Introduction
De bacteriële celcyclus regelt zowel de replicatie van het genoom en de verdeling van dochtercellen. Belangrijker nog, zoals resistentie tegen antibiotica is een groeiende bedreiging voor de volksgezondheid, de bacteriële cel cyclus presenteert een onaangeboorde doelwit voor antibiotica ontwikkeling.
In de bacterie Caulobacter crescentus, elke celcyclus leidt tot een asymmetrische verdeling, waarbij twee dochtercellen van verschillende lot (figuur 1A) 1,2. Een dochter cel erft een flagellum en is beweeglijk, terwijl de andere dochter erft een steel en is sessile. Een geïntegreerde genetische circuit controleert voortgang van de celcyclus en lot van de cel door gentranscriptieregulatie, fosfo-signalering, en gereguleerde proteolyse 3. Bovendien chromosoom replicatie en gelijktijdige scheiding opbrengst dochtercellen die precies één kopie van het chromosoom 4 bevatten. Belangrijk is, kunnen deze twee celtypen snel worden gescheiden door colloidal silica deeltjesdichtheid centrifugatie in de synchroniseerbaar NA1000 stam 07/05 waardoor de isolatie van de swarmer cellen van de rest van de populatie met hoge opbrengsten (Figuur 1B). Geïsoleerd swarmer cellen dan verder synchroon door asymmetrische celdeling. Hier hebben we detail het gebruikte protocol voor het synchroniseren van Caulobacter stam NA1000. Wij bieden protocollen en gemeenschappelijke tips voor probleemoplossing voor zowel groot- als kleinschalige synchronisaties. Deze experimentele procedure biedt een krachtig instrument om de spatiotemporele controle van de Caulobacter celcyclus en lot van de cel te ondervragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grootschalige Synchrony - Optimaal voor Western Blot, microarray / RNA-Seq, en ander materiaal Intensive Testen
- Uit een vriezer voorraad of een bord, groeien een 5 ml O / N cultuur van stam NA1000 door schudden bij 28 ° C in PYE medium.
- Inoculeer 0,5 ml van de cellen van stap 1 in 25 ml M2G (tabellen 1-2) en schud bij 28 ° C totdat de kweek een OD 600 tussen 0,5 en 0,6 bereikt.
- Te enten de cellen in 1 L van M2G en schudden bij 28 ° C.
- Zodra OD 600 bereikt 0,5-0,6, bevestigen de aanwezigheid van swarmer cellen met behulp van vloeibare gemonteerd fase microscopie. Spot 1 ui van cellen op een glasplaatje, dek af met een deksel slip, en het beeld van fase microscopie. Controleer de aanwezigheid van swarmer cellen door visualiseren zwemmen snel cellen in de populatie.
- Spin cellen gedurende 15 min bij 7 kxg bij 4 ° C in een JA-10 rotor.
- Verwijder het supernatant en voeg 180 ml koud M2 (tabellen 1-2) en voorzichtig resuspend alle cellen met behulp van een serologische pipet. Gooi losjes afgedraaid cellen; ze zijn predivisional en gestalkt cellen.
- Voeg 60 ml koud Colloïdaal siliciumdioxide-oplossing (zorg ervoor dat de Colloïdaal siliciumdioxide schorsing meng goed voor het toevoegen aan de cellen) en meng de celsuspensie goed.
- Giet de celsuspensie in acht 30 ml buizen en draaien gedurende 30 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor.
OPMERKING: Men moet twee verschillende bands te zien; de swarmer band is de onderste band terwijl gestalkt / predivisional cellen zijn in de top-band (Figuur 1B). - Aspireren zorgvuldig de topband uit en verwijder de vloeistof tot ~ 1 cm boven de swarmer band (de onderste band).
- (Kritiek) Met behulp van een Pasteur pipet, verwijder voorzichtig de swarmer band en plaats in een schone buis. Om wegspoelen de Colloidal silica, boven de buis met koud M2 en centrifugeren gedurende 10 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor.
- Gooi de supernatant voorzichtig en resuspendeer decellen in 20 ml koude M2 en centrifugeren gedurende 10 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor.
- Resuspendeer de pellets in 30 ml koud M2 en meet de OD600 met een spectrofotometer blanco met koud M2 medium. Opslaan 1 pl voor fase beeldvorming om te controleren op swarmer cellen; 90-95% van de cellen moet zwermers.
- Spin down de cellen gedurende 5 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor. Resuspendeer cellen in 28 ° C M2G medium zodat de A 600 ~ 0,3-0,4 en beginnen schudden bij 28 ° C.
OPMERKING: Typische opbrengsten zijn tussen de 30 en 60 ml van swarmer celcultuur van 1L van niet-gesynchroniseerde cellen. - Beginnen met het nemen tijdstippen (wild type cultuur zal ongeveer 135-140 minuten duren om te verdelen) 8,9. Op elk tijdstip, het meten van de OD 600. Controleer of de OD 600 na deling is ongeveer 2X de eerste OD 600.
- Voor western blot of genexpressie testen, verwijder 1 ml porties van de culture op de gewenste tijdstippen, het afsluiten bij maximale snelheid in een tafelblad centrifuge gedurende 30 seconden, snel decanteren of zuig het medium en flash bevriezen de celpellet in vloeibare stikstof. Bewaar de cellen bij -80 ° C totdat stroomafwaarts analyse.
2. Kleinschalig Synchrony - Optimaal voor Microscopie
- Uit een vriezer voorraad of een bord, groeien een 5 ml O / N cultuur schudden bij 28 ° C in M2G.
- Verdunnen in 15 ml M2G (tabellen 1-2) en groeien tot mid-log (OD 600 = 0,5-0,6).
- Spin 6,4 kxg gedurende 10 min bij 4 ° C in een JA-20 rotor, en resuspendeer in 1 ml koude M2 (Tabellen 1-2) overgebracht in een 2 ml microcentrifugebuis.
- Spin op 15 kxg gedurende 3 min in een microcentrifugebuis om cellen pellet, zuig het supernatant, zet de pellet op ijs, en resuspendeer in 900 ul van koude M2.
- Voeg 900 ul koud PVP beklede colloïdale silica en centrifugeren gedurende 20 min bij 15 kxg bij 4 ° C in een microfoonrocentrifuge buis.
- (Kritiek) Zuig of een pipet uit de top gestalkt / predivisional cel band en het verzamelen van de bodem swarmer band in een nieuwe microcentrifugebuis.
- Was de swarmer cellen tweemaal in 1 ml koude M2 tijdens centrifugeren bij 15 kxg gedurende 3 min.
- Voor het centrifugeren, zet de cellen in een voorgekoeld 1 ml glazen reageerbuis en meet de OD 600 van de cellen in vergelijking met een blanco van M2.
- Resuspendeer de laatste cel pellet in 28 ° C M2G bij een OD tussen 0,3-0,4 en schud / roll cellen bij 28 ° C.
OPMERKING: Typische opbrengsten zijn tussen de 2 en 4 ml swarmer celkweek. - Voor microscopie experimenten op de gewenste tijdstippen plaats 1 ul van cellen op een M2G agarose pad voor beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synchronisatie levert doorgaans twee banden van de cellen (Figuur 1B): het swarmer band, die een hogere dichtheid heeft, en een gestalkt / predivisional cel band van lagere dichtheid. Te zorgen voor een efficiënte synchronisatie gemeenschappelijke controles omvatten het toezicht op de OD 600 en het meten van de niveaus van Ctra eiwit door western blot op verschillende celcyclus tijdstippen. De OD 600 moet stijgen ongeveer 2-voudig tijdens de celcyclus (Figuur 2). De western blot voor de celcyclus meester regulator Ctra is het nuttig om na een goed synchroon (figuur 2) te controleren. CTRA wordt gebruikt in de swarmer cel om DNA-replicatie blokkeren en wordt afgebroken bij het begin van DNA replicatie 10. CTRA wordt later in de celcyclus gesynthetiseerd en activeert transcriptie van een groot aantal ontwikkelingsgenen waaronder veel onderdelen van het flagellum 11,12. Een succesvolle synchroniciteit t hebbenzijn oscillerend patroon van Ctra eiwit niveaus.
Figuur 1. De celcyclus van Caulobacter crescentus. (A) Een cartoon schema van de swarmer celcyclus. De swarmer cellen differentiëren tot replicatie competent gestalkt cellen door het terugtrekken van pili, uitwerpen flagellen, en het initiëren van DNA-replicatie. De cirkels en theta getoond in de cel contouren structuren vertegenwoordigen in rust en repliceren van chromosomen. Cellen dan de voortgang door de celcyclus bouwen van een enkel flagellum op de paal tegenover de stengel. Bij de divisie, twee unieke soorten cellen worden gegenereerd, een replicatie geblokkeerd beweeglijke swarmer cel en een replicatie-competente stationaire gestalkt cel. (B) Representatieve resultaten voor dichtheidscentrifugatie. Lagere dichtheid gestalkt en predivisional cellen drijven nabij de top van de gradiënt, terwijl dichte swarmer cellen uiteindelijk naar de bodem van de buis. Schaal bars zijn 1 micrometer in fase microscopie beelden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve resultaten voor een succesvolle swarmer cel synchroniteit. De celmassa gemeten OD 600 dient langzaam te verhogen en uiteindelijk verdubbelen in de loop van de test. 1 ml porties werden gepipetteerd in plastic cuvetten uit een grote cel synchroniteit en de OD600 gemeten met een spectrofotometer bij de aangegeven tijdstippen. Verder dient de ctra celcyclus meester regulerende eiwit in de swarmer cel DNA replicatie, gevolgd door een snelle afbraak blokkerensamenvalt met de initiatie van DNA replicatie. CTRA wordt later in de celcyclus geregenereerd expressie van vele genen ontwikkelingsstoornissen inclusief kritische flagellaire en pili componenten activeren. Western blots celdeling meester regulerend eiwit Ctra werden uitgevoerd door gebruik 1 ml aliquots grootschalige synchronie. De cellen werden geresuspendeerd in 250 ul Laemmlli monsterbuffer per OD600, gescheiden op 10% Tris-Gly PAGE, overgebracht naar PVDF en geblot met anti-CTRA antilichaam. Mislukte synchroon procedures leiden tot Ctra western blots met geen verandering in de eiwit niveaus. α-CTRA antilichaam 12 werd bij een 1: 10.000 verdunning gedurende 1,5 uur in 3% melk TBST en 3 keer gewassen in TBST. Geit-α-konijn secundair werd daarna 1: 10.000 verdunning in 3% melk TBST gedurende 1 uur, 3 maal gewassen met TBST en afgebeeld op film met een chemiluminescente detectie kit. Zoomklik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH4Cl | 10 g |
| H2O | Resuspendeer in 1 L & autoclaaf |
Tabel 1. 20X M2 Zouten Recept.
| 20X M2 Zouten | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO4 | 1 ml | |
| 20% Glucose | 10 ml | Substituut voor H 2 O in M2 |
| Ijzersulfaat Chelate Solution | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl2 | 5 ml | Voeg als laatste avoid neerslag |
| H2O | Vul tot 1 L | |
| Steriel filter met 0,22 pm filter |
Tabel 2. M2 en M2G recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
