Abstract
Vroege embryogenese uitgaande van een enkele cel zygote doorloopt snelle celdeling en morfogenese, en wordt morfologisch gekenmerkt door pre-bolvormige, bolvormig, hart, torpedo en cotyledon fasen. Deze geleidelijke ontwikkeling is onder de strakke regulering van een complexe moleculaire netwerk. Oogsten voldoende vroege embryo's in een soortgelijk stadium van de ontwikkeling is van essentieel belang voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire regulatie van de vroege embryogenese. Dit is niet eenvoudig omdat de vroege embryogenese ondergaat snelle morfogenese in korte tijd bijvoorbeeld 8 dagen voor Medicago truncatula aan het begin van de zaadlob stadium te bereiken. Hier pakken we het probleem op door twee benaderingen. De eerste wordt een koppeling tussen embryonale ontwikkeling en pod morfologie helpen geven de fase van de zygotische embryo. Dit is met name gebaseerd op het aantal pod spiralen en de ontwikkeling van de stekels. Een alternatieve manier om een aanvulling op de in vivo studies is via kweken bladexplantaten somatische embryo's. Het medium omvat een ongewone combinatie hormoon - Een auxine (1-naftaleenazijnzuur), een cytokinine (6-benzylaminopurine), abscisinezuur en gibberellinezuur. De verschillende stadia te onderscheiden groeien uit de eelt zonder dissectie.
Introduction
Peulvruchten zijn de derde grootste familie van hogere planten met ongeveer 20.000 soorten en de vlinderbloemigen (of Fabaceae) familie zijn tweede granen in geoogste oppervlakte en de totale productie 1. Soja is de derde grootste gecultiveerde gewas. Peulvruchten geven ongeveer een derde van eiwitten en een derde van plantaardige spijsolie 2. Peulvruchten met hun N 2 vaststellen capaciteit ook bijdragen aan duurzame landbouwsystemen. Medicago truncatula, zoals soja, winkels eiwit en olie in de zaadlobben van de zaden en het is een genetische en genomische peulvruchten model met een aanzienlijke genetische en genomische hulpbronnen 3,4. Terwijl M. truncatula heeft vooruitgang mogelijk in het begrijpen van de peulvruchten-Rhizobium symbiose 4 het is in toenemende mate gebruikt om zaad van vlinderbloemigen biologie 5-7 en embryogenese 8,9 bestuderen. Arabidopsis embryogenese is uitgebreid bestudeerd 10,11 maar iksa niet-vlinderbloemige en de details van de embryogenese niet identiek zijn aan Medicago 8,10. Zygotische embryogenese in M. truncatula heeft interessante functies, met een onderscheidend meercellige hypofyse, een endoployploid suspensor en basale overdracht cel 8.
Somatische embryogenese (SE) wordt vaak gebruikt voor het regenereren van planten 12. In de peulvruchten model M. truncatula, het zaad lijn Jemalong 2HA (2HA) is ontwikkeld vanuit de ouder Jemalong om hoge tarieven van somatische embryogenese 13 hebben. Het aantal embryo's is onlangs inhoudelijk verhoogd waarbij zowel gibberellinezuur (GA) en abscisinezuur (ABA) op de lang bestaande medium 14. In dit geval GA en ABA daad synergetisch, wat ongebruikelijk is gezien het feit dat Georgië en ABA meestal antagonistisch 14 treden. De hoeveelheid uit callus embryo ontwikkeld op het oppervlak waarmee het stadium van embryogenese gemakkelijk te bepalen Visually en snel geoogst. Met buurt isogene lijnen die embryogene (2HA) en niet-embryogene (Jemalong) zijn vergemakkelijkt het onderzoek naar somatische embryogenese en met zowel in vivo als in vitro systemen biedt verschillende experimentele mogelijkheden.
Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van embryonale ontwikkeling is essentieel voor het begrijpen zaden en ontwikkeling van de plant. In peulvruchten, zoals in andere dicotylen is de zaadlobben van het embryo dat de producten die worden gebruikt voor menselijke voeding slaan. Vroege embryogenese impliceert snelle celdeling, en de juiste embryo patroonvorming. Ongeveer 8 dagen na de bevruchting, de m truncatula embryo bereikt zaadlob vroeg stadium. De morfologische karakterisering is niet precies aangegeven dagen na de bevruchting in de kas omstandigheden. Aldus wordt een efficiënte standaardbenadering het stadium van ontwikkeling van embryo geven waardevol in het bestuderen van de genetische Regulatie van de vroege zygotische embryogenese.
