Introduction
Die bakterielle Zellzyklus steuert sowohl die Replikation des Genoms und die Teilung der Tochterzellen. Wichtig ist, wie Antibiotika-Resistenz ist eine wachsende Bedrohung der öffentlichen Gesundheit stellt der bakteriellen Zellzyklus eine ungenutzte Ziel für Antibiotika-Entwicklung.
In dem Bakterium Caulobacter crescentus, führt jede Zellzyklus in einer asymmetrischen Teilung, wodurch zwei Tochterzellen unterschiedlicher Schicksal (1A) 1,2. Eine Tochterzelle erbt eine Geißel und ist beweglich, während die andere Tochter erbt einen Stiel und sitzend. Eine integrierte genetische Schaltung steuert Zellzyklus und Zellschicksal von Transkriptionsregulation, Phospho-Signalisierung und regulierte Proteolyse 3. Zusätzlich Chromosomenreplikation und gleichzeitige Trennung Ausbeute Tochterzellen, die genau eine Kopie des Chromosoms 4 enthalten. Wichtig ist, dass diese beiden Zelltypen schnell durch collo getrennt werdenidal Silicateilchen Dichtezentrifugation im synchronisierbar NA1000 Stamm 5-7 ermöglicht die Isolierung der swarmer Zellen aus dem Rest der Population mit hohen Ausbeuten (1B). Isoliert swarmer Zellen dann synchron gehen durch asymmetrische Zellteilung. Hier haben wir ausführlich das Protokoll für die Synchronisierung von Caulobacter Belastung NA1000. Wir bieten Protokolle und gemeinsame Tipps zur Fehlerbehebung für Klein- und angelegte Synchronisationen. Das experimentelle Verfahren bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die räumlich-zeitliche Kontrolle der Caulobacter Zellzyklus und Zellschicksal zu verhören.
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Protocol
1. Groß Synchrony - Optimal für Western Blot, Microarray / RNA-Seq und Sonstiges Material Intensive Tests
- Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen einem 5 ml O / N-Kultur des Stammes NA1000 durch Schütteln bei 28 ° C in PYE Medium.
- Beimpfen von 0,5 ml der Zellen aus Schritt 1 in 25 ml M2G (Tabellen 1-2) und schüttelt bei 28 ° C, bis die Kultur eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,6 erreicht.
- Impfen Sie die Zellen in 1 l M2G und schütteln bei 28 ° C.
- Sobald OD 600 erreicht 0,5 bis 0,6, bestätigen das Vorhandensein von Zellen mit Hilfe swarmer montiert flüssigen Phase Mikroskopie. Spot 1 ul der Zellen auf einen Objektträger, Deckel mit einem Deckglas und Bild durch Phasenmikroskopie. Bestätigen des Vorhandenseins von swarmer Zellen durch Visualisierung schneller schwimmen Zellen in der Population.
- Spin-Zellen für 15 min bei 7 KXG bei 4 ° C in einem JA-10-Rotor.
- Überstand verwerfen und fügen Sie 180 ml kaltes M2 (Tabellen 1-2) und sanft resuspend alle Zellen mit einer serologischen Pipette. Entsorgen Sie lose pelletierten Zellen; sie sind predivisional und stolzierte Zellen.
- 60 ml kalte Kolloidales Siliciumdioxid-Lösung (unbedingt die Kolloidales Siliciumdioxid-Suspension auch vor der Zugabe zu den Zellen mischen) und mischen Sie die Zellsuspension gut.
- Gießen Sie die Zellsuspension in acht 30-ml-Röhrchen und Spin für 30 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20 Rotor.
HINWEIS: Man sollte zwei verschiedenen Bands zu sehen; die swarmer Band ist das untere Band während stolzierte / predivisional Zellen sind in der Top-Band (Abbildung 1B). - Die Top-Band vorsichtig absaugen und entfernen Sie die Flüssigkeit auf ca. 1 cm über dem swarmer Band (das untere Band).
- (Kritisch) Mit einer Pasteur-Pipette, entfernen Sie vorsichtig die swarmer Band aufnehmen und in ein sauberes Röhrchen. Abzuwaschen Kolloidales Siliciumdioxid, oben das Rohr mit kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor.
