Introduction
Den bakteriecellcykeln styr både replikation av genomet och uppdelningen av dotterceller. Viktigt eftersom antibiotikaresistens är ett växande hot mot folkhälsan, presenbakteriecellcykeln en outnyttjad mål för antibiotikautveckling.
I bakterien Caulobacter crescentus, leder varje cellcykel till en asymmetrisk delning, vilket gav två dotterceller av olika öden (Figur 1A) 1,2. Ett dottercell ärver en flagellum och är rörliga, medan den andra dottern ärver en stjälk och är oskaftade. En integrerad genetiska kretsen styr cellcykelprogression och cell öde genom transkriptionsreglering, fosfor-signalering, och reglerad proteolys 3. Dessutom kromosomreplikation och samtidiga segregering avkastningsdotterceller som innehåller exakt en kopia av kromosom 4. Viktigt kan dessa två celltyper snabbt separeras genom ColloIdal kiseldioxid partikeltätheten centrifugering i synchronizable NA1000 stam 5-7 tillåter isolering av swarmer cellerna från resten av befolkningen med hög avkastning (Figur 1B). Isolerad swarmer celler sedan fortsätta synkront genom asymmetrisk celldelning. Här, vi detalj protokollet som används för att synkronisera Caulobacter stam NA1000. Vi tillhandahåller protokoll och gemensamma felsökningstips för både grov- och småskaliga synkroniseringar. Denna experimentella procedur ger ett kraftfullt verktyg för att förhöra den Spatiotemporal kontroll av Caulobacter cellcykeln och cell öde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Storskalig Synchrony - Optimal för Western Blot, Microarray / RNA-Seq, och annat material Intensiv Analyser
- Från en frys lager eller en platta, växa en 5 ml O / N-kulturen av stam NA1000 genom skakning vid 28 ° C i PYE-medium.
- Ympa 0,5 ml av cellerna från steg 1 i 25 ml M2G (tabellerna 1-2) och skaka vid 28 ° C tills kulturen når en OD 600 mellan 0,5 och 0,6.
- Inokulera cellerna i ett L av M2G och skaka vid 28 ° C.
- När OD 600 når från 0,5 till 0,6, bekräfta närvaron av swarmer celler använder flytande monterade fas mikroskopi. Spot 1 l av celler på en glasskiva, täck med ett täckglas och bild genom fas mikroskopi. Bekräfta förekomsten av swarmer celler genom att visualisera snabbt simmar celler i befolkningen.
- Snurra cellerna under 15 min vid 7 kxg vid 4 ° C i en JA-10 rötor.
- Kassera supernatanten och lägga 180 ml kall M2 (tabellerna 1-2) och försiktigt resuspend alla cellerna med användning av en serologisk pipett. Kassera löst pelleterade cellerna; de är predivisional och stjälk celler.
- Tillsätt 60 ml kall Kolloidalt kiseldioxid lösning (se till att blanda Kolloidal kiseldioxid fjädring väl innan du lägger till cellerna) och blanda cellsuspensionen väl.
- Häll cellsuspensionen i åtta 30 ml rör och centrifugera i 30 min vid 6,4 kxg vid 4 ° C i en JA-20 rötor.
OBS: Man bör se två distinkta band; den swarmer bandet är det lägre bandet medan förföljda / predivisional celler är i topp bandet (Figur 1B). - Försiktigt aspirera övre bandet och ta ur vätskan till ~ 1 cm över swarmer bandet (det undre bandet).
- (Critical) Med hjälp av en Pasteur-pipett, försiktigt bort swarmer bandet och placera i ett rent rör. För att tvätta bort den kolloidala kiseldioxiden, övre röret med kallt M2 och centrifugera i 10 min vid 6,4 kxg vid 4 ° C i en JA-20 rötor.
- Försiktigt kassera supernatanten och resuspenderaceller i 20 ml kall M2 och snurra i 10 min vid 6,4 kxg vid 4 ° C i en JA-20 rötor.
- Resuspendera alla pellets i 30 ml kallt M2 och mäta OD 600 med hjälp av en spektrofotometer och blindprov med kall M2-medium. Spara 1 l för fas avbildning att kontrollera swarmer celler; 90-95% av cellerna bör vara swarmers.
- Centrifugera ner cellerna under 5 min vid 6,4 kxg vid 4 ° C i en JA-20 rötor. Resuspendera cellerna i 28 ° C M2G mediet så att A 600 är ~ 0,3-0,4 och börja skakning vid 28 ° C.
OBS: Typiska avkastningen är mellan 30 och 60 ml av swarmer cellodling från 1L av osynkroniserade celler. - Börja ta tidpunkter (vildtyp kultur tar cirka 135-140 minuter att dela) 8,9. Vid varje tidpunkt, mäta OD 600. Kontrollera att OD 600 efter division är ungefär 2X den initiala OD 600.
- För västra blot eller genuttryck analyser, ta bort 1 ml portioner av culture vid önskade tidpunkter, spinn ner vid max hastighet i en bordscentrifug under 30 sekunder, snabbt dekantera eller aspirera mediet, och blixt frysa cellpelleten i flytande kväve. Förvara cellerna vid -80 ° C fram nedströms analys.
2. Småskalig Synchrony - Optimal för mikroskopi
- Från en frys lager eller en platta, växa en 5 ml O / N-kulturen skakning vid 28 ° C i M2G.
