Abstract
עובר מוקדם החל מהזיגוטה תא בודדת עובר דרך חלוקת תאים מהירה והמורפוגנזה, ומאופיין מורפולוגית בשלבים טרום-כדורי, כדורי, לב, טורפדו וטבורית. פיתוח מתקדם זה הוא תחת הרגולציה ההדוקה של רשת מולקולרית מורכבת. קציר עוברים מוקדם מספיק בשלב דומה של פיתוח הוא חיוני לחקירת הוויסות התאית ומולקולרית של עובר מוקדם. זה לא פשוט מאז עובר מוקדם עובר המורפוגנזה מהירה בזמן קצר לדוגמא 8 ימים לMedicago truncatula להגיע שלב טבורית המוקדם. כאן, אנו מתייחסים לנושא בשתי גישות. הראשון קובע זיקה בין התפתחות עובר ומורפולוגיה תרמיל בסיוע מצביע על השלב של עובר zygotic. זה מבוסס בעיקר על מספר ספירלות תרמיל והפיתוח של עמוד השדרה. דרך חלופית כדי להשלים את in vivo שלtudies הