Introduction
Il ciclo cellulare batterica controlla sia la replicazione del genoma e la divisione di cellule figlie. È importante sottolineare che, come la resistenza agli antibiotici è una crescente minaccia per la salute pubblica, il ciclo cellulare batterica presenta un obiettivo non sfruttata per lo sviluppo di antibiotici.
In batterio Caulobacter crescentus, ogni ciclo cellulare porta ad una divisione asimmetrica, ottenendo due cellule figlie di sorti diverse (Figura 1A) 1,2. Una cellula figlia eredita un flagello ed è mobile, mentre l'altra figlia eredita un gambo ed è sessile. Un circuito genetico integrato controlla la progressione del ciclo cellulare e destino cellulare da regolazione trascrizionale, fosfo-segnalazione, e proteolisi regolata 3. Inoltre, la replicazione dei cromosomi e cellule figlie rendimento segregazione simultanee che contengono esattamente una copia del cromosoma 4. È importante sottolineare che questi due tipi di cellule possono essere rapidamente separati da colloIdal particella di silice centrifugazione densità nel ceppo sincronizzabile NA1000 5-7 consente l'isolamento delle cellule swarmer dal resto della popolazione con rese elevate (Figura 1B). Isolato swarmer cellule quindi procedere in modo sincrono attraverso la divisione cellulare asimmetrica. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo usato per la sincronizzazione Caulobacter ceppo NA1000. Forniamo protocolli e risoluzione dei problemi comuni sia larga e piccola scala sincronizzazioni. Questa procedura sperimentale fornisce un potente strumento per interrogare il controllo spazio-temporale del ciclo cellulare Caulobacter e il destino delle cellule.
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Protocol
1. larga scala Synchrony - ottimale per Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e altro materiale saggi Intensive
- Da uno stock congelatore o un piatto, crescere a 5 ml O / N cultura del ceppo NA1000 agitando a 28 ° C in PYE medio.
- Inoculare 0,5 ml delle cellule dal punto 1 in 25 ml di M2G (Tabelle 1-2) e agitare a 28 ° C fino alla cultura raggiunge un OD 600 tra 0,5 e 0,6.
- Inoculare le cellule in 1 L di M2G e agitare a 28 ° C.
- Una volta OD 600 raggiunge 0.5 a 0.6, confermare la presenza di swarmer cellule utilizzando liquido montato microscopio fase. Spot 1 ml di cellule su un vetrino, coprire con un vetrino, e l'immagine al microscopio fase. Confermare la presenza di cellule Swarmer visualizzando cellule in rapida nuoto nella popolazione.
- Spin cellule per 15 minuti a 7 kxg a 4 ° C in un rotore JA-10.
- Scartare il surnatante e aggiungere 180 ml di freddo M2 (Tabelle 1-2) e res delicatamenteuspend tutte le cellule utilizzando una pipetta sierologica. Eliminare le celle liberamente pellet; sono cellule predivisional e se ne andò.
- Aggiungere 60 ml di soluzione fredda di silice colloidale (assicuratevi di mescolare la sospensione di silice colloidale bene prima di aggiungere alle cellule) e mescolare bene la sospensione cellulare.
- Versare la sospensione cellulare in otto 30 ml provette e centrifugare per 30 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20.
NOTA: Si dovrebbe vedere due bande distinte; la band Swarmer è la banda più bassa, mentre le cellule / predivisional stalking sono nella fascia superiore (Figura 1B). - Aspirare accuratamente la banda superiore e rimuovere il liquido ~ 1 cm sopra la banda swarmer (la banda inferiore).
- (Critico) Usando una pipetta Pasteur, rimuovere con attenzione la band swarmer e posto in una provetta pulita. Per lavare via la silice colloidale, superiore al tubo via con freddo M2 e girare per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un JA-20 del rotore.
- Eliminare attentamente il surnatante e risospendere ilcellule in 20 ml di freddo M2 e centrifuga per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20.
- Risospendere i pellet in 30 ml di freddo M2 e misurare la OD 600 utilizzando uno spettrofotometro e vuoto utilizzando freddo medio M2. Salva 1 ml per l'imaging di fase per verificare swarmer cellule; 90-95% delle cellule dovrebbe essere sciami.
- Centrifugare le cellule per 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. Risospendere le cellule in 28 ° C M2G media in modo che la A 600 è ~ 0,3-0,4 e iniziare agitazione a 28 ° C.
NOTA: i rendimenti tipici sono tra 30 e 60 ml di swarmer coltura cellulare da 1L di cellule non sincronizzate. - Cominciare a prendere punti di tempo (la cultura di tipo selvatico richiede circa 135-140 minuti per dividere) 8,9. Ad ogni punto di tempo, misurare il diametro esterno 600. Controllare che la OD 600 dopo la divisione è pari a circa 2 volte l'OD iniziale 600.
- Per macchia o di espressione genica test occidentali, rimuovere 1 ml aliquote della culture nei punti di tempo desiderato, centrifugare a velocità massima in una centrifuga da tavolo per 30 sec, rapidamente decantare o aspirare il mezzo, e flash congelare il pellet cellulare in azoto liquido. Conservare le cellule a -80 ° C fino all'analisi valle.
2. piccola scala Synchrony - ottimale per Microscopia
- Da uno stock congelatore o un piatto, crescere un / cultura 5 ml O N agitazione a 28 ° C in M2G.
- Diluire in 15 ml di M2G (Tabelle 1-2) e crescere fino a metà-log (OD 600 = 0.5-0.6).