In dit artikel geven we twee gestandaardiseerde protocollen voor de ontwikkeling van embryo's voor biologische studies van embryogenese te verzamelen in de peulvruchten model M. truncatula. De eerste is om zygotische embryo's te verzamelen door het te associëren embryogenese en pod morfologie, terwijl de tweede is somatische embryogenese via kweken bladexplantaten te gemakkelijk bereikbaar grote aantallen embryo te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zygotic Embryo Development
- Plant Materiaal
- Grow de Medicago truncatula wild type Jemalong of haar buurt isogene, zeer re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (bekend als 2HA) in een kas met een 14 uur fotoperiode en 23 ° C / 19 ° C dag / nacht temperatuur.
- Pierce het oppervlak van de zaadhuid (met een 23 G naald) vóór het zaaien zodat water mag het zaad voeren en weken in water gedurende de nacht. Voeg genoeg water om volledig te dekken het zaad.
- Zaai 3 zaden in elke 15 cm pot diameter (in totaal 10 potten) in potgrond (grof zand, perliet, kokos-turf (1: 1: 1) plus 5 g van Osmocote Exact Standaard: slow release meststof) en transfer naar het kas. Bewaar de gezondste zaailing na het ontkiemen, dus er is 1 plant per pot en omgeven door een hekwerk voor de plant stengels te klimmen.
- Grow de Medicago truncatula wild type Jemalong of haar buurt isogene, zeer re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (bekend als 2HA) in een kas met een 14 uur fotoperiode en 23 ° C / 19 ° C dag / nacht temperatuur.
- Oogsten Pods
- Verzamel peulen van de wild soort Jemalong of 2HA naar de juiste vroege embryo stadia te verkrijgen zoals eerst beschreven 9.
Opmerking: De verschillende stadia pod worden getoond in figuur 1 en de bijbehorende embryo fasen zijn weergegeven in figuur 2. - Controleer de verschillende stadia bij de oogst pod volgens de criteria zoals in Tabel 1. Meet de verstreken tijd van stap 6 tot afzonderlijke fasen 6 en 7 (Tabel 2) te helpen.
- Verzamel peulen van de wild soort Jemalong of 2HA naar de juiste vroege embryo stadia te verkrijgen zoals eerst beschreven 9.
- Ontleden eitjes van peulen en het controleren van het embryonale stadium
- Isoleer eitjes van peulen met behulp van fijne tang alleen of een stereo dissectiemicroscoop en een tang nodig. Indien nodig kan de embryonale stadium kan snel worden gecontroleerd met behulp van een standaard samengestelde microscoop (Figuur 3B).
- Bereid gewijzigd Hoyer's oplossing met 7,5 g Arabische gom, 100 g chloralhydraat, 5 ml glycerol, 60 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water. Ontbinden door roeren gedurende 3-5 uur of 's nachts.
- Voor meer verfijnend microscopie duidelijk de ontleed eitjes in gewijzigde Hoyer's oplossing 15,16. Pick voorzichtig de intacte zaadknoppen en in een klein volume Hoyer-oplossing (genoeg om de eicel te dekken) bij kamertemperatuur tot helder.
- Bekijk de monsters met differentiële interferentie contrast (DIC) optiek. Vastleggen van de beelden iwth een digitale camera 9 (figuur 2).
- Verkrijgen van de meest gelijkmatige zaadknoppen uit het centrale gebied van de pod en accumuleren van het gewenste aantal. Een voorbeeld is getoond in figuur 3A. Verzamel de zaadknoppen op ijs en bewaar bij vereiste temperatuur (-80 ° C nucleïnezuren) voor verdere analyse.
LET OP: Voor meer informatie over de analyse van histologische secties, transmissie-elektronenmicroscopie en in situ hybridisatie zie papers 8,9.
2. Somatische Embryo Development In Vitro
- Gebruik een M. truncatula cultivar thoed is in staat om gemakkelijk embryo's in de cultuur te vormen. Voor dit protocol voor bladexplantaten gebruiken 2HA planten 13,17 die 2-4 maanden oud zijn.
- Neem folders uit de laatste bijna volledig uitgebreid trifoliate blad van een stam verlengen.
- Houd de trifoliate bladeren op vochtig papier badstof in een cultuur pot om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Zodra de trifoliate bladeren worden geoogst die ze nodig hebben om te worden gebruikt met een minimale vertraging. - Bereiding van het cultuurmedium
- Met de P4 10: 4: 1: 5 medium agar (0,8% w: v) in 9 cm petrischalen.
