Introduction
El ciclo celular bacteriana controla tanto la replicación del genoma y la división de las células hijas. Es importante destacar que, como la resistencia a los antibióticos es una amenaza creciente para la salud pública, el ciclo celular bacteriana presenta un objetivo sin explotar para el desarrollo de antibióticos.
En la bacteria Caulobacter crescentus, cada ciclo celular conduce a una división asimétrica, produciendo dos células hijas de diferentes destinos (Figura 1A) 1,2. Una célula hija hereda un flagelo y es móvil, mientras que la otra hija hereda un tallo y es sésiles. Un circuito genético integrado controla la progresión del ciclo celular y destino celular mediante la regulación transcripcional, fosfo-señalización, y proteólisis regulada 3. Además, la replicación de cromosomas y células hijas rendimiento segregación concurrentes que contienen exactamente una copia del cromosoma 4. Es importante destacar que estos dos tipos de células se pueden separar rápidamente por colloidal partícula de sílice centrifugación de densidad en la cepa NA1000 sincronizable 5-7 permitiendo el aislamiento de las células swarmer del resto de la población con altos rendimientos (Figura 1B). Aislado swarmer células luego proceder de forma sincrónica a través de la división celular asimétrica. Aquí, detallamos el protocolo utilizado para sincronizar Caulobacter cepa NA1000. Proporcionamos protocolos y sugerencias para solucionar problemas comunes para ambos de gran y pequeña escala sincronizaciones. Este procedimiento experimental proporciona una poderosa herramienta para interrogar el control espacio-temporal del ciclo celular Caulobacter y destino celular.
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Protocol
1. Sincronía a gran escala - óptimo para el Western Blot, Microarray / RNA-Seq, y otros ensayos intensivos de materiales
- De una acción congelador o una placa, crecer un 5 ml O / N de la cultura NA1000 cepa por agitación a 28 ° C en medio PYE.
- Inocular 0,5 ml de las células de la etapa 1 en 25 ml de M2G (Tablas 1-2) y agitar a 28 ° C hasta que el cultivo alcanza una OD 600 entre 0,5 y 0,6.
- Se inoculan las células en 1 l de M2G y agitar a 28 ° C.
- Una vez DO600 alcanza de 0,5 a 0,6, confirmar la presencia de swarmer células utilizando microscopía fase líquida montada. Punto 1 l de células sobre un portaobjetos de vidrio, cubierta con una hoja de la cubierta, y la imagen por microscopía de fase. Confirmar la presencia de células swarmer mediante la visualización de las células que nadan rápidamente en la población.
- Girar las células durante 15 min a 7 kxg a 4 ° C en un rotor JA-10.
- Descartar el sobrenadante y añadir 180 ml de frío M2 (Tablas 1-2) y cosa suavementeuspend todas las células utilizando una pipeta serológica. Deseche células poco granuladas; que son las células predivisional y acechado.
- Añadir 60 ml de solución de sílice coloidal frío (asegúrese de mezclar la suspensión de sílice coloidal bien antes de añadir a las células) y mezclar bien la suspensión celular.
- Verter la suspensión de células en ocho tubos de 30 ml y centrifugar durante 30 min a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20.
NOTA: Hay que ver a dos bandas distintas; la banda swarmer es la banda más baja mientras acechadas células / predivisional están en la banda superior (Figura 1B). - Aspirar con cuidado la banda superior y retire el líquido a ~ 1 cm por encima de la banda swarmer (la banda inferior).
- (Crítica) Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la banda swarmer y colocar en un tubo limpio. Para lavar la sílice coloidal, parte superior del tubo con frío M2 y centrifugado durante 10 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20.
- Desechar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender ellas células en 20 ml de frío M2 y centrifugado durante 10 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20.
- Resuspender todas las pastillas en 30 ml de frío M2 y medir la OD 600 usando un espectrofotómetro y en blanco utilizando medio M2 frío. Guardar 1 l para la imagen de fase para comprobar swarmer células; 90-95% de las células debería ser enjambres.
- Centrifugar las células durante 5 minutos a 6,4 kxg a 4 ° C en un rotor JA-20. Resuspender las células en 28 ° C M2G medio de modo que el A 600 es de ~ 0,3-0,4 y comenzar agitación a 28 ° C.
NOTA: Los rendimientos típicos son entre 30 y 60 ml de swarmer cultivo celular de 1 litro de células no sincronizadas. - Comience a tomar los puntos de tiempo (la cultura de tipo salvaje tomará aproximadamente 135-140 minutos para dividir) 8,9. En cada punto de tiempo, medir el OD 600. Compruebe que el OD 600 después de la división es de aproximadamente 2 veces la DO inicial 600.
- Para ensayos de transferencia o de expresión génica occidentales, retirar alícuotas de 1 ml de la culture en los tiempos deseados, de girar a velocidad máxima en una centrífuga de mesa durante 30 segundos, rápidamente decantar o aspirar el medio, y el flash congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido. Guarde las células a -80 ° C hasta el análisis de aguas abajo.
2. Sincronía pequeña escala - Óptimo para Microscopía
- De una acción congelador o una placa, crecer un cultivo de 5 ml O / N agitación a 28 ° C en M2G.
- Diluir en 15 ml de M2G (Tablas 1-2) y crecer hasta mediados de log (OD 600 = 0,5 a 0,6).
- Giran a 6,4 kxg durante 10 min a 4 ° C en un rotor JA-20, y se vuelve a suspender en 1 ml M2 frías (Tablas 1-2) y transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
- Giran a 15 kxg durante 3 min en un tubo de microcentrífuga para sedimentar las células, aspirar el sobrenadante, el sedimento se puso en hielo, y resuspender en 900 l de frío M2.
- Añadir 900 l de PVP frío recubierto de sílice coloidal y centrifugado durante 20 minutos a 15 kxg a 4 ° C en un microtubo rocentrifuge.
- (Crítica) Aspirar o una pipeta de la parte superior de banda celular acechado / predivisional y recoger la parte inferior swarmer banda en un nuevo tubo de microcentrífuga.
- Lavar las células dos veces en swarmer 1 ml de frío, mientras que M2 centrifugación a 15 kxg durante 3 min.
- Antes de que el centrifugado final, mover las células en un tubo de ensayo de vidrio de 1 ml pre-enfriada y medir la OD 600 de las células en comparación con un blanco de M2.
- Resuspender el precipitado celular final a 28 ° C M2G a una DO entre 0,3 a 0,4 y agitar células / rollo a 28 ° C.
NOTA: Los rendimientos típicos son entre 2 y 4 ml de cultivo celular swarmer. - Para los experimentos de microscopía, a la deseada puntos temporales lugar 1 l de células sobre una almohadilla de agarosa M2G para la imagen.
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Representative Results
Sincronización típicamente produce dos bandas de células (Figura 1B): la banda swarmer, que tiene una densidad más alta, y una banda de células tallo / predivisional de menor densidad. Para asegurar los controles comunes de sincronización eficiente incluyen la supervisión de la OD 600 y la medición de los niveles de proteína CtrA por Western blot en momentos distintos del ciclo celular. La OD 600 debería aumentar en aproximadamente 2 veces durante el curso del ciclo celular (Figura 2). El western blot para el maestro regulador del ciclo celular CtrA es un control útil para verificar una buena sincronía (Figura 2). CtrA se utiliza en la célula swarmer para bloquear la replicación del ADN y se degrada en el inicio de la replicación de ADN 10. CtrA A continuación, se sintetizó más tarde en el ciclo celular y activa la transcripción de una serie de genes de desarrollo incluyendo muchos componentes del flagelo 11,12. Una sincronía exitoso tendrá tsu patrón de oscilación de los niveles de proteína ctra.
Figura 1. El ciclo celular de Caulobacter crescentus. (A) Un diagrama esquemático de dibujos animados del ciclo celular swarmer. Las células swarmer se diferencian en células acechadas competentes de replicación retrayendo pili, expulsando flagelos, y el inicio de la replicación del ADN. Los círculos y theta estructuras que se muestran dentro de los contornos celulares representan cromosomas en reposo y que se replican. Las células luego progresan a través del ciclo celular la construcción de un solo flagelo en el polo opuesto del tallo. Tras la división, se generan dos tipos de células únicas, una réplica bloqueado móviles swarmer célula y una célula estacionaria de replicación competente de tallo. (B) Los resultados representativos para centrifugación de densidad. Baja densidad acosada y predivcélulas isional flotan cerca de la parte superior del gradiente mientras densa swarmer células terminan hacia la parte inferior del tubo. Las barras de escala son de 1 micra de imágenes de microscopía de fase. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los resultados representativos para el éxito de swarmer sincronía celular. La masa celular medido por OD 600 debe aumentar lentamente y en última instancia duplicar durante el curso del ensayo. Alícuotas de 1 ml se pipetearon en cubetas de plástico de un gran sincronía celular y la OD 600 medido utilizando un espectrofotómetro a los puntos de tiempo indicados. Además, la proteína reguladora del ciclo celular CtrA maestro debe estar presente en la célula swarmer para bloquear la replicación del ADN, seguido por una rápida degradacióncoincidente con el inicio de la replicación del ADN. CtrA continuación, se regenera más tarde en el ciclo celular para activar la expresión de muchos genes de desarrollo incluyendo componentes críticos flagelares y pili. Transferencias de Western para maestro ciclo celular proteína reguladora CtrA se realizaron tomando alícuotas de 1 ml de una sincronía a gran escala. Las células se resuspendieron en 250 l de tampón de muestra Laemmlli por OD 600, separados sobre un TRIS-GLY PAGE al 10%, se transfirieron a PVDF, y se transfirieron con anticuerpo anti-CtrA. Procedimientos sincronía fallidas conducen a Ctra transferencias Western, sin cambios en los niveles de proteína. anticuerpo α-CtrA 12 se incubó a una dilución 1: 10.000 durante 1,5 h en 3% de leche TBST y se lavó 3 veces en TBST. Cabra-α-conejo secundaria luego se añadió a dilución 1: 10.000 en TBST 3% de leche durante 1 hora, se lavó 3 veces con TBST, y la imagen en la película usando un kit de detección quimioluminiscente. Por favorhaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH 4 Cl | 10 g |
| H 2 O | Volver a suspender en 1 L & autoclave |
Tabla 1. 20X M2 Sales receta.
| 20X M2 Sales | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO 4 | 1 ml | |
| 20% de glucosa | 10 ml | Sustituto de H 2 O en M2 |
| Sulfato Ferroso Solución Chelate | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl 2 | 5 ml | Añadir pasado a AVprecipitación oid |
| H 2 O | Llenar hasta 1 L | |
| Filtro estéril con un filtro de 0,22 mM |
Tabla 2. M2 y M2G receta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
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