- Vorsichtig den Überstand verwerfen und Resuspendieren derZellen in 20 ml kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor.
- Resuspendieren alle Pellets in 30 ml kaltem M2 und messen Sie die OD 600 mit einem Spektralphotometer und leere mit kaltem M2 Medium. Sparen Sie 1 ul für Phase-Bildgebung für swarmer Zellen überprüfen; 90-95% der Zellen sollten Schwärmer sein.
- Anzentrifugieren die Zellen für 5 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. Zellen in 28 ° C M2G Medium, so dass der A 600 ist ~ 0,3-0,4 und beginnen bei 28 ° C schüttelnd.
HINWEIS: Typische Ausbeuten zwischen 30 und 60 ml swarmer Zellkultur von 1L unsynchronisierten Zellen. - Fangen Sie an, Zeitpunkte (Wildtyp-Kultur wird in etwa 135 bis 140 Minuten in Anspruch nehmen zu teilen) 8,9. Zu jedem Zeitpunkt, messen Sie die OD 600. Prüfen, ob die OD 600 nach der Teilung ist ungefähr 2X die Anfangs-OD 600.
- Für Western-Blot oder Genexpressionsassays entfernen 1 ml Aliquots der culture zu den gewünschten Zeitpunkten, Spin-down bei max Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für 30 Sekunden, schnell Dekantieren des Mediums, und Flash Einfrieren des Zellpellets in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die Zellen bei -80 ° C bis Downstream-Analyse.
2. Kleines Synchrony - Optimal für die Mikroskopie
- Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen ein 5 ml O / N-Kultur unter Schütteln bei 28 ° C im M2G.
- Verdünnen Sie in 15 ml M2G (Tabellen 1-2) und wachsen, bis mid-log (OD 600 = 0,5-0,6).
- Spin 6,4 KXG für 10 min bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor und Resuspension in 1 ml kaltem M2 (Tabellen 1-2) und in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Spin bei 15 KXG für 3 min in ein Mikrozentrifugenröhrchen Zellen zu pelletieren, absaugen Überstand, legen Sie die Tablette auf Eis, und resuspendieren in 900 ul kaltem M2.
- Hinzufügen 900 ul kaltem PVP beschichtet kolloidales Siliciumdioxid und Spin für 20 min bei 15 KXG bei 4 ° C in einem Mikrofonrocentrifuge Rohr.
- (Critical) Verwerfen Sie pipettieren aus der Spitze marschierte / predivisional Zellband und sammeln Sie die unten swarmer Band in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- Waschen der swarmer Zellen zwei Mal in 1 ml kaltem M2 während der Zentrifugation bei 15 KXG für 3 min.
- Vor dem letzten Spin, verschieben Sie die Zellen in eine vorgekühlte 1 ml Reagenzglas und messen Sie die OD 600 der Zellen im Vergleich zu einem Rohling aus M2.
- Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 28 ° C M2G bei einer OD von 0,3 bis 0,4 und schütteln / Roll-Zellen bei 28 ° C.
Anmerkung: Typische Ausbeuten liegen zwischen 2 und 4 ml swarmer Zellkultur. - Für die Mikroskopie Experimente, zum gewünschten Zeitpunkt Punkten Platz 1 ul der Zellen auf eine M2G Agarose-Pad für die Bildgebung.
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Representative Results
Synchronisations ergibt typischerweise zwei Banden von Zellen (1B): der swarmer Band, das eine höhere Dichte hat, und eine gestielte / predivisional Zellenband mit geringerer Dichte. Um sicherzustellen, dass effiziente Synchronisation gemeinsame Kontrollen umfassen die Überwachung der OD 600 und Messung der Konzentrationen von Ctra Protein durch Western-Blot auf verschiedene Zellzykluszeitpunkten. Die OD 600 sollte um etwa 2-fach im Verlauf des Zellzyklus (Figur 2) zu erhöhen. Die Western-Blot für die Zellzyklushauptregulator Ctra ist eine sinnvolle Kontrolle, um eine gute Synchronität (Abbildung 2) zu überprüfen. Ctra im swarmer Zelle verwendet, um die DNA-Replikation zu blockieren und ist beim Einsetzen der DNA-Replikation 10 abgebaut. Ctra wird dann später in den Zellzyklus synthetisiert und aktiviert die Transkription einer Reihe von Entwicklungsgenen, einschließlich vieler Komponenten des Flagellums 11,12. Eine erfolgreiche Synchronisation wird tseine oszillierende Muster der Ctra Protein-Ebene.
Abbildung 1. Der Zellzyklus von Caulobacter crescentus. (A) Eine Karikatur Schema des swarmer Zellzyklus. Die swarmer Zellen differenzieren sich in replikationskompetentem stolzierte Zellen durch Zurückziehen Pili, Auswerfen Geißeln und Initiierung der DNA-Replikation. Die Kreise und Theta im Inneren der Zelle Umrissen gezeigten Strukturen darstellen Ruhe und Replikation von Chromosomen. Zellen dann durch den Zellzyklus ein einheitliches, Geißel an der Stange gegenüber dem Stiel Fortschritt. Bei der Division, zwei einzigartige Zelltypen erzeugt werden, blockiert ein Replikations beweglichen swarmer Zelle und einer replikationskompetentem stationären stolzierte Zelle. (B) Repräsentative Ergebnisse für Dichtezentrifugation. Geringere Dichte gestielt und Predivisional Zellen schwimmen in der Nähe der Spitze des Gradienten, während dichte swarmer Zellen am Ende in Richtung der Unterseite des Rohres. Maßstabsbalken sind 1 & mgr; m in der Phase-Mikroskopie-Aufnahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für eine erfolgreiche swarmer Zelle synchron. Die Zellmasse durch OD 600 gemessen, sollte langsam zunehmen und schließlich im Verlauf des Assays zu verdoppeln. 1 ml Aliquots wurden in Kunststoffküvetten aus einer großen Zelle Synchronität und die OD 600 gemessen mit einem Spektrophotometer bei den angegebenen Zeitpunkten pipettiert. Zusätzlich sollte das Ctra Zellzyklusmaster regulatorisches Protein in der swarmer Zelle vorhanden sein, um die DNA-Replikation, gefolgt von einem schnellen Abbau blockierenübereinstimmend mit der Initiation der DNA-Replikation. Ctra wird dann später in den Zellzyklus regeneriert werden, um die Expression vieler Entwicklungsgenen, einschließlich kritischer Flagella und Pili Komponenten zu aktivieren. Western-Blots für die Zellzyklus-Regulatorprotein Master Ctra wurden hergestellt, indem 1 ml Aliquots einer großen Gleichtakt durchgeführt. Die Zellen wurden in 250 ul Probenpuffer Laemmlli pro OD 600 resuspendiert, auf einem 10% Tris-Gly-PAGE, auf PVDF übertragen getrennt und mit Anti-Ctra Antikörper geblottet. Fehlgeschlagen Synchronität Verfahren führen zu Ctra Western Blots ohne Veränderung der Protein-Ebene. α-Ctra Antikörper 12 wurde bei einer 1: 10.000-Verdünnung für 1,5 h in 3% Milch TBST und 3-mal gewaschen, in TBST. Goat-α-Kaninchen-Sekundär wurde dann bei 1 hinzugefügt: 10.000 Verdünnung in 3% Milch TBST 1 Stunde, 3 mal mit TBST gewaschen und auf Film aufgenommen mit einer Chemilumineszenznachweis Kit. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH 4 Cl | 10 g |
| H 2 O | Resuspendieren in 1 L & Autoklav |
Tabelle 1 20X M2 Salze Rezept.
| 20X M2 Salze | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO 4 | 1 ml | |
| 20% Glucose | 10 ml | Ersatz für H 2 O in M2 |
| Eisensulfat Chelatlösung | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl & sub2; | 5 ml | In letzter avoid Niederschlag |
| H 2 O | Füllen Sie bis zu 1 L | |
| Sterilfilter mit 0,22 & mgr; |
Tabelle 2. M2 und M2G Rezept.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
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