OPMERKING: De P4 10: 4: 1: 5 medium uit de P4 basismedium 18 plus 10 uM 1-naftaleenazijnzuur (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurine (BAP), 1 uM abscisinezuur (ABA) en 5 uM gibberellinezuur acid (GA). Het gebruik van GA + ABA versnelt embryovorming en veroorzaakt substantiële toename embryo nummer 14. - Maak de de P4 basale medium in 1 L; bestaande uit grote zouten (maak Calcium up afzonderlijk), minder belangrijke zouten en vitamines (tabel 3), gecheleerd ijzer (make-up los), casaminozuren (caseïnehydrolysaat), 30 g sucrose, 8 g agar.
- WINKEL voorraadoplossingen van belangrijke zouten, calcium, casaminozuren, kleine zouten en vitamines bij -20 ° C in geschikte hoeveelheden. Bewaar gechelateerd ijzer bij 4 ° C.
- Maak de gechelateerde ijzer (200x) door het oplossen van 7,44 g Na 2 EDTA • 2 H 2 O in ongeveer 900 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water al roerend, breng dan de oplossing voor 98-99 ° C, terwijl het toevoegen van 1,853 g FeSO 4 • 7H 2 O. Eindelijk tot 1 L wanneer de ingrediënten worden opgelost. Bewaren in amberkleurige flesjes bij 4 ° C.
- Vul de P4 basismedium de voorraadoplossingen zoals in tabel 4. De hormonen in het medium zijn 10 uM NAA, 4 BAP uM, 1 uM ABA, 5 uM GA (zie Tabel 4 en Tabel Specific Materials). Voeg de NAAen BAP voorafgaand aan autoclaveren toevoegen ABA en GA na autoclaveren en afkoelen tot ongeveer 55 ° C, met behulp filtersterilisatie met een 0,22 urn filter bevestigd aan een injectiespuit. Meng goed door voorzichtig zwenken.
- Stel de media op pH 5,8 met 1 M KOH voorafgaand aan autoclaveren. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min.
- Na autoclaveren voeg de filter gesteriliseerd ABA en GA, en giet ongeveer 25 ml van de media in steriele 9 cm petrischalen in een laminaire stroming kap of biohazard kast. Cool en laat de agar ingesteld met de deksel. Dan zet op het deksel en zorg ervoor dat er geen condens op het deksel. Label wens in en bewaar bij 4 ° C (in een kartonnen doos met deksel condensaat).
- Met de P4 10: 4: 1: 5 medium agar (0,8% w: v) in 9 cm petrischalen.
- Sterilisatie van Leaf Tissue
- Werk in een UV-gesteriliseerde laminaire stroming kap of biohazard kast.
- Plaats verlaat in de maas bal van een eerder geautoclaveerd voorjaar thee-ei.
- Dompel thee-ei met de bladeren in de 70% (v: v) ethanol in een culture pot gedurende 30 sec.
NB: Voor alle stappen in deze procedure 250 ml schroefdop polycarbonaat cultuur potten die worden geautoclaveerd. - Uitlekken en vervolgens over te dragen en dompel het blad weefsel in 1: 8 (v: v) verdund bleekwater (0,5% chloor) gedurende 10 min. Roer voorzichtig van tijd tot tijd.
- Giet het bleekmiddel en breng de thee-ei in een cultuur pot met steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. Zwenk en afvoer overtollig water. Herhaal dit nog een keer met een verse cultuur pot van steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water.
- Verwijder de bladeren van de thee-ei met een steriel pincet om een nieuwe cultuur pot van steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. Schroef de steriele dop en spoel door het omkeren en wervelende. Laat bladeren drijvend op het steriel water totdat klaar om explantaten bereiden.
- Voorbereiden en Plating Explantaten
- Met behulp van steriele technieken, trim individuele gesteriliseerde folders van de rand met een scalpel, en snijd de resterende rechthoek in twee of THRee rechthoekige explantaten (8-10 x 3-5 mm) bij het midden van de ader in het midden van elk explantaat (figuur 5A).
LET OP: De grootte van de explant is heel belangrijk in de inleiding van de eerste callusing. Voer de snijden op steriele deksels van take-away voedsel containers. - Plaat 6 explantaten on-agar gestold kweekmedium in 9 cm diameter petrischalen (Figuur 5B). Plate de explantaten abaxiale beneden de gebruikelijke blad oriëntatie te behouden.
