Abstract
Der frühen Embryogenese ausgehend von einer einzigen Zelle Zygote geht durch schnelle Zellteilung und Morphogenese und ist morphologisch durch pre-kugelförmig, kugelförmig, Herz, Torpedo und Keimblattstufen gekennzeichnet. Diese fortschreitende Entwicklung ist unter der strengen Regelung einer komplexen molekularen Netzwerk. Ernte ausreichend frühen Embryonen in einem ähnlichen Entwicklungsstufe ist für die Untersuchung der zellulären und molekularen Regulation der frühen Embryogenese. Das ist nicht einfach, da der frühen Embryogenese erfährt rasche Morphogenese in kurzer Zeit zB 8 Tage Medicago truncatula die frühen Keimblattstadium zu erreichen. Hier wenden wir uns das Problem durch zwei Ansätze. Die erste stellt eine Verbindung zwischen der Embryonalentwicklung und pod Morphologie helfen zeigen die Stufe des zygotischen Embryos. Dies ist insbesondere auf die Anzahl der Spiralen und pod Entwicklung der Stacheln beruht. Ein alternativer Weg zur Ergänzung des in vivo sTUDIEN ist über Kultivierung Blattexplantate zu somatischen Embryonen zu produzieren. Das Medium enthält eine ungewöhnliche Hormonkombination - ein Auxin (1-Naphthalinessigsäure), ein Cytokinin (6-Benzylaminopurin), Abscisinsäure und Gibberellinsäure. Die verschiedenen Phasen erkennbar wachsen aus dem Kallus ohne Dissektion werden.
Introduction
Hülsenfrüchte sind die drittgrößte Gruppe von höheren Pflanzen mit ca. 20.000 Arten und der (oder Fabaceae) Familie Leguminosae sind einmalig Getreide in Gebiet geerntet und Gesamtproduktion 1. Sojabohne ist die drittgrößte Kulturpflanzen. Hülsenfrüchte liefern etwa ein Drittel des Nahrungsprotein und ein Drittel von Pflanzenöl für den menschlichen Verzehr 2. Hülsenfrüchte mit Fixierfähigkeit N 2 auch dazu beitragen, eine nachhaltige landwirtschaftliche Systeme. Medicago truncatula, wie Sojabohne, speichert Protein und Öl in den Kotyledonen der Samen und ist eine genetische und genomische Leguminosen Modell mit erheblichen genetischen und genomischen Ressourcen 3,4. Während M. truncatula hat Fortschritte im Verständnis der Leguminosen-Rhizobien Symbiose 4 hat es zunehmend eingesetzt, um Hülsenfruchtsamen Biologie 5-7 und Embryogenese 8,9 studieren aktiviert. Arabidopsis Embryogenese wurde intensiv untersucht, aber es 10,11 isa Nichthülsenfrucht und die Details der Embryogenese sind nicht identisch mit Medicago 8,10. Zygotischen Embryogenese in M. truncatula hat interessante Features, mit einem unverwechselbaren vielzelligen Hypophyse, einer endoployploid suspensor und basalen Übertragungszelle 8.
Somatische Embryogenese (SE) wird üblicherweise zur Regeneration von Pflanzen 12 eingesetzt. In der Hülsenfrüchte Modell M. truncatula das Saatgut Linie Jemalong 2HA (2HA) wurde aus der Mutter Jemalong entwickelt worden, um hohe somatische Embryo 13 haben. Die Zahl der Embryonen hergestellt wurde kürzlich inhaltlich, indem sowohl die Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) in die seit langem etablierte Medium 14 erhöht. In diesem Fall GA und ABA wirken synergistisch, was ungewöhnlich ist da GA und ABA in der Regel 14 antagonistisch wirken. Die aus Kallus produziert Embryonen entwickeln sich auf der Oberfläche, die das Stadium der Embryogenese, leicht bestimmt werden können Visually und leicht geerntet. Mit in der Nähe von isogenen Linien, die embryo (2HA) und nicht-embryo (Jemalong) sind erleichtert die Untersuchung der somatischen Embryogenese und sowohl in vivo und in vitro-Systemen bietet verschiedene Experimentiermöglichkeiten.
Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der Embryoentwicklung ist wesentlich für das Verständnis Saatgut und Pflanzenentwicklung. In Hülsenfrüchten, wie in anderen Dikotyle ist es die Cotyledonen des Embryos, die die Produkte, die für die menschliche Ernährung verwendet werden, zu speichern. Der frühen Embryogenese beinhaltet schnelle Zellteilung und korrekte Embryo Musterung. In ca. 8 Tage nach der Befruchtung, der M. truncatula Embryo erreicht frühen Keimblattstufen. Die morphologischen Charakterisierung ist nicht genau durch Tage nach der Befruchtung in Gewächshausbedingungen angedeutet. Somit ist eine effiziente Standardansatz, um die Phase der sich entwickelnden Embryonen zeigen wertvoll bei der Untersuchung der genetischen regulation der frühen Embryogenese zygotische.
In diesem Beitrag stellen wir zwei standardisierte Protokolle, um sich entwickelnden Embryonen für biologische Untersuchungen der Embryogenese in der Hülsenfrüchte Modell M. sammeln truncatula. Die erste ist zu zygotischen Embryos durch Zuordnung der Embryogenese und pod Morphologie während der zweite ist die somatische Embryogenese via Kultivierung Blattexplantate zu leicht zugänglich großen Embryo Zahlen liefern zu sammeln.
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Protocol
1. Zygotic Embryo-Entwicklung
- Pflanzenmaterial
- Wachsen die Medicago truncatula Wildtyp Jemalong oder dessen in der Nähe von isogenen, hoch wieder erzeugbaren Genotyp Jemalong 2HA 13 (als 2HA bekannt) in einem Gewächshaus mit einer 14 h Fotoperiode und 23 ° C / 19 ° C Tag / Nacht-Temperatur.
- Pierce die Oberfläche der Samenschale (mit einer 23 G-Nadel) vor der Aussaat der Samen, so dass Wasser ist erlaubt, um den Samen geben und genießen in Wasser über Nacht. Fügen Sie genug Wasser, um den Samen vollständig abdecken.
- Sow 3 Samen in jeder 15 cm Durchmesser Topf (insgesamt 10 Töpfe) in Blumenmischung (Grobsand, Perlit, Kokosfaser-Torf (1: 1: 1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: Langzeitdünger) und Transfer zum Gewächshaus. Bewahren Sie die gesündeste Sämling nach der Keimung, so gibt es 1 Pflanze pro Topf und umgeben von einem Gitter für die Pflanzenstengel zu klettern.
- Wachsen die Medicago truncatula Wildtyp Jemalong oder dessen in der Nähe von isogenen, hoch wieder erzeugbaren Genotyp Jemalong 2HA 13 (als 2HA bekannt) in einem Gewächshaus mit einer 14 h Fotoperiode und 23 ° C / 19 ° C Tag / Nacht-Temperatur.
- Harvesting Pods
- Sammeln Sie Früchte aus der wild Typ Jemalong oder 2HA, um die entsprechenden frühen Embryo Stufen zu erhalten, wie zuerst beschrieben 9.
HINWEIS: Die verschiedenen pod Stufen sind in Figur 1 gezeigt, und die entsprechenden Embryo Stufen sind in Abbildung 2 dargestellt. - Überprüfen Sie die verschiedenen pod Stufen bei der Ernte mit Hilfe von Kriterien gemäß Tabelle 1. Messen Sie die Zeit von Stufe 6 vergangen zu getrennten Stufen 6 und 7 (Tabelle 2) zu helfen.
- Sammeln Sie Früchte aus der wild Typ Jemalong oder 2HA, um die entsprechenden frühen Embryo Stufen zu erhalten, wie zuerst beschrieben 9.
- Sezieren Samenanlagen von Hülsen und die Überprüfung der Embryonalstadium
- Isolieren Samenanlagen von Hülsen mit feinen Pinzette allein oder einem Stereo Binokular und Pinzette wie nötig. Bei Bedarf kann der Embryo Phase kann mit einem Standard-gesetzten Mikroskop (3B) schnell überprüft werden.
- Bereiten geändert Hoyers Lösung, die 7,5 g Gummi arabicum, 100 g Chloralhydrat, 5 ml Glycerin, 60 ml entionisiertem, destilliertem Wasser. Lösen sich durch Rühren für 3-5 Stunden oder über Nacht.
- Weitere verfeinernd Mikroskopie deaktivieren Sie die seziert Samenanlagen in modifizierten Hoyer-Lösung 15,16. Vorsichtig holen die intakten Eizellen und in einem kleinen Volumen von Hoyer-Lösung (genug, um die Samenanlage abdecken) bei Raumtemperatur, bis klar.
- Sehen Sie sich die Proben mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik. Erfassen Sie die Bilder iwth einer Digitalkamera 9 (Abbildung 2).
- Besorgen Sie sich die gleichmäßige Samenanlagen aus dem Mittelbereich der pod und sammeln die erforderliche Anzahl. Ein Beispiel ist in 3A gezeigt. Sammeln Sie die Samenanlagen auf Eis und an einem gewünschten Temperatur (-80 ° C für Nukleinsäuren) zur weiteren Analyse.
HINWEIS: Einzelheiten zur Analyse der histologischen Schnitten, Transmissionselektronenmikroskopie, und in-situ-Hybridisierung finden Sie Papiere 8,9.
2. Entwicklung somatischer Embryonen in vitro-
- Verwenden Sie ein M. truncatula Sorte tHut ist in der Lage, leicht zu bilden Embryonen in Kultur. Aus diesem Protokoll für Blattexplantate verwenden 2HA Pflanzen 13,17, die 2-4 Monate alt sind.
- Nehmen Sie aus dem aktuellen Flugblätter fast vollständig erweitert dreiblättrigen Blatt einer Verlängerungsschaft.
- Halten Sie die dreiblättrigen Blätter auf feuchten Papiertüchern in einem Kulturtopf um Austrocknung zu vermeiden.
Hinweis: Wenn der dreiblättrigen Blätter geerntet werden sie brauchen, um mit minimaler Verzögerung genutzt werden. - Herstellung des Kulturmediums
- Verwenden Sie den P4 10: 4: 1: 5 Medium in Agar (0,8% w: v) in 9 cm Petrischalen.
HINWEIS: Der P4 10: 4: 1: 5-Medium besteht aus dem P4-Basalmedium 18 plus 10 & mgr; M 1-Naphthalinessigsäure (NAA), 4 & mgr; M 6-Benzylaminopurin (BAP), 1 & mgr; M Abscisinsäure (ABA) und 5 uM gibberellic Säure (GA). Die Verwendung von GA + ABA beschleunigt Embryobildung und verursacht materiellen Steigerungen Embryo Nummer 14. - Bilden die die P4 Grundmedium in 1 L; bestehend aus Hauptsalze (machen Calcium separat), kleinere Salze und Vitamine (Tabelle 3), Chelat-Eisen (bilden separat), Casaminosäuren (Caseinhydrolysat), 30 g Saccharose, 8 g Agar.
- Shop Stammlösungen der wichtigsten Salze, Calcium, Casaminosäuren, kleinere Salze und Vitamine bei -20 ° C in geeigneten Teilmengen. Speichern Chelateisen bei 4 ° C.
- Bilden den chelatisierten Eisen (200x) durch Auflösen 7,44 g Na 2 EDTA • 2H 2 O in etwa 900 ml entionisiertem destilliertem Wasser unter Rühren, dann wird die Lösung auf 98-99 ° C unter Zugabe von 1,853 g FeSO 4 • 7 H 2 O. Schließlich auf 1 L, wenn die Inhaltsstoffe gelöst sind. Shop in bernsteinfarbenen Flaschen bei 4 ° C.
- Machen den P4 Grundmedium mit den Stammlösungen, wie in Tabelle 4. Die Hormone im Medium sind 10 uM NAA, 4 uM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (siehe Tabelle 4 und spezifische Materialien Tabelle). Fügen Sie die NAAund BAP vor dem Autoklavieren und fügen ABA und GA nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf etwa 55 ° C unter Verwendung von Filtersterilisation mit einem 0,22 um-Filter in eine Spritze befestigt. Und Mischen leicht schwenken.
- Stellen Sie die Medien auf pH 5,8 mit 1 M KOH vor dem Autoklavieren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min.
- Nach dem Autoklavieren fügen Sie den Filter sterilisiert ABA und GA, und gießen Sie etwa 25 ml Medium in sterile 9 cm Petrischalen in einer Steril oder Biohazard Schrank. Kühl und lassen Sie die Agar mit dem Deckel off gesetzt. Dann legen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, es gibt keine Kondensat auf dem Deckel. Label nach Bedarf und bei 4 ° C (in einem Karton auf Deckel Kondensat vermeiden).
- Verwenden Sie den P4 10: 4: 1: 5 Medium in Agar (0,8% w: v) in 9 cm Petrischalen.
- Sterilisation von Blattgewebe
- Arbeiten Sie in einem UV-sterilisiert Sterilbank oder Biohazard Schrank.
- Platz verlässt Ball in die Maschen eines zuvor autoklaviert Frühjahr Tee-Ei.
- Tauchen Tee-Ei, das die Blätter in 70% (v: v) Ethanol in einer Stichture Topf für 30 Sekunden.
Hinweis: Für alle Schritte in diesem Verfahren verwenden 250 ml Schraubverschluss Polycarbonat Kulturgefäßen, die autoklaviert werden. - Ablassen und dann übertragen und tauchen in das Blattgewebe in 1: 8 (v: v) verdünnt Bleiche (0,5% Chlor) für 10 min. Vorsichtig schwenken von Zeit zu Zeit.
- Lassen Sie das Bleichmittel und überweisen Sie den Tee-Ei in einer Kultur Topf mit sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Vorsichtig schwenken und überschüssiges Wasser abtropfen lassen. Wiederholen Sie noch einmal mit frischem Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser.
- Blätter aus dem Tee-Ei mit einer sterilen Pinzette entfernen, um ein frisches Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Schrauben Sie die sterile Schutzkappe und spülen Sie durch Umdrehen und wirbeln. Lassen Blätter schwimmen auf dem sterilem Wasser bis zu seiner Explantate vorzubereiten.
- Vorbereitung und Beschichtung Explantate
- Mit sterilen Techniken, Trimm einzelnen sterilisiert Flugblätter von der Kante mit einem Skalpell, und schneiden Sie die verbleibenden Rechtecks in zwei oder three rechteckigen Explantate (8-10 x 3-5 mm) mit der Mitte der Vene in der Mitte jedes Explantat (5A).
HINWEIS: Die Größe des Explantats ist ziemlich wichtig im Hinblick auf die ersten Verhornung. Führen Sie den Schneid auf sterilen Deckeln aus Take-away-Essen-Container. - Platte 6 Explantate auf Agar verfestigten Nährboden in 9 cm Petrischalen (5B). Platte der Explantate abaxial Seite nach unten zu den üblichen Blatt Ausrichtung zu halten.
- Verschließen Sie die Petrischalen mit Parafilm (5C) gestreckt um die Schale. Das Gewebe ist nun bereit für die Inkubation.
- Mit sterilen Techniken, Trimm einzelnen sterilisiert Flugblätter von der Kante mit einem Skalpell, und schneiden Sie die verbleibenden Rechtecks in zwei oder three rechteckigen Explantate (8-10 x 3-5 mm) mit der Mitte der Vene in der Mitte jedes Explantat (5A).
- Tissue Incubation
- Die Platten im Dunkeln inkubieren bei 28 ° C in einem Raum mit kontrollierter Temperatur oder Wachstumskammer in der gesamten Kulturperiode.
HINWEIS: Die Explantate werden Entdifferenzierung initiieren, Zellteilung, Zellproliferation (Kallusbildung) und Embryogenese (Differenzierung) zu unterziehen. - Subkultur die Differenzierung Sälen mit Kaminnts nach 3 Wochen auf frisches Medium. An dieser Subkultur überweisen Sie den gesamten Explantat mit einem sterilen Spatel und Pinzette aus rostfreiem Stahl, in einer Steril oder ein Biohazard Schrank. Wie Verhornung auftritt und der Kallus die Größe der größte in 5C überschreitet, übertragen 50% der einzelnen Kallus bei Subkultivierung auf frischem Medium.
- Beachten Sie die ersten Embryonen in ca. 4 Wochen. Zwar gibt es ein gewisses Maß an Synchronität, sammeln verschiedene Embryo Stufen über einem 4-8 Woche Inkubationszeit (6A, B). Sammeln unter einem Binokular und Verfahren nach Versuchsziele.
- Subkultur alle 3 Wochen und Embryonen periodisch zu entfernen, so dass die Explantate werden weiterhin Embryonen für 3 Monate zu produzieren.
