Introduction
מחזור תא החיידק שולט שני השכפול של הגנום וחלוקת תאי בת. חשוב לציין, כעמידות לאנטיביוטיקה היא איום הולך וגדל לבריאות ציבור, מחזור תא החיידק מציג יעד שלא נוצל לפיתוח אנטיביוטיקה.
בcrescentus Caulobacter החיידק, כל מחזור תא מוביל לחלוקה סימטרית, מניב שני תאי בת של גורלות שונים (איור 1 א) 1,2. תא בת אחת יורש השוטון והוא ניע ואילו הבת אחרת יורשת גבעול ונייח. מעגל משולב גנטי שולט התקדמות מחזור התא ותא גורל על ידי רגולציה תעתיק, phospho-איתות, וproteolysis המוסדרת 3. בנוסף, שכפול כרומוזום ותאים בת תשואת הפרדה במקביל המכילים עותק אחד בדיוק של כרומוזום 4. חשוב לציין, אלה שני סוגי התאים ניתן להפריד במהירות על ידי Colloצנטריפוגה idal חלקיקי סיליקה צפיפות במתח NA1000 synchronizable 5-7 המאפשר בידוד של תאי swarmer משאר האוכלוסייה עם תשואות גבוהות (איור 1). מבודד swarmer תאים ולאחר מכן להמשיך באופן סינכרוני באמצעות חלוקת תא סימטרית. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול המשמשים לסנכרון NA1000 מתח Caulobacter. אנו מספקים פרוטוקולים ועצות לפתרון בעיות משותפות לשני סנכרונים מידה גדול וקטנה בקנה מידה. הליך ניסיוני זה מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את שליטת spatiotemporal של מחזור תא Caulobacter וגורל תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בתיאום בקנה מידה גדולה - אופטימלי עבור מערבי כתם, Microarray / RNA-Seq, ומבחנים עתירי חומרים אחרים
- ממניות מקפיא או צלחת, לגדול 5 מיליליטר O / תרבות N של NA1000 מתח על ידי טלטול על 28 מעלות צלזיוס במדיום פאי.
- לחסן 0.5 מיליליטר של התאים משלב 1 ב 25 מיליליטר של M2G (לוחות 1-2) ולנער בגיל 28 ° C עד התרבות מגיעה OD 600 בין 0.5 ו -0.6.
- לחסן את התאים לתוך 1 ליטר של M2G ולנער על 28 מעלות צלזיוס.
- ברגע שמגיע OD 600 0.5-0.6, לאשר את קיומו של swarmer תאים באמצעות מיקרוסקופיה שלב הנוזלית רכוב. מקום 1 μl של תאים בשקופית זכוכית, לכסות עם תלוש כיסוי, ותמונה על ידי מיקרוסקופ שלב. לאשר את קיומם של תאי swarmer על ידי הדמיה תאים במהירות השחייה באוכלוסייה.
- ספין תאים במשך 15 דקות בשעה 7 kxg על 4 מעלות צלזיוס בJA-10 הרוטור.
- בטל supernatant ולהוסיף 180 מיליליטר של M2 הקר (לוחות 1-2) ומיל בעדינותuspend כל התאים באמצעות pipet סרולוגיות. בטל תאי pelleted רופף; הם תאי predivisional וצעדה.
- להוסיף 60 מיליליטר של תמיסת סיליקה Colloidal הקרה (הקפד לערבב את ההשעיה סיליקה Colloidal היטב לפני הוספה לתאים) ומערבבים את ההשעיה התא היטב.
- יוצקים את ההשעיה התא לשמונה 30 מיליליטר צינורות וספין למשך 30 דקות ב 6.4 kxg על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור.
הערה: יש לראות את שתי להקות שונות; להקת swarmer היא הרצועה התחתונה בזמן שתאים ארבו / predivisional נמצאים בלהקה העליונה (איור 1). - בזהירות לשאוב הלהקה העליונה והסר את הנוזל ל~ 1 סנטימטר מעל ללהקת swarmer (הלהקה התחתונה).
- (קריטי) שימוש pipet פסטר, להסיר בזהירות את להקת swarmer ומקום לתוך צינור נקי. כדי לשטוף את סיליקה Colloidal, ראש הצינור את עם M2 הקר וספין במשך 10 דקות ב 6.4 kxg על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור.