- Sluit de Petri gerechten met Parafilm (figuur 5C) gespannen rond het gerecht. Het weefsel is nu klaar voor incubatie.
- Met behulp van steriele technieken, trim individuele gesteriliseerde folders van de rand met een scalpel, en snijd de resterende rechthoek in twee of THRee rechthoekige explantaten (8-10 x 3-5 mm) bij het midden van de ader in het midden van elk explantaat (figuur 5A).
- Tissue Incubation
- Incubeer de platen in het donker bij 28 ° C in een gecontroleerde temperatuur ruimte of groeikast gedurende de kweekperiode.
OPMERKING: De explantaten zal dedifferentiation initiëren, ondergaan celdeling, proliferatie (eeltvorming) en embryogenese (differentiatie). - Subcultuur de differentiërende TOELICHTInts na 3 weken op vers medium. Op dit subcultuur breng de gehele explantaat met een steriele roestvrijstalen spatel en pincet, in een laminaire stroming kap of biologisch kast. Als callusing optreedt en het callus de grootte van de grootste in figuur 5C overschrijdt overdracht 50% van de afzonderlijke callus bij doorkweken op vers medium.
- Let op de eerste embryo's in ongeveer 4 weken. Hoewel er een zekere mate van synchroon, het verzamelen van verschillende embryo stadia over een 4-8 week incubatieperiode (Figuur 6A, B). Verzamel onder een dissectie microscoop Werkwijze volgens experimentele doeleinden.
- Subcultuur elke 3 weken en verwijder embryo periodiek zodat de explantaten blijven embryo's gedurende 3 maanden.
- Incubeer de platen in het donker bij 28 ° C in een gecontroleerde temperatuur ruimte of groeikast gedurende de kweekperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor zygotische embryogenese verschillende pod structuren die overeenkomen met de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 1A - F terwijl de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 2A - F. Door het selecteren pods in hetzelfde stadium monsters eicellen die vrij uniform kan worden verkregen (figuur 3A). Door het gebruik van RT-qPCR embryo specifieke genen gemakkelijk kan worden gedetecteerd en tijdsverloop studies geëvalueerd 9. Sommige extra dissectie ruimte voor verdere verrijking van de embryo (figuur 3B). Verwerking voor in situ hybridisatie strategieën kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd en eventuele aanvullende studies met licht (Figuur 4A, B) en elektronenmicroscopie 8. Van bijzondere waarde in dit systeem is het onderscheidend vermogen van de hypofyse en suspensor (Figuur 4A, B).
Voor somatische embryogenese de cUtting van het oorspronkelijke explantaat uit de afzonderlijke folioles wordt getoond in figuur 5A. De explantaten worden dan geplaatst abaxiale kant in nauw contact met de agar (Figuur 5B). Na callus vorming embryo zullen verschijnen na 3-4 weken en 7 weken zijn er tal embryo's in het cotyledonstadium (figuur 5C). Door het volgen van de platen met tussen week 4 en 7 embryo's in afzonderlijke fasen kunnen worden geplaatst (Figuur 6A, B). De verschillende embryo stadia kan gemakkelijk worden waargenomen en eenvoudig geplukt voor analyse. Dit kan een heel snelle manier om bepaalde soorten informatie te verkrijgen zijn. Bijvoorbeeld Figuur 7 illustreert hoe embryo's in het vroege cotyledonstadium liet expressie van één type MtOLEOSIN gen maar geen andere. Tijdsverloop studies van het gen van belang kan vervolgens worden onderzocht met behulp van zygotische en somatische embryo's. Een bijzonder voordeel van de somatische embryo is dat verandering van de Callus kunnen worden uitgevoerd zonder het regenereren van een volledige plant en genexpressie in verschillende stadia van embryogenese worden uitgevoerd gevisualiseerd middels GUS (β-glucuronidase) of fluorescente labels. Een voorbeeld is getoond in figuur 6C.
Figuur 1: Pod morfologie en embryo-ontwikkelingsstadia Pods in verschillende stadia van ontwikkeling met embryo's in discrete stappen.. Stages 2-7 aangegeven. (A) en (B) zijn fases 2 en 3 zeer vroege en vroege pre-bolvormige (C) fase 4 vroege bolvormige (D) fase 5 laat bolvormige (E) fase 6 hart en (F) fase 7 laat torpedo. Bar is 2 mm. Fase I bloei (niet getoond).
