Introduction
Le cycle cellulaire bactérienne contrôle à la fois la replication du génome et la division des cellules filles. Surtout, comme la résistance aux antibiotiques est une menace croissante pour la santé publique, le cycle cellulaire bactérienne présente une cible inexploitée pour le développement antibiotique.
Dans la bactérie Caulobacter crescentus, chaque cycle cellulaire conduit à une division asymétrique, pour donner deux cellules filles des différentes sorts (figure 1A) 1,2. Une cellule fille hérite un flagelle et mobiles tandis que l'autre fille hérite d'une tige et est sessiles. Circuit intégré génétique contrôle la progression du cycle cellulaire et sort de la cellule par régulation de la transcription, phospho-signalisation, et la protéolyse régulée 3. En outre, la réplication chromosomique des cellules filles et de rendement de la séparation simultanées qui contiennent exactement une copie du chromosome 4. Fait important, ces deux types de cellules peuvent être séparés rapidement par colloL'Idéal particule de silice densité centrifugation dans la souche synchronisable NA1000 7.5 permettant l'isolement des cellules swarmer du reste de la population avec des rendements élevés (figure 1B). Isolé swarmer cellules alors procéder de manière synchrone par division cellulaire asymétrique. Ici, nous détaillons le protocole utilisé pour synchroniser Caulobacter souche NA1000. Nous fournissons des protocoles et des conseils de dépannage communes pour deux petite et à grande échelle des synchronisations. Cette procédure expérimentale fournit un outil puissant pour interroger le contrôle spatio-temporelle du cycle cellulaire et Caulobacter destin cellulaire.
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Protocol
1. Synchrony à grande échelle - Optimal pour Western Blot, puces à ADN / ARN-Seq, et d'autres essais intensifs Matériel
- De un congélateur actions ou une plaque, cultiver un 5 ml O / N de la culture de la souche NA1000 en secouant à 28 ° C dans un milieu PYE.
- Inoculer 0,5 ml des cellules de l'étape 1 dans 25 ml de M2G (tableaux 1-2) et agiter à 28 ° C jusqu'à ce que la culture atteint une DO 600 entre 0,5 et 0,6.
- Ensemencer les cellules dans 1 L de M2G et agiter à 28 ° C.
- Une fois DO600 atteigne 0,5 à 0,6, de confirmer la présence de cellules en utilisant swarmer liquide monté microscopie de phase. Spot 1 pi de cellules sur une lame de verre, couvrir avec une lamelle, et l'image par microscopie de phase. Confirmer la présence de cellules Grouillant en visualisant les cellules de natation rapidement dans la population.
- Spin cellules pendant 15 min à 7 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-10.
- Jeter le surnageant et ajouter 180 ml de M2 froide (tableaux 1-2) et res doucementuspend toutes les cellules en utilisant une pipette sérologique. Jeter cellules faiblement granulés; ce sont des cellules predivisional et harcelées.
- Ajouter 60 ml de solution de silice colloïdale froide (ne oubliez pas de mélanger la suspension de silice colloïdale avant d'ajouter aux cellules) et bien mélanger la suspension cellulaire.
- Verser la suspension de cellules dans 30 ml de huit tubes et centrifuger pendant 30 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20.
NOTE: Il faut voir deux bandes distinctes; la bande de swarmer est la bande inférieure tandis que les cellules traquées / predivisional sont dans la fourchette supérieure (figure 1B). - Aspirer soigneusement la bande supérieure et enlever le liquide à ~ 1 cm au-dessus de la bande de swarmer (la bande inférieure).
- (Critique) aide d'une pipette Pasteur, retirez soigneusement la bande de swarmer et la placer dans un tube propre. Pour laver la silice colloïdale, en haut du tube hors M2 avec froid et essorage pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20.
- Eliminer délicatement le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans 20 ml de M2 froid et centrifugation pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20.
- La suspension de toutes les pastilles dans 30 ml de M2 froid et mesurer l'OD 600 en utilisant un spectrophotomètre et vierge à l'aide du milieu M2 froid. Enregistrer 1 pl pour l'imagerie de phase pour vérifier swarmer cellules; 90-95% des cellules doit être swarmers.
- Centrifuger les cellules pendant 5 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. Resuspendre les cellules dans 28 ° C M2G moyenne de sorte que le A 600 est ~ 0,3 à 0,4 et commencer agitation à 28 ° C.
NOTE: Les rendements typiques sont entre 30 et 60 ml de swarmer culture cellulaire à partir de cellules non synchronisées 1L. - Commencez à prendre des points de temps (la culture de type sauvage prendra environ 135-140 minutes de diviser) 8,9. A chaque point de temps, de mesurer la DO 600. Vérifiez que la DO 600 après la division est d'environ 2X la DO initiale 600.
- Pour blot ou expression génique essais occidentaux, retirez aliquotes de 1 ml de la culture aux points de temps désirés, ralentit à la vitesse max dans une centrifugeuse de table pendant 30 sec, rapidement décanter ou aspirer le milieu, et le flash geler le culot cellulaire dans l'azote liquide. Stocker les cellules à -80 ° C jusqu'à l'analyse en aval.
2. Synchrony à petite échelle - Optimal pour Microscopie
- De un congélateur actions ou une plaque, grandir à 5 ml O / N secouant la culture à 28 ° C dans M2G.
- Diluer dans 15 ml de M2G (tableaux 1-2) et de croître jusqu'à la mi-log (DO600 = 0,5-0,6).
- Spin à 6,4 KXG pendant 10 min à 4 ° C dans un rotor JA-20, et de remettre en suspension dans 1 ml froides M2 (tableaux 1-2) et transférer dans un tube à centrifuger de 2 ml.