- Späd 15 ml M2G (tabellerna 1-2) och växa fram till mitten av log (OD 600 = 0,5-0,6).
- Snurra på 6,4 kxg under 10 min vid 4 ° C i en JA-20 rötor, och återsuspendera i 1 ml kallt M2 (tabellerna 1-2) och överföring till en 2 ml mikrocentrifugrör.
- Spin vid 15 kxg under 3 min i ett mikrocentrifugrör för pellete celler, aspirera bort supernatanten, sätta pelleten på is och återsuspendera i 900 | il kall M2.
- Lägg 900 | il kall PVP belagda kolloidal kiseldioxid och centrifugera i 20 minuter vid 15 kxg vid 4 ° C i en mikrofonrocentrifuge röret.
- (Critical) Aspirera eller pipettera av toppen smög / predivisional cellband och samla botten swarmer bandet in i en ny mikrocentrifugrör.
- Tvätta swarmer cellerna två gånger i 1 ml kall M2 medan centrifugering vid 15 kxg under 3 min.
- Före den slutliga centrifuge, flytta cellerna till en pre-kyld 1 ml provrör och mäta OD 600 av cellerna jämfört med en blank till M2.
- Resuspendera slutliga cellpelleten i 28 ° C M2G vid ett OD mellan 0,3-0,4 och skaka / rulle celler vid 28 ° C.
OBS: Typiska utbyten är mellan 2 och 4 ml swarmer cellodling. - För mikroskopi experiment, på önskad tidpunkter plats 1 pl av celler på en M2G agaros pad för avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synkronisering ger typiskt två band av celler (Figur 1B): den swarmer bandet, som har en högre densitet och en skaftade / predivisional cell band med lägre densitet. För att säkerställa en effektiv synkronisering gemensamma kontroller inkluderar övervakning av OD 600 och mäta nivåerna av Ctra protein genom western blot vid distinkta cellcykel tidpunkter. OD 600 bör öka med ungefär 2 gånger under loppet av cellcykeln (Figur 2). Western blöt för cellcykeln masterregulatorn ctra är en användbar kontroll för att verifiera en god synkroni (Figur 2). Ctra utnyttjas i swarmer cellen för att blockera DNA-replikation och bryts ned vid igångsättningen av DNA-replikation 10. Ctra sedan syntetiseras senare i cellcykeln och aktiverar transkription av en mängd utvecklingsgener inklusive många komponenter i flagellum 11,12. En framgångsrik synchrony har thans oscillerande mönster av ctra proteinnivåer.
Figur 1. Den cellcykel Caulobacter crescentus. (A) En tecknad schema över swarmer cellcykeln. De swarmer cellerna differentierar till replikationskompetenta stjälk celler genom att dra tillbaka pili, mata ut flag, och initiera DNA-replikation. Cirklarna och theta strukturer som visas innanför cell konturerna representerar vilande och repliker kromosomer. Celler framsteg sedan genom cellcykeln bygga en enda flagell vid polen motsatt stjälken. Vid division, två unika celltyper genereras, en replikering blockerad rörliga swarmer cell och en replikationskompetent stationärt stalked cell. (B) Representativa resultat för densitetscentrifugering. Lägre densitet smög och predivisional celler flyta nära toppen av gradienten medan täta swarmer celler hamnar mot botten av röret. Skala barer är 1 mikrometer i fas mikroskopiska bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa resultat för en lyckad swarmer cell synkront. Cellmassan mätt med OD 600 bör långsamt öka och slutligen fördubblas under hela analysen. 1 ml alikvoter pipetterades in i plast kyvetter från en stor cell synkroni och OD 600 mättes med användning av en spektrofotometer vid de angivna tidpunkterna. Dessutom bör ctra cellcykel mästare regulatoriskt protein vara närvarande i swarmer cellen för att blockera DNA-replikation, följt av en snabb nedbrytningsammanfaller med initieringen av DNA-replikation. Ctra regenereras sedan senare i cellcykeln för att aktivera expression av många utvecklingsgener inklusive kritiska flagellära och pili komponenter. Western blöts för cellcykel mästare reglerande protein ctra utfördes genom att ta en ml alikvoter av en storskalig synkroni. Cellerna återsuspenderades i 250 | il Laemmlli provbuffert per OD 600, separerades på en 10% Tris-Gly PAGE, överfördes till PVDF, och blottades med anti-ctra antikropp. Misslyckade synchrony rutiner leder till Ctra western blottar med någon förändring i proteinnivåer. α-ctra antikropp 12 inkuberades vid en 1: 10000 utspädning i 1,5 h i 3% mjölk TBST och tvättades tre gånger i TBST. Get-α-kanin sekundär sattes sedan med 1: 10000 utspädning i 3% mjölk TBST under 1 h, tvättades tre gånger med TBST, och avbildas på film med användning av en kemiluminescerande detektionskit. Vänligenklicka här för att se en större version av denna siffra.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH4CI | 10 g |
| H2O | Resuspendera i 1 L & autoklav |
Tabell 1. 20X M2 Salter Recept.
| 20X M2 Salter | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO 4 | 1 ml | |
| 20% Glukos | 10 ml | Suppleant för H2O i M2 |
| Järnsulfat Chelate Solution | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl 2 | 5 ml | Lägg sist till AVoid utfällning |
| H2O | Fyll upp till 1 L | |
| Sterilfilter med 0,22 ìm filter |
Tabell 2. M2 och M2G recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