Figuur 2: Embryo ontwikkelingsstadia. </ Strong> Gewist embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. (A) fase 3 vroege pre-bolvormige, (B) fase 4 vroege bolvormige, (C) fase 5 laat bolvormige, (D) fase 6 hart, en (E) het podium 7 laat torpedo. Bar is 60 micrometer.
Figuur 3: Geïsoleerde eitjes (A) Groep eitjes met stadium 5 embryo's.. (B) eitje bekeken onder standaard samengestelde microscoop om embryo dat kan worden weggesneden bij 'haak' end tonen. Bar is 1 mm (A) en 200 urn (B).
Figuur 4:. Morfologie van de vroege embryo (A) Sectie door zeer vroege embryo-showing embryo (vier cellen), hypofyse (komende vier cellen), suspensor (komende vier cellen die grote vacuolen hebben) en de relatie met ovulumweefsels. (B) Sectie door middel van vroege torpedo stadium embryo (E) met prominente suspensor (S). Gekleurd met toluidine blauw. Bar is 10 urn (A) en 50 pm (B).
Figuur 5:. Het kweken van explantaten somatische embryo's (A) trifoliate blad tonen waarbij explantaten van foliole worden genomen. (B) De explantaten uitgeplaat op agar. (C) Somatische embryo's geproduceerd uit explantaten na 7 weken cultuur. Bar IS10 mm
Figuur 6: Somatische embryo etappes en het identificeren van de locatie van gen expression middels transformatie en GUS. (A) Somatische embryo's in globulaire (G), hart (H) en torpedo (T) stadia. (B) Somatische embryo in vroeg cotyledonstadium. (C) De bolvormige stadium somatische embryo sterk toont GUS-expressie van het gen in MtWOX9 embryo (E) en kleuring in afnemende hypofyse (H) en suspensor (S). Bar (A, B) is 100 urn. Bar (C) is 50 urn.
Figuur 7: Genexpressie duing embryogenese in vitro gebruik van de kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) Genexpressie van OLEOSIN3 (A) en OLEOSIN4 (B) in het vroege cotyledonstadium embryo's uitgesneden uit embryo's uit embryogene callus.. Expressie is relatief to blad. Standaardfouten aangegeven.
| Stage nummer | Embryo podium | Pod podium |
| Fase 1 | Bloem bij anthesis | |
| Fase 2 | Zeer vroege pre-bolvormige embryo | Pod met één of twee spiralen |
| Fase 3 | Vroege pre-globulaire embryo | Pod met drie volledige spiralen |
| Fase 4 | Vroege bolvormige | Pod met vijf volledige spiralen en stekels niet zichtbaar |
| Fase 5 | Late bolvormige | Pod met zes spiralen en onvolwassen stekels niet meer dan pod breedte |
| Stage 6 | Heart podium | Pod met zes spiralen en langwerpig rijpen stekels dan pod breedte |
| Etappe 7 | Torpedopodium | Pod met zes spiralen, volwassen dikkere langere stekels en een grotere omtrek |
Tabel 1: Criteria voor de oogst van pod stadia Morfologische criteria gebruikt bij het identificeren van pod stadia die overeenkomen met gedefinieerde embryo fasen..
| Flower Fase 1 (S1) | Pod Fase 2 (S2) | Pod Fase 3 (S3) | Pod Fase 4 (S4) | Pod Stage 5 (S5) | Pod Stage 6 (S6) | Pod Fase 7 (S7) | |
| Dagen | 0 | 1,5-2 | 0,5-1 | 0.5 | 0,5-1 | 1 | 1-1,5 |
Tabel 2. Time cursus voor pod collectie. De tijd van thij vorige embryo ontwikkelingsfase aangegeven in dagen.
| Major zouten / L | Minor zouten / L | Vitaminen / l | |||
| mg | mg | mg | |||
| KNO 3 | 1875 | MnSO 4 • H 2 O | 10 | Myo-inositol | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | Thiamine HCl | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO 4 • 7H O 2 | 2 | Nicotinezuur | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0.75 | Pyridoxine HCl | 1 | |
| MgSO 4 • 7H O 2 | 225 | Na 2 MoO 4 • 2H 2 O | 0.25 | ||
| Calcium afzonderlijke | CuSO4 • 5H 2 O | 0,025 | |||
| CaCl 2 • 2 H 2 O | 300 | 2 • CoCl 6H O 2 | 0,025 | ||
| Gechelateerd ijzer afzonderlijke | |||||
| FeSO 4 • 7H O 2 | 9,267 | ||||
| Na 2 EDTA • 2H 2 O | 37.2 | ||||
Tabel 3: P4 Medium De componenten van het medium P4..