- Centrifuger à 15 KXG pendant 3 min dans un tube de microcentrifugeuse pour sédimenter les cellules, aspirer le surnageant, le culot a mis sur de la glace, et remettre en suspension dans 900 ul de M2 froid.
- Ajouter 900 pi de PVP froid revêtu silice colloïdale et de spin pendant 20 min à 15 KXG à 4 ° C dans un microTube rocentrifuge.
- (Critique) Aspirer ou une pipette du haut traqué / predivisional bande de cellules et de recueillir le fond swarmer bande dans un nouveau tube.
- Laver les cellules deux fois swarmer dans 1 ml de M2 froid tout en centrifugeant à 15 KXG pendant 3 min.
- Avant l'essorage final, déplacer les cellules dans un 1 ml tube à essai en verre pré-réfrigérés et mesurer la DO 600 de cellules par rapport à une ébauche de M2.
- Reprendre le culot cellulaire final dans 28 ° C M2G à une DO entre 0,3 à 0,4 et secouez cellules / roll à 28 ° C.
REMARQUE: Les rendements typiques sont comprises entre 2 et 4 ml de culture de cellules swarmer. - Pour les expériences de microscopie, au souhaitée points temporels lieu 1 pi de cellules sur un tampon agarose M2G pour l'imagerie.
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Representative Results
Synchronisation donne typiquement deux bandes de cellules (figure 1b): la bande de swarmer, qui a une densité plus élevée, et un / predivisional bande cellulaire pétiole de densité inférieure. Pour assurer des contrôles communs de synchronisation efficace comprennent la surveillance de l'OD 600 et de mesurer les niveaux de protéines CTRA par western blot à des moments du cycle cellulaire distincts. La DO 600 devrait augmenter d'environ deux fois au cours du cycle cellulaire (Figure 2). Le western blot pour le maître régulateur du cycle cellulaire CTRA est un contrôle utile pour vérifier une bonne synchronisation (Figure 2). Ctra est utilisé dans la cellule de swarmer pour bloquer la réplication d'ADN et se dégrade lors de l'apparition de la 10 replication de l'ADN. CTRA est ensuite synthétisé plus tard dans le cycle cellulaire et active la transcription d'une multitude de gènes du développement, y compris de nombreux composants de la flagelle 11,12. Un synchronie retenu aura tson mode d'oscillation du taux de protéines CTRA.
Figure 1. Le cycle cellulaire de Caulobacter crescentus. (A) Une schématique de bande du cycle cellulaire swarmer. Les cellules se différencient en cellules Grouillant traquées compétentes de réplication en rétractant pili, éjecter flagelles, et initier la réplication de l'ADN. Les cercles et thêta structures représentées à l'intérieur des lignes de cellules représentent chromosomes de repos et de réplication. Cellules puis progressent dans le cycle cellulaire construire un seul flagelle à l'opposé de la tige. En cas de division, deux types de cellules uniques sont générés, une réplication bloqué mobiles swarmer cellulaire et une réplication cellulaire compétente traqué stationnaire. (B) Les résultats représentatifs pour la centrifugation de densité. Faible densité de harcèlement et de predivisional cellules flottent près du haut de la pente tandis dense swarmer cellules finissent vers le fond du tube. Barres d'échelle sont une um dans les images de microscopie de phase. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les résultats représentatifs pour une synchronisation réussie swarmer cellulaire. La masse cellulaire mesurée par OD 600 devrait augmenter lentement et, finalement, deux fois tout au long de l'essai. Aliquotes de 1 ml ont été introduits à la pipette dans des cuvettes en matière plastique à partir d'un grand synchronie de la cellule et la DO 600 mesurée en utilisant un spectrophotomètre à des points de temps indiqués. En outre, le cycle cellulaire maître protéine régulatrice Ctra doit être présent dans la cellule swarmer pour bloquer la réplication d'ADN, suivie d'une dégradation rapidecoïncide avec l'initiation de la réplication de l'ADN. Ctra est ensuite régénéré plus tard dans le cycle de cellule pour activer l'expression de nombreux gènes, y compris le développement et flagellaires pili composants critiques. Transferts de Western pour la maîtrise du cycle cellulaire protéine régulatrice CTRA ont été réalisées en prenant aliquots de 1 ml d'une synchronie à grande échelle. Les cellules ont été remises en suspension dans 250 ul de tampon d'échantillon par la DO 600 Laemmlli, séparé sur un TRIS-GLY PAGE 10%, transférés sur du PVDF, et transférés avec un anti-anticorps Ctra. Procédures de synchronie échoué conduisent à CTRA transferts de western sans changement dans les niveaux de protéines. α-Ctra anticorps a été incubé à 12 une dilution de 1: 10 000 pendant 1,5 h à 3% de lait TBST et on lave 3 fois dans du TBST. Goat-α-lapin secondaire a ensuite été ajoutée au 1: 10 000 dilution dans 3% TBST de lait pendant 1 heure, lavé trois fois avec du TBST et imagé sur film en utilisant un kit de détection chimioluminescent. Se il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH 4 Cl | 10 g |
| H 2 O | Remettre en suspension dans 1 L & autoclave |
Tableau 1. 20X M2 sels recette.
| 20X M2 Sels | 50 ml | |
| 0,5 M MgSÛ4 | 1 ml | |
| 20% de glucose | 10 ml | Substitut pour H 2 O dans M2 |
| Sulfate ferreux chélate Solution | 1 ml | |
| 0,1 M de CaCl2 | 5 ml | Ajouter dernière AVprécipitations oid |
| H 2 O | Remplir jusqu'à 1 L | |
| Filtre stérile avec filtre de 0,22 uM |
Tableau 2. M2 et M2G recette.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