- Die Platten im Dunkeln inkubieren bei 28 ° C in einem Raum mit kontrollierter Temperatur oder Wachstumskammer in der gesamten Kulturperiode.
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Representative Results
Für zygotischen Embryogenese Kultivare Strukturen entsprechend den verschiedenen Embryo Stufen in 1A gezeigt - F - F während die verschiedenen Embryo Stufen in 2A gezeigt. Durch die Auswahl Schoten auf der gleichen Stufe, Proben von Samenanlagen, die sehr gleichmäßige erhalten werden (3A) sind. Durch die Verwendung von RT-qPCR Embryo bestimmte Gene können leicht erkannt und Zeitverlauf Studien evaluiert 9. Einige zusätzliche Präparation wird für die weitere Anreicherung des Embryos (3B) zu ermöglichen. Verarbeitung für die in situ Hybridisierungsstrategien können leicht ebenfalls durchgeführt werden, da jegliche ergänzende Studien mit Licht (4A, B) und Elektronenmikroskopie 8. Von besonderem Wert in diesem System ist die Unterscheidungskraft der Hypophyse und suspensor (4A, B).
Für die somatische Embryogenese die cutting des Ausgangsexplantat aus den einzelnen folioles ist in 5A gezeigt. Die Explantate werden dann in engem Kontakt mit dem Agar (5B) abaxialen Seite nach oben. Nach Kallusbildung Embryonen beginnen zu erscheinen nach 3-4 Wochen und nach 7 Wochen gibt es zahlreiche Embryonen im Keimblattstadium (5C). Durch Befolgen der Platten durch den Wochen 4 bis 7 Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten angeordnet werden kann (6A, B). Die verschiedenen Phasen Embryo kann leicht beobachtet werden und einfach abgegriffen für die Analyse. Dies kann durchaus eine schnelle Möglichkeit, bestimmte Arten von Informationen zu gewinnen. Zum Beispiel 7 veranschaulicht, wie Embryonen im frühen Keimblattstadium zeigten eine Expression von einer Art von MtOLEOSIN Gen anderen jedoch nicht. Zeitverläufe Untersuchungen des Gens von Interesse kann dann mit zygotische oder somatische Embryonen untersucht werden. Ein besonderer Vorteil des somatischen Embryos Systems ist, dass Umwandlung der Callus kann ohne Regenerieren einer ganzen Pflanze und Genexpression in verschiedenen Stadien der Embryogenese visualisiert mit GUS (β-Glucuronidase) oder fluoreszierenden Markierungen durchgeführt werden. Ein Beispiel ist in 6C gezeigt.
Abbildung 1: Pod Morphologie und Embryonalentwicklung Stufen Pods in verschiedenen Stadien der Entwicklung mit Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten.. Stufen 2-7 angegeben. (A) und (B) sind Stufen 2 und 3 sehr frühen und frühen pre-Kugelstern (C) Stufe 4 frühen Kugelstern (D) Stufe 5 späten globulären (E) Stufe 6 Herz und (F) Stufe 7 späten Torpedo. Bar beträgt 2 mm. Stufe I ist Blüte (nicht gezeigt).
Abbildung 2: Embryo Entwicklungsstadien. </ Strong> Gelöscht Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien. (A) der Stufe 3 frühen pre-kugelig, (B) Stufe 4 frühen kugelig, (C) Stufe 5 Ende kugelig, (D) Stufe 6 Herzen, und (E) Stufe 7 späten Torpedo. Bar ist 60 um.
Abbildung 3: Getrennte Samenanlagen (A) Gruppe der Samenanlagen mit Stufe 5 Embryonen.. (B) Samenanlage betrachtet unter Standardverbindung Mikroskop, um Embryos, die bei "Haken" Ende ausgeschnitten werden können, zeigen. Bar beträgt 1 mm (A) und 200 & mgr; m (B).
Abb. 4: Morphologie des frühen Embryos (A) Abschnitt durch sehr frühen Embryo-Showing Embryo richtige (vier Zellen), Hypophyse (nächsten vier Zellen), suspensor (nächsten vier Zellen, die große Vakuolen haben) und die Beziehung zu Samenanlage Gewebe. (B) Abschnitt durch frühzeitige Torpedo-Stadium Embryo (E) mit prominenten suspensor (S). Mit Toluidinblau gefärbt. Barren von 10 um (A) und 50 & mgr; m (B).