- להשליך בזהירות את supernatant ו resuspendתאים ב 20 מיליליטר של M2 הקר וספין במשך 10 דקות ב 6.4 kxg על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור.
- Resuspend כל כדורים לתוך 30 מיליליטר של M2 הקר ולמדוד את OD 600 באמצעות ספקטרופוטומטר וריק באמצעות מדיום M2 קר. להציל 1 μl הדמיה שלב כדי לבדוק swarmer תאים; 90-95% מתאים צריכים להיות swarmers.
- ספין למטה התאים 5 דקות בkxg 6.4 על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור. תאי Resuspend ב -28 ° C בינוני M2G כך ש600 הוא ~ 0.3-0.4 ולהתחיל רועד ב 28 מעלות צלזיוס.
הערה: תשואות אופייניות הן בין 30 ל 60 מ"ל של swarmer תרבית תאים מ1 הליטר של תאים לא מסונכרנים. - להתחיל לקחת נקודות זמן (תרבות מהסוג בר תיקח כ 135-140 דקות לחלק) 8,9. בכל נקודת זמן, למדוד את OD 600. בדוק שOD 600 לאחר החלוקה הוא כ 2X OD הראשוני 600.
- עבור מבחני כתם או ביטוי גנים מערביים, להסיר aliquots 1mL של מ"קlture בנקודות הזמן הרצוי, ספין למטה במהירות מקסימלית בצנטריפוגה שולחן למשך 30 שניות, מהירות למזוג או לשאוב את המדיום, ופלאש להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי. אחסן את התאים ב -80 ° C עד ניתוח במורד הזרם.
2. בתיאום בקנה מידה קטנה - אופטימלי עבור מיקרוסקופית
- ממניות מקפיא או צלחת, לגדול 5 מיליליטר O / תרבות N רועדת ב 28 ° C בM2G.
- לדלל ב -15 מיליליטר של M2G (לוחות 1-2) ולגדול עד אמצע יומן (OD 600 = 0.5-0.6).
- ספין 6.4 kxg במשך 10 דקות ב 4 ° C ב20-JA הרוטור, וגלול ב 1 מיליליטר M2 (לוחות 1-2) קרים ולהעביר צינור microcentrifuge 2 מיליליטר.
- ספין ב 15 kxg במשך 3 דקות בצינור microcentrifuge לגלולת תאים, לשאוב את supernatant, לשים את הכדור על קרח, וגלול ב900 μl של M2 הקר.
- להוסיף 900 μl של PVP הקר מצופה סיליקה וספין colloidal במשך 20 דקות ב 15 kxg על 4 מעלות צלזיוס במיקרופוןצינור rocentrifuge.
- (קריטי) לשאוב או pipet את החלק העליון ארבה / להקת תא predivisional ולאסוף התחתון swarmer להקה לתוך צינור microcentrifuge חדש.
- שוטף את תאי swarmer שתי פעמים ב 1 מיליליטר של M2 הקר תוך צנטריפוגה ב 15 kxg במשך 3 דקות.
- לפני הסיבוב האחרון, להעביר את התאים לתוך מבחנת זכוכית 1 מיליליטר מראש צונן ולמדוד את OD 600 של התאים בהשוואה לריק של M2.
- Resuspend תא גלולה הסופי ל -28 מעלות צלזיוס M2G בOD בין 0.3-0.4 ולנער תאים / גליל ב 28 מעלות צלזיוס.
הערה: תשואות אופייניות הן בין 2 ל 4 מיליליטר של תרבית תאי swarmer. - לניסויים במיקרוסקופ, בμl 1 מקום נקודות זמן הרצוי של תאים על גבי משטח agarose M2G להדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סנכרון בדרך כלל תשואות שתי להקות של תאים (איור 1): להקת swarmer, שבו יש צפיפות גבוהה יותר, ולהקה ארבה / predivisional תא של צפיפות נמוכה יותר. כדי להבטיח בקרה משותפת סנכרון יעיל כוללת ניטור OD 600 ומדידת הרמות של חלבון CTRA על ידי כתם מערבי בנקודות זמן מחזור התא נפרדות. OD 600 צריך להגדיל בכ 2 לקפל במהלך מחזור התא (איור 2). הכתם המערבי לרגולטור הראשי מחזור התא CTRA הוא שליטה שימושית כדי לוודא תיאום טוב (איור 2). CTRA מנוצל בתא swarmer לחסום שכפול הדנ"א ונפגע על תחילתה של DNA שכפול 10. CTRA אז מסונתז בהמשך מחזור התא ומפעיל שעתוק של מארח של גני התפתחותיים הכוללים רכיבים רבים של השוטון 11,12. תיאום מוצלח יהיה לי tדפוס נדנודו של רמות חלבון CTRA.
איור 1. מחזור התא של crescentus Caulobacter. (א) סכמטי קריקטורה של מחזור תא swarmer. תאי swarmer להתמיין לתאים ארבו מוסמכים שכפול על ידי חוזר בי פילים, ולהוציא שוטונים, וייזום שכפול הדנ"א. החוגים ותטא מבנים מוצגים בתוך קווי המתאר התא מייצגים כרומוזומים שקטים ומשכפלים. תאים אז להתקדם דרך מחזור תא בניית השוטון אחת בקוטב נגדי הגבעול. על החלוקה, שני סוגים ייחודיים של תאים נוצרים, שכפול חסום ניע swarmer תא ותא נייח מוסמך שכפול ארב. (ב) תוצאות עבור נציג צנטריפוגה צפיפות. צפיפות נמוכה יותר ארבה וpredivתאי isional לצוף בחלק העליון של השיפוע בזמן צפוף swarmer תאים בסופו של לכיוון החלק התחתון של הצינור. ברים סולם הם מיקרומטר 1 בתמונות מיקרוסקופי שלב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תוצאות עבור נציג מוצלח swarmer תיאום תא. מסת התאים שנמדדה על ידי OD 600 צריכה להגדיל לאט ובסופו של דבר להכפיל במהלך הקורס של assay. 1 מיליליטר aliquots היה pipetted לcuvettes פלסטיק מתיאום תא גדול וOD 600 נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר בנקודות זמן המצוין. בנוסף, חלבון אדון מחזור תא CTRA הרגולציה צריך להיות נוכח בתא swarmer לחסום שכפול הדנ"א, ואחרי השפלה מהירהביחד עם החניכה של שכפול הדנ"א. CTRA לאחר מכן מחדש מאוחר יותר במחזור התא כדי להפעיל ביטוי של גנים רבים התפתחותיים כוללים רכיבי flagellar ופילים קריטיים. כתמים מערביים לאדון מחזור תא חלבון רגולטורי CTRA בוצעו על ידי לקיחת 1 aliquots מיליליטר של תיאום בקנה מידה גדולה. התאים היו resuspended ב250 μl חיץ מדגם Laemmlli לOD 600, מופרדים על 10% עמוד טריס-גלאי, הועבר לPVDF, ומחקו עם נוגדן אנטי CTRA. נהלי תיאום נכשל להוביל לכתמים מערביים CTRA ללא שינוי ברמות חלבון. נוגדן α-CTRA 12 הודגרה בדילול 1: 10,000 תמורת 1.5 שעות ב -3% TBST חלב ורחץ 3 פעמים בTBST. העז-α-ארנב המשני אז נוספה ב1: 10,000 דילול בחלב 3% TBST עבור שעה 1, שטף 3 פעמים עם TBST, וצלם בסרט באמצעות ערכת זיהוי chemiluminescent. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| Na 2 4 HPO | 17.4 g |
| KH 2 PO 4 | 10.6 g |
| NH 4 Cl | 10 גרם |
| H 2 O | Resuspend ב 1 L & החיטוי |
טבלת 1. מתכון מלחים M2 20X.
| מלחים M2 20X | 50 מיליליטר | |
| 0.5 M MgSO 4 | 1 מיליליטר | |
| גלוקוז 20% | 10 מיליליטר | תחליף לH 2 O בM2 |
| ברזלי סולפט Chelate פתרון | 1 מיליליטר | |
| 0.1 M CaCl 2 | 5 מיליליטר | הוספה האחרונה באבממטרים OID |
| H 2 O | למלא עד 1 ליטר | |
| סינון סטרילי עם מסנן 0.22 מיקרומטר |
הטבלה 2. M2 ומתכון M2G.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
