Introduction
Den bakterielle celle cyklus styrer både replikation af genomet og opdelingen af datterceller. Vigtigere er det, som antibiotikaresistens er en voksende trussel mod folkesundheden, den bakterielle cellecyklus præsenterer en uudnyttet mål for antibiotika udvikling.
I bakterien Caulobacter crescentus, hver celle cyklus fører til en asymmetrisk opdeling, hvilket gav to datterceller celler af forskellige skæbner (figur 1A) 1,2. En datter celle arver en flagellum og er bevægelige, mens den anden datter arver en stilk og er siddende. En integreret genetiske kredsløb styrer cellecyklusprogression og celle skæbne ved transkriptionel regulering, phospho-signalering, og reguleret proteolyse 3. Desuden kromosomreplikation og samtidige adskillelse udbytte datter celler, der indeholder præcis én kopi af kromosom 4. Det er vigtigt, kan disse to celletyper hurtigt separeret ved Colloidal silica partikel densitetscentrifugering i synchronizable NA1000 stamme 5-7 tillader isolation af swarmer celler fra resten af befolkningen med høje udbytter (Figur 1B). Isoleret swarmer celler derefter fortsætte synkront gennem asymmetrisk celledeling. Her vi detaljeret protokol, der bruges til synkronisering Caulobacter stamme NA1000. Vi leverer protokoller og fælles tips til både stor og lille skala synkroniseringer fejlfinding. Denne eksperimentelle fremgangsmåde giver et stærkt værktøj til at afhøre den spatiotemporale kontrol af Caulobacter cellecyklus og celle skæbne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Storstilet Synchrony - Optimal til Western Blot, Microarray / RNA-Seq, og andet materiale Intensiv assays
- Fra en fryser bestand eller en plade, vokser en 5 ml O / N-kulturen af stamme NA1000 ved omrystning ved 28 ° C i PYE medium.
- Podes 0,5 ml af cellerne fra trin 1 i 25 ml M2G (tabel 1-2) og omrystes ved 28 ° C, indtil kulturen når en OD600 mellem 0,5 og 0,6.
- Pode celler i 1 L M2G og rystes ved 28 ° C.
- Når OD600 når 0,5-0,6, bekræfte tilstedeværelsen af swarmer celler under anvendelse af flydende monteret fase mikroskopi. Spot 1 pi af celler på et objektglas, dækkes med et dækglas, og billedet af fase mikroskopi. Bekræfte tilstedeværelsen af swarmer celler ved at visualisere hurtigt svømning celler i befolkningen.
- Spin celler i 15 minutter ved 7 kxg ved 4 ° C i en JA-10 rotor.
- Supernatanten fjernes, og tilføje 180 ml kold M2 (tabel 1-2) og forsigtigt resuspend alle cellerne under anvendelse af en serologisk pipette. Kassér løst pelleterede celler; de er predivisional og stængelgrøntsager celler.
- 60 ml kold kolloidt silica opløsning (Sørg for at blande de kolloide silica suspension omhyggeligt før tilsætning til cellerne) og blandes cellesuspensionen godt.
- Hæld cellesuspensionen i otte 30 ml rør og spin i 30 minutter ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor.
BEMÆRK: Man skal se to forskellige bands; den swarmer bandet er det nedre bånd, mens forfulgt / predivisional celler er i top bånd (figur 1B). - Aspirere forsigtigt den øverste bånd og fjern væsken til ~ 1 cm over swarmer båndet (det nederste bånd).
- (Kritisk) Ved hjælp af en Pasteur-pipette, forsigtigt fjerne swarmer bandet og anbringes i et rent glas. At vaske det kolloide siliciumdioxid, top røret med koldt M2 og centrifugering i 10 minutter ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor.
- Kassere forsigtigt supernatanten og resuspenderceller i 20 ml kold M2 og spin for 10 minutter ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor.
- Resuspender alle pellets i 30 ml koldt M2 og måle OD600 under anvendelse af et spektrofotometer og blank med kold M2 medium. Spar 1 pi for fase imaging at kontrollere for swarmer celler; 90-95% af cellerne bør være swarmers.
- Spin ned cellerne i 5 minutter ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor. Resuspender celler i 28 ° C M2G medium, således at A 600 ~ 0,3-0,4 og begynde rystning ved 28 ° C.
BEMÆRK: Typiske udbytter er mellem 30 og 60 ml af swarmer cellekultur fra 1L af usynkroniserede celler. - Begynde at tage tidspunkter (vildtype kultur tager ca. 135-140 minutter at opdele) 8,9. På hvert tidspunkt, måle OD600. Kontroller, at OD 600 efter division er ca. 2X den oprindelige OD 600.
- For Western blot eller genekspression assays, fjerne 1 ml portioner af culture på de ønskede tidspunkter, spin ned ved maksimal hastighed i en bordcentrifuge i 30 sek, hurtigt dekanteres eller aspireres medium og flash fryse cellepelleten i flydende nitrogen. Opbevar cellerne ved -80 ° C indtil efterfølgende analyse.
2. Mindre Synchrony - Optimal til mikroskopi
- Fra en fryser bestand eller en plade, vokser en 5 ml O / N-kulturen under rystning ved 28 ° C i M2G.
- Fortynd i 15 ml M2G (tabel 1-2) og vokse indtil midten af log (OD 600 = 0,5-0,6).
- Spin på 6,4 kxg i 10 minutter ved 4 ° C i en JA-20 rotor, og resuspender i 1 ml koldt M2 (Tabel 1-2) og overføres til et 2 ml mikrocentrifugerør.
- Spin 15 kxg i 3 minutter i et mikrocentrifugerør at pelletere celler, aspireres supernatanten, satte pellet på is, og resuspender i 900 pi kold M2.
- Tilføj 900 pi kold PVP coatet kolloidt silica og centrifugering i 20 minutter ved 15 kxg ved 4 ° C i en mikrofonrocentrifuge rør.
- (Kritisk) Aspirer eller pipetteres fra toppen forfulgt / predivisional celle band og indsamle bunden swarmer bandet ind i en ny mikrocentrifugerør.
- Vask swarmer cellerne to gange i 1 ml kold M2 mens centrifugering ved 15 kxg for 3 min.
- Inden den endelige centrifugering, flytte cellerne til en præ-afkølet 1 ml reagensglas og måle OD600 af cellerne i forhold til et emne af M2.
- Resuspender den endelige cellepellet i 28 ° C M2G ved en OD mellem 0,3-0,4 og ryst / roll-celler ved 28 ° C.
BEMÆRK: Typiske udbytter er mellem 2 og 4 ml swarmer cellekultur. - Til mikroskopi eksperimenter på det ønskede tidspunkter sted 1 pi celler på en M2G agarose pad til billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synkronisering typisk giver to bånd af celler (Figur 1B): den swarmer band, som har en højere densitet og en forfulgt / predivisional celle band med lavere tæthed. For at sikre effektiv synkronisering fælles kontrol omfatte overvågning af OD600 og måling af niveauerne af ctra protein ved western blot ved særskilte cellecyklus tidspunkter. OD600 bør stige med ca. 2 gange i løbet af cellecyklen (figur 2). Western blot for cellecyklus hovedregulator ctra er en nyttig kontrol for at verificere en god synkront (figur 2). Ctra anvendes i swarmer celle til at blokere DNA-replikation og nedbrydes ved indtræden af DNA replikation 10. Ctra syntetiseres derefter senere i cellecyklussen og aktiverer transkription af en række udviklingsmæssige gener, herunder mange komponenter i flagellum 11,12. En vellykket synkront vil have thans oscillerende mønster af ctra proteinniveauer.
Figur 1. cellecyklussen af Caulobacter crescentus. (A) en tegneserie skematisk af swarmer cellecyklussen. De swarmer celler differentierer til replikationskompetente stilkede celler ved at trække pili, skubbe flageller, og indlede DNA-replikation. Cirklerne og theta strukturerne vist inde i cellen skitserer repræsenterer hvilende og replikerende kromosomer. Celler derefter fremskridt gennem cellecyklus opbygge en enkelt flagellum på stangen modsat stilken. Ved division, to unikke celletyper genereres en replikering blokeret motil swarmer celle og en replikationskompetent stationært forfulgt celle. (B) Repræsentative resultater for densitetscentrifugering. Lavere massefylde forfulgt og predivisional celler flyde nær toppen af gradienten mens tætte swarmer celler ender mod bunden af røret. Scale barer er 1 um i fase mikroskopi billeder. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Repræsentative resultater for en vellykket swarmer celle synkront. Cellemassen målt ved OD 600 bør langsomt stige, og i sidste ende fordoble hele forløbet af assayet. 1 ml aliquoter blev pipetteret i plastik kuvetter fra en stor celle synkroni og OD600 måles med et spektrofotometer ved de angivne tidspunkter. Desuden bør ctra cellecyklus Master regulatorisk protein være til stede i swarmer celle til at blokere DNA-replikation, efterfulgt af en hurtig nedbrydningsammenfaldende med initiering af DNA-replikation. Ctra regenereres derefter senere i cellecyklussen for at aktivere ekspression af mange udviklingsmæssige gener herunder kritiske flagel og Pili komponenter. Western blots for cellecyklus Master regulatorisk protein ctra blev udført ved at tage 1 ml portioner af en storstilet synkront. Cellerne blev resuspenderet i 250 pi Laemmlli prøvebuffer per OD600, separeret på en 10% TRIS-Gly PAGE, overført til PVDF, og blottet med anti-ctra antistof. Mislykkede synkront procedurer føre til ctra western blots uden ændring i proteinniveauer. α-ctra antistof 12 blev inkuberet i en 1: 10.000 fortynding i 1,5 timer i 3% mælk TBST og vasket 3 gange i TBST. Goat-α-kanin sekundært blev derefter tilsat ved 1: 10.000 fortynding i 3% mælk TBST i 1 time, vasket 3 gange med TBST, og afbildes på film ved anvendelse af et kemiluminescerende detektion kit. Venligstklik her for en større version af dette tal.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH4CI | 10 g |
| H2O | Resuspender i 1 L & autoklave |
Tabel 1. 20X M2 Salte opskrift.
| 20X M2 Salte | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO4 | 1 ml | |
| 20% Glucose | 10 ml | Stedfortræder for H 2 O i M2 |
| Ferrosulfat Chelate Solution | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl2 | 5 ml | Føj sidste til AVOID nedbør |
| H2O | Fyld op til 1 L | |
| Sterilt filter med 0,22 um filter |
Tabel 2. M2 og M2G opskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