| Bestanddeel | Bedrag / L |
| 10 x grote zouten | 100 ml |
| 100 x calcium | 10 ml |
| 1000 x minor zouten | 1 ml |
| 200 x ijzer | 5 ml |
| 100 x casaminozuren | 10 ml |
| 1.000 x vitaminen | 1 ml |
| Sucrose | 30 g |
| Agar-agar | 8 g |
| Hormonen | |
| 1.000 uM NAA | 10 ml |
| 1.000 uM BAP | 4 ml |
| 1.000 uM ABA | 1 ml | </ Tr>
| 1.000 uM GA | 5 ml |
Tabel 4: Het maken van het P4 medium met hormonen maken van het P4 medium met hormonen uit voorraad oplossingen..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocollen zijn relatief ongecompliceerd en laat onderzoek van peulvruchten embryogenese met alle hedendaagse cel en moleculaire technieken. We erkennen dat er voordelen en nadelen van zowel in vivo en in vitro methoden. Beide kunnen meer nadruk op de vroege embryogenese in vergelijking met de cultuur van onrijpe zaden 19.
Voor in vivo studies wat beschreven is hoofdzakelijk het isoleren van de eicel van de huls die geschikt is voor veel embryo studies. Het is natuurlijk mogelijk om verder te verrijken voor embryoweefsel door het snijden van de "hook" gebied (Figuur 3B). Het is moeilijk om het vroegste stadium van embryo-ontwikkeling te isoleren en tijdens disection het embryo wordt vaak verloren omdat het niet goed bevestigd aan het aangrenzende weefsel, waardoor het gebruik van eitjes voordelig. Met behulp van pod morfologie elimineert de tagging van bloemen en met een tijd course regeling voor elke bloem. Daarnaast is er potentiële variabiliteit in ontwikkelingsstoornissen timing methoden, tenzij het milieu zeer strak wordt gecontroleerd. Optimale plantengroei is belangrijk, zodat pod formatie niet gebeurt onder stress omstandigheden. Wordt kennen pod ontwikkeling en kleine aanpassingen kunnen worden aangebracht morfologische stappen definiëren specifieke embryonale ontwikkelingsstadia passen.
Bij somatische embryogenese, moet worden erkend dat de embryo ongeslachtelijk en niet zijn afgeleid van een zygote. Ook de voedingsbron verschilt van de zygotische embryo. Bij de somatische embryo, is het kweekmedium en de omringende callus, en in het geval van de zygote embryo is het endosperm. Dit betekent dat de suspensor veel beter ontwikkeld bij de zygote embryo (Figuur 4A, B). De specifieke waarde van de m truncatula systeem is het groot aantal embryo's in reactie op de ongebruikelijke vier hormoone regime. Wanneer het grote aantal niet optreden dan controleren van de gegevens van waaruit de hormonen en hun toevoeging aan het medium worden gecontroleerd. Zoals bij elke kweek methode steriliteit van het explantaat weefsel onbeschadigd (kleine aanpassingen om de timing van ethanol en hypochloriet sterilisatietijden als dit een probleem) belangrijk alsmede de zorg draagt voor steriliteit gedurende alle voorbereidende stappen.
Wat wij hebben ontdekt is dat het waardevol vullen in vivo en in vitro werkwijzen. Een voorbeeld uit onze eigen studies is het onderzoeken van de transcriptiefactor MtSERF1 (SOMATIC EMBRYO GERELATEERDE FACTOR 1) dat een ethyleenreactie transcriptiefactor gen. MtSERF1 werd voor het eerst ontdekt in somatische embryo's met behulp van RNAi, promotor-GUS fusies en in-situ hybridisatie; en vervolgens naar uitgedrukt in zygotische embryogenese 20.
De studie van peulvruchten embryogenese is belangrijk voor human voeding, en het gebruik van M. truncatula embryo's samen met de cellulaire en moleculaire technieken nu beschikbaar is op dit gebied te versterken. Inzicht kan worden verkregen in hoe embryo grootteklassen, zodat de opbrengst samen kunnen worden geoptimaliseerd met de gewenste koolhydraten, olie en eiwitsamenstelling. Deze factoren zijn grotendeels in gang gezet in de vroege embryogenese 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