- Spin a 6.4 kxg per 10 minuti a 4 ° C in un JA-20 del rotore, e risospendere in 1 ml freddi M2 (Tabelle 1-2) e trasferimento in una provetta 2 ml.
- Spin a 15 kxg per 3 minuti in una provetta a pellet cellule, aspirare il surnatante, mettere il pellet sul ghiaccio, e risospendere in 900 ml di freddo M2.
- Aggiungere 900 ml di PVP freddo rivestiti di silice colloidale e girare per 20 minuti a 15 kxg a 4 ° C in un microfonotubo rocentrifuge.
- (Critico) Aspirare o pipettare dalla cima pedinato banda di cellule / predivisional e raccogliere il fondo swarmer banda in una nuova provetta.
- Lavare le cellule due volte swarmer in 1 ml di freddo M2 mentre centrifugazione a 15 kxg per 3 min.
- Prima della centrifuga finale, spostare le celle in un pre-raffreddata 1 ml provetta di vetro e misurare la OD 600 delle cellule rispetto ad un bianco di M2.
- Risospendere il pellet cellulare finale in 28 ° C M2G ad un OD tra 0,3-0,4 e scuotere cellule / rotolo a 28 ° C.
NOTA: i rendimenti tipici sono tra 2 e 4 ml di coltura cellulare swarmer. - Per gli esperimenti di microscopia, a intervalli di tempo desiderato posto 1 ml di cellule su un pad agarosio M2G per l'imaging.
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Representative Results
Sincronizzazione tipicamente produce due bande di cellule (Figura 1B): la banda swarmer, che ha una densità più elevata, e una banda cellulare pedinato / predivisional di densità inferiore. Per garantire la sincronizzazione efficiente controlli comuni comprendono il monitoraggio della OD 600 e misurando i livelli di proteina Ctra da Western Blot in distinte del ciclo cellulare punti di tempo. La OD 600 dovrebbe aumentare di circa 2 volte nel corso del ciclo cellulare (Figura 2). Il western blot per il principale regolatore del ciclo cellulare Ctra è un controllo utile per verificare una buona sincronia (Figura 2). CTRA viene utilizzato nella cella swarmer per bloccare la replicazione del DNA e si degrada sulla insorgenza della replicazione del DNA 10. CTRA viene poi sintetizzato tardi nel ciclo cellulare e attiva la trascrizione di una serie di geni dello sviluppo tra cui molti componenti flagello 11,12. Una sincronia successo avrà til suo modello oscillante dei livelli di proteine ctra.
Figura 1. Il ciclo cellulare di Caulobacter crescentus. (A) Uno schema cartone animato del ciclo cellulare swarmer. Le cellule Swarmer differenziano in cellule stalking competenti replica ritraendo pili, espulsione flagelli, e di avviare la replicazione del DNA. I cerchi e theta strutture mostrate all'interno dei contorni cellulari rappresentano cromosomi quiescenti e replica. Le cellule poi progrediscono nel ciclo cellulare la costruzione di un singolo flagello al polo opposto del gambo. Dopo la divisione, si generano due tipi di cellule uniche, una replica bloccato mobili swarmer cellulare e un competente cellulare pedinato stazionario replica. (B) Risultati rappresentativi per centrifugazione densità. Densità inferiore pedinato e predivcellule isional galleggiare vicino alla parte superiore del gradiente mentre densa swarmer cellule finiscono verso il fondo della provetta. Barre di scala sono 1 micron di immagini di microscopia di fase. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Risultati rappresentativi per il successo swarmer sincronia cellulare. La massa cellulare misurata dai OD 600 dovrebbe aumentare lentamente e infine raddoppiare nel corso del test. 1 ml aliquote sono stati pipettati in cuvette di plastica da un grande sincronia cellulare e la OD 600 misurata utilizzando uno spettrofotometro nei punti di tempo indicati. Inoltre, il ciclo di cellule di proteina regolatrice Ctra dovrebbe essere presente nella cella swarmer per bloccare la replicazione del DNA, seguita da un rapido degradocoincidente con l'inizio della replicazione del DNA. CTRA viene rigenerato più avanti nel ciclo cellulare per attivare l'espressione di molti geni dello sviluppo delle componenti flagellari e Pili critici. Western blot per master ciclo cellulare proteina regolatrice Ctra sono stati eseguiti tenendo aliquote di 1 ml di una sincronia su larga scala. Le cellule sono state risospese in 250 microlitri tampone campione Laemmlli per OD 600, separate su TRIS-Gly PAGE 10%, trasferiti a PVDF e cancellati con anticorpo anti-CTRA. Procedure sincronia falliti portano a ctra macchie occidentali senza alcun cambiamento nei livelli di proteina. α-CTRA anticorpo 12 è stata incubata a una diluizione 1: 10.000 per 1,5 ore a 3% di latte TBST e lavato 3 volte in TBST. Capra-α-rabbit secondaria è stata poi aggiunta a 1: 10.000 diluizione in 3% di latte TBST per 1 ora, lavato 3 volte con TBST, e ripreso su pellicola utilizzando un kit di rivelazione chemiluminescente. favoreclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH 4 Cl | 10 g |
| H 2 O | Risospendere in 1 L & autoclave |
Tabella 1. 20X M2 Sali Ricetta.
| 20X M2 Sali | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO4 | 1 ml | |
| 20% glucosio | 10 ml | Sostituto per H 2 O in M2 |
| Solfato di ferro chelato Solution | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl 2 | 5 ml | Aggiungi scorso AVprecipitazioni oid |
| H 2 O | Riempire fino a 1 L | |
| Filtro sterile con filtro 0,22 micron |
Tabella 2. M2 e M2G ricetta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
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