificou-se que o número de eventos de fusão dos grânulos e sua distribuição é consistente com as quantidades e o perfil temporal da secreção de insulina 8. Isto sugere que o método é detectar a maioria dos eventos de fusão dos grânulos de insulina. Tendo em conta que a entrada do corante para os grânulos de fusão não é um método específico para a detecção de grânulos de eventos de fusão de insulina temos feito grandes esforços para a realização de experimentos de controle para demonstrar que a fusão grânulo de insulina em células beta estão sendo estudadas 7,8

Há um número de problemas técnicos com o microscópio 2-fótons que são comuns a todas as abordagens da imagem latente. Por exemplo, nós cuidadosamente equilibrar os fatores opostos de tentar obter luz suficiente para as ilhotas, para que possamos reduzir o ganho dos detectores, e, portanto, reduzir o ruído, com a colocação de tanta luz para as ilhotas que causam danos às células. No nosso sistema, de uma célula de Pockels é usado para atenuar o laser pulsado (Figura 3); todos os sistemas comerciais têm mecanismos para alterar a intensidade da luz que incide sobre o espécime.

Em resumo, a combinação de isolamento cuidadosa de db / db ilhotas e todo-ilhota de microscopia 2 fótons apresentam novas oportunidades para estudar os processos de secreção de insulina e determinar os elementos defeituosos chave na diabetes tipo 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TL 5 mg Roche -5401020001
Collagenase type IV-1g Gibco-Life Technologies 17104-019
Histopaque 1077 500 ml Sigma Aldrich 10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1L Sigma Aldrich R1383 to prepare isolation media
RPMI 1640 (1x) 500 ml Gibco-Life Technologies 21870-076 to prepare cultured media
Penicillin-Streptomycin 100 ml Gibco-Life Technologies 15140-122 to prepare cultured media 
Fetal bovine serum 500 ml Gibco-Life Technologies 10099-141 to prepare cultured media
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Gibco-Life Technologies 11966-025 to dilute the liberase
Metamorph program Molecular Devices, USA to analyze the 2-photon images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).

Tags

Medicina Edição 99 ilhotas pancreáticas Lepr Db / db isolamento Liberase colagenase imagem latente dois fótons exocitose insulina células beta diabetes
Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P.More

Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets. J. Vis. Exp. (99), e52632, doi:10.3791/52632 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter