Introduction
تسيطر على دورة الخلية البكتيرية كل من تكرار الجينوم وتقسيم الخلايا الوليدة. الأهم من ذلك، كما مقاومة المضادات الحيوية تشكل تهديدا متزايدا على الصحة العامة، تقدم دورة الخلية البكتيرية هدفا غير مستغلة للتنمية المضادات الحيوية.
في بكتيريا العنيقاء crescentus، كل دورة الخلية يؤدي إلى تقسيم غير المتماثلة، مما أسفر عن خليتين ابنة مصائر مختلفة (الشكل 1A) 1،2. خلية ابنة واحدة يرث السوط وهي متحركة في حين أن ابنة أخرى يرث ساق وهي اطئة. دائرة الوراثية متكاملة تسيطر تقدم دورة الخلية ومصير الخلية عن طريق تنظيم النسخي، الفوسفات، مما يشير، والتحلل البروتيني المنظم 3. وبالإضافة إلى ذلك، وتكرار كروموسوم وخلايا ابنة العائد الفصل المتزامنة التي تحتوي بالضبط نسخة واحدة من كروموسوم 4. الأهم من ذلك، هذه أنواع الخلايا اثنين يمكن فصلها بسرعة عن طريق كولوايدال السيليكا الجسيمات كثافة الطرد المركزي في سلالة synchronizable NA1000 5-7 السماح للعزل الخلايا مخابئ عن بقية السكان مع عوائد عالية (الشكل 1B). عزل مخابئ خلايا ثم المضي قدما بشكل متزامن من خلال انقسام الخلايا غير المتماثلة. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول يستخدم لمزامنة العنيقاء سلالة NA1000. ونحن نقدم البروتوكولات ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها المشتركة لكلا الكبيرة والصغيرة الحجم تزامن. يوفر هذا الإجراء التجريبي أداة قوية لاستجواب السيطرة الزمانية المكانية من دورة الخلية العنيقاء ومصير الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. على نطاق واسع التزامن - الأمثل لالبقعة الغربية، ميكروأري / RNA تسلسل، وغيره فحوصات مكثفة مواد
- من مخزون الثلاجة أو لوحة، وتنمو 5 مل O / N ثقافة سلالة NA1000 عن طريق هز في 28 ° C في PYE المتوسطة.
- تطعيم 0.5 مل من الخلايا من الخطوة 1 في 25 مل من M2G (الجداول 1-2) ويهز عند 28 درجة مئوية حتى تصل الثقافة إلى OD 600 بين 0.5 و 0.6.
- تطعيم الخلايا في 1 لتر من M2G ويهز في 28 ° C.
- مرة واحدة OD 600 يصل 0،5-0،6، تأكد من وجود مخابئ الخلايا باستخدام السائل شنت المرحلة المجهري. بقعة 1 ميكرولتر من الخلايا على شريحة زجاجية، وتغطي مع انزلاق الغطاء، وصورة من المرحلة المجهري. تأكيد وجود خلايا مخابئ من خلال وضع تصور خلايا السباحة بسرعة بين السكان.
- تدور الخلايا لمدة 15 دقيقة في 7 kxg في 4 درجات مئوية في الدوار JA-10.
- تجاهل طاف وإضافة 180 مل من M2 البارد (الجداول 1-2) والدقة بلطفuspend جميع الخلايا باستخدام الماصة المصلية. تجاهل الخلايا مكعبات فضفاضة. فهي خلايا predivisional ومطاردة.
- إضافة 60 مل من البرد حل السيليكا الغروية (تأكد من خلط السيليكا تعليق صمغي جيدا قبل إضافة إلى الخلايا)، ومزيج تعليق خلية أيضا.
- صب تعليق خلية في ثمانية 30 مل أنابيب وتدور لمدة 30 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار.
ملاحظة: يجب للمرء أن يرى شريطين مميزة؛ الفرقة مخابئ هي أقل الفرقة بينما مطاردة / خلايا predivisional هي في أعلى الفرقة (الشكل 1B). - نضح بعناية الفرقة أعلى قبالة وإزالة السائل إلى ~ 1 سم فوق الفرقة مخابئ (أقل من الفرقة).
- (الحرجة) باستخدام الماصة باستور، وإزالة بعناية الفرقة مخابئ ووضع في أنبوب نظيفة. ليغسل السيليكا الغروية، أعلى الأنبوب قبالة مع M2 البارد وتدور لمدة 10 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار.
- تجاهل بعناية طاف و resuspendالخلايا في 20 مل من M2 البارد وتدور لمدة 10 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار.
- و resuspend جميع الكريات في 30 مل من M2 البارد وقياس OD 600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي وفارغة باستخدام البارد المتوسطة M2. حفظ 1 ميكرولتر للمرحلة التصوير للتحقق من مخابئ الخلايا. يجب أن يكون 90-95٪ من خلايا swarmers.
- تدور باستمرار خلايا لمدة 5 دقائق عند 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار. Resuspend الخلايا في 28 ° C M2G المتوسطة بحيث A 600 غير ~ 0.3-0.4 والبدء اهتزاز في 28 ° C.
ملاحظة: غلة النموذجية هي ما بين 30 و 60ML من مخابئ ثقافة خلية من خلايا 1L غير المتزامنة. - البدء في اتخاذ نقاط زمنية (لن ثقافة نوع البرية تأخذ حوالي 135-140 دقائق لتقسيم) 8،9. في كل نقطة زمنية، وقياس OD 600. تأكد من أن OD 600 بعد تقسيم ما يقرب من 2X وOD الأولي 600.
- لالغربية لطخة أو التعبير الجيني المقايسات، وإزالة مأخوذة من 1mL من مكعبlture عند نقاط الوقت المطلوب، وتدور إلى أسفل في أقصى سرعة في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 30 ثانية، وبسرعة صب أو نضح المتوسط، وفلاش تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل. تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية حتى تحليل المصب.
2. على نطاق صغير التزامن - الأمثل للالمجهر
- من مخزون الثلاجة أو لوحة، وتنمو 5 مل O / N الثقافة تهتز عند 28 درجة مئوية في M2G.
- تمييع في 15 مل من M2G (الجداول 1-2) وتنمو حتى سجل منتصف (OD 600 = 0.5-0.6).
- تدور في 6.4 kxg لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار، وresuspend في 1 مل الباردة M2 (الجداول 1-2) ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل.
- تدور في 15 kxg لمدة 3 دقائق في أنبوب microcentrifuge لتكوير الخلايا، ونضح قبالة طاف، ووضع بيليه على الجليد، وresuspend في 900 ميكرولتر من M2 البارد.
- إضافة 900 ميكرولتر من PVP البارد المغلفة السيليكا الغروية وتدور لمدة 20 دقيقة في 15 kxg في 4 درجات مئوية في هيئة التصنيع العسكريأنبوب rocentrifuge.
- (الناقد) نضح أو الماصة قبالة رأس مطاردة / predivisional الفرقة الخلية وجمع أسفل مخابئ الفرقة في أنبوب microcentrifuge جديد.
- غسل الخلايا مخابئ مرتين في 1 مل من M2 البارد في حين الطرد المركزي في 15 kxg لمدة 3 دقائق.
- قبل تدور النهائي، نقل الخلايا في قبل المبردة 1 مل اختبار أنبوب زجاجي وقياس OD 600 من الخلايا مقارنة فارغة من M2.
- resuspend الكرية خلية النهائي إلى 28 ° C M2G في لOD بين 0،3-0،4 ويهز خلية / لفة في 28 ° C.
ملاحظة: غلة النموذجية هي ما بين 2 و 4 مل من ثقافة الخلية مخابئ. - للتجارب المجهري، في مكان المطلوب نقاط زمنية 1 ميكرولتر من الخلايا على لوحة agarose M2G للتصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تزامن عادة ينتج شريطين من الخلايا (الشكل 1B): الفرقة مخابئ، والتي لديها أعلى كثافة، ومطاردة / predivisional الفرقة خلية من أقل كثافة. لضمان وتشمل الضوابط المشتركة تزامن كفاءة مراقبة OD 600 وقياس مستويات البروتين CTRA التي كتبها طخة غربية في نقاط متميزة الوقت دورة الخلية. وOD 600 يجب زيادة بنحو 2 أضعاف خلال دورة الخلية (الشكل 2). لطخة غربية لدورة الخلية منظم سيد CTRA هو السيطرة مفيدة للتحقق من التزامن جيد (الشكل 2). ويستخدم CTRA في الخلية مخابئ لمنع تكرار الحمض النووي وتتحلل عند بداية تكرار الحمض النووي (10). CTRA ثم يتم تصنيعه في وقت لاحق في دورة الخلية وينشط النسخ من مجموعة من الجينات التنموية بما في ذلك العديد من مكونات السوط 11،12. وسوف يكون ناجحا التزامن رله نمط تتأرجح مستويات البروتين CTRA.
الشكل 1. دورة الخلية من العنيقاء crescentus. (A) التخطيطي الكرتون من دورة الخلية مخابئ. الخلايا مخابئ تفرق في تكرار خلايا مطاردة المختصة التي كتبها التراجع بيلي، إخراج سياط، والشروع في تكرار الحمض النووي. الدوائر وثيتا الهياكل معروضة داخل الخطوط العريضة خلية تمثل الكروموسومات هادئة وتكرار. خلايا ثم التقدم من خلال دورة الخلية بناء السوط واحد في القطب قبالة ساق. بناء على التقسيم، يتم إنشاء نوعين خلية فريدة من نوعها، منعت النسخ المتماثل متحركة مخابئ خلية وخلية ثابتة المختصة تكرار مطاردة. (ب) ممثل النتائج لكثافة الطرد المركزي. انخفاض الكثافة احقت وpredivخلايا isional تطفو بالقرب من أعلى التدرج في حين كثيفة مخابئ الخلايا في نهاية المطاف باتجاه الجزء السفلي من الأنبوب. الحانات النطاق هي 1 ميكرون في صور المجهر المرحلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ممثل النتائج لنجاح مخابئ التزامن الخلية. وكتلة الخلية يقاس OD 600 ينبغي أن تزيد ببطء ويتضاعف في نهاية المطاف طوال فترة الفحص. تم pipetted 1 مل مأخوذة في cuvettes البلاستيكية من التزامن خلية كبيرة وOD 600 قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي في النقاط الزمنية المشار إليها. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تكون دورة الخلية سيد البروتين التنظيمي CTRA الحالي في الخلية مخابئ لمنع تكرار الحمض النووي، تليها التدهور السريعتتزامن مع بدء تكرار الحمض النووي. CTRA يتم بعد ذلك إعادة إحياء لاحقا في دورة الخلية لتنشيط التعبير عن العديد من الجينات التنموية بما في ذلك مكونات سوطي وبيلي حرجة. أجريت البقع الغربية لدورة الخلية سيد البروتين التنظيمي CTRA من خلال اتخاذ 1 مل مأخوذة من التزامن على نطاق واسع. ومعلق الخلايا في 250 ميكرولتر Laemmlli عينة العازلة في OD 600، فصل على 10٪ تريس، الغليسين PAGE، ونقل إلى PVDF، ونشف مع anti-CTRA الأجسام المضادة. تؤدي إجراءات التزامن فشل في CTRA البقع الغربية مع أي تغيير في مستويات البروتين. وقد حضنت α-CTRA الأجسام المضادة 12 في 1: 10،000 التخفيف عن 1.5 ساعة في 3٪ الحليب TBST وغسلها 3 مرات في TBST. غسلها 10،000 التخفيف في 3٪ الحليب TBST لمدة 1 ساعة، 3 مرات مع TBST، وتصوير الفيلم على استخدام عدة كشف chemiluminescent: الماعز α-أرنب الثانوي ثم أضاف في 1. من فضلكانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نا 2 هبو 4 | 17.4 ز |
| KH 2 PO 4 | 10.6 ز |
| NH 4 الكلورين | 10 ز |
| H 2 O | resuspend في 1 L & الأوتوكلاف |
الجدول 1. 20X M2 أملاح وصفة.
| 20X M2 أملاح | 50 مل | |
| 0.5 M MgSO 4 | 1 مل | |
| 20٪ الجلوكوز | 10 مل | بديلا عن H 2 O في M2 |
| كبريتات الحديدوز كلات الحل | 1 مل | |
| 0.1 M CaCl 2 | 5 مل | إضافة آخر من AVهطول الأمطار OID |
| H 2 O | ملء تصل إلى 1 L | |
| تصفية العقيمة مع مرشح 0.22 ميكرومتر |
الجدول 2. M2 وM2G صفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