Abb. 5: Die Kultivierung Explantate auf somatische Embryos zu produzieren (A) Dreiblättrige Blatt zeigt, wo Explantaten aus foliole getroffen werden. (B) Die Explantate auf Agar ausplattiert. (C) Somatische Embryonen aus Explantaten nach 7 Wochen Kultur produziert. Bar is10 mm
Abbildung 6: Somatische Embryos Stufen und Identifizieren der Stelle des Gens expression mit Transformation und GUS. (A) Somatische Embryonen in Kugelstern (G), Herz (H) und Torpedos (T) Stufen. (B) Somatische Embryonen in frühen Keimblattstadium. (C) Kugelsternstufe somatischen Embryonen, die starke GUS-Expression für die MtWOX9 Gen in Embryos richtige (E) und abnehmende Färbung in Hypophyse (H) und suspensor (S). Bar (A, B) ist 100 um. Bar (C) beträgt 50 & mgr; m.
Abbildung 7: Die Genexpression duing Embryogenese in vitro unter Verwendung der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Gene Expression OLEOSIN3 (A) und OLEOSIN4 (B) in der frühen Keimblattstadium Embryonen Embryonen aus embryogenem Callus herausgeschnitten.. Ausdruck ist relativ to Blatt. Standardfehler angegeben.
| Stufenzahl | Embryonalstadium | Pod Bühne |
| Stufe 1 | Blume an der Blüte | |
| Stage 2 | Sehr frühe Pre-Kugelsternembryo | Pod mit einem oder zwei Spiralen |
| Stufe 3 | Frühen pre-Kugelsternembryo | Pod mit drei vollständigen Spiralen |
| Stufe 4 | Frühe Kugelstern | Pod mit fünf vollständigen Spiralen und Stacheln nicht sichtbar |
| Stufe 5 | Späte Kugelstern | Pod mit sechs Spiralen und unreifen Stacheln pod Breite von |
| Stage 6 | Herz Bühne | Pod mit sechs Spiralen und länglich mit Fälligkeit von mehr als Stacheln pod Breite |
| Stufe 7 | TorpedoBühne | Pod mit sechs Spiralen, reifen dicker mehr Stacheln und erhöhte Umfang |
Tabelle 1: Kriterien für die Ernte von pod Stufen morphologischen Kriterien bei der Ermittlung von pod Stufen entsprechend definierten Embryos Stadien eingesetzt..
| Blumen-Stufe 1 (S1) | Pod Stage 2 (S2) | Pod Stufe 3 (S3) | Pod Stufe 4 (S4) | Pod Stufe 5 (S5) | Pod Stage 6 (S6) | Pod Stufe 7 (S7) | |
| Tage | 0 | 1.5-2 | 0,5-1 | 0,5 | 0,5-1 | 1 | 1-1,5 |
Tabelle 2. Zeitverlauf für pod Kollektion. Die Zeit von ter vorherige Embryo Entwicklungsphase in Tagen angegeben.
| Wichtige Salze / L | Minor Salze / L | Vitamine / L | |||
| mg | mg | mg | |||
| KNO 3 | 1875 | MnSO 4 • H 2 O | 10 | Myo-Inositol | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | Thiamin-HCl | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO 4 • 7 H 2 O | 2 | Nikotinsäure | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0.75 | Pyridoxin-HCl | 1 | |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 225 | Na 2 MoO 4 • 2 H 2 O | 0,25 | ||
| Calcium getrennt | CuSO 4 • 5 H 2 O | 0,025 | |||
| CaCl 2 • 2H 2 O | 300 | CoCl 2 • 6H 2 O | 0,025 | ||
| Chelateisen separaten | |||||
| FeSO 4 • 7 H 2 O | 9,267 | ||||
| Na 2 EDTA • 2H 2 O | 37.2 | ||||
Tabelle 3: P4 Medium Die Komponenten des P4 Medium..
| Komponente | Menge / L |
| 10 x wichtigsten Salze | 100 ml |
| 100 x Calcium | 10 ml |
| 1.000 x kleinere Salze | 1 ml |
| 200 x Eisen | 5 ml |
| 100 x Casaminosäuren | 10 ml |
| 1.000 x Vitamine | 1 ml |
| Sucrose | 30 g |
| Agar | 8 g |
| Hormone | |
| 1,000 uM NAA | 10 ml |
| 1000 um BAP | 4 ml |
| 1,000 uM ABA | 1 ml | </ Tr>
| 1,000 uM GA | 5 ml |
Tabelle 4: Schminken der P4-Medium mit Hormonen aus denen sich die P4-Medium mit Hormonen aus Stammlösungen..
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Discussion
Die beschriebenen Protokolle sind relativ einfach und ermöglicht Untersuchung der Leguminosen Embryogenese mit allen modernen Zell- und molekulare Techniken. Wir erkennen, dass es Vorteile und Nachteile sowohl in vivo und in vitro-Ansätze. Beide erlauben mehr Fokus auf der frühen Embryogenese im Vergleich zu Kultur der unreifen Samen 19.
Im Fall von in vivo-Studien, was beschrieben wird vorwiegend die Isolierung der Samenanlage von dem POD passend für viele Embryos Studien ist. Selbstverständlich ist es möglich, weiter zu bereichern für Embryogewebe durch Schneiden Sie den "Haken" Bereich (3B). Es ist schwierig, die frühesten Stadium der Embryonalentwicklung zu isolieren, während disection der Embryo oft verloren, da sie nicht gut auf das benachbarte Gewebe befestigt, so dass die Verwendung von Samenanlagen von Vorteil. Verwendung pod Morphologie entfällt die Kennzeichnung von Blumen und mit einer Zeit course Regime für jede Blume. Darüber hinaus gibt es potenzielle Variabilität in Entwicklungszeitverfahren sei denn, die Umgebung ist sehr streng kontrolliert. Optimales Pflanzenwachstum wichtig ist, so dass pod Bildung nicht unter Belastungsbedingungen auftritt. Machen Sie sich mit pod Entwicklung vertraut und leichte Anpassungen vorgenommen, um morphologische Stufen zu definieren, um bestimmte Embryo Entwicklungsstufen angepasst werden.
Im Fall der somatischen Embryogenese, muss es anerkannt werden, daß die Embryonen ungeschlechtlich und nicht aus einer Zygote abgeleitet. Außerdem unterscheidet sich die zygotischen Embryo der Nährstoffquelle. Im Falle des somatischen Embryos ist es das Kulturmedium und der umgebenden Kallus, und im Fall des zygotischen Embryos ist das Endosperm. Dies bedeutet, der suspensor viel besser in dem Fall des zygotischen Embryos entwickelt (4A, B). Der besondere Wert des M. truncatula Systems ist die große Anzahl von Embryonen in Reaktion auf die ungewöhnlich vier hormone-Regimes. Wenn die große Zahl nicht auftreten, dann überprüft die Details, aus denen die Hormone und deren Neben dem Medium sollte überprüft werden. Wie bei jeder Kultur Methodik Sterilität des Explantatgewebe ohne Schaden (kleine Anpassungen vornehmen, um die Zeitmessung von Ethanol und Hypochlorit Sterilisationszeiten, wenn dies ein Problem darstellt) ist wichtig, zusammen mit der Sorgfalt bei der Aufrechterhaltung der Sterilität bei allen Herstellungsschritten.
Was wir gefunden haben, ist, dass es wertvoll, um in vivo und in vitro-Verfahren ergänzen. Ein Beispiel aus unserer eigenen Studien ist die Untersuchung des Transkriptionsfaktors MtSERF1 (somatischen Embryonen ähnlichen Faktor 1), die ein Ethylen-Antwort-Transkriptionsfaktor-Gen ist. MtSERF1 wurde zuerst in somatischen Embryos mit RNAi-Promotor-GUS-Fusionen und in-situ Hybridisierungen entdeckt; und dann gezeigt, dass in zygotischen Embryogenese 20 ausgedrückt werden.
Das Studium der Leguminosen Embryogenese ist wichtig für hUman Ernährung und mit M. truncatula Embryonen zusammen mit den zellulären und molekularen Technologien ab sofort können diesen Bereich zu verbessern. Einsicht kann in, wie Embryogröße und damit Ausbeute kann zusammen mit der erforderlichen Kohlenhydrat, Öl und Proteinzusammensetzung optimiert werden, erhalten werden. Diese Determinanten sind weitgehend in Zug in der frühen Embryogenese 8,9 eingestellt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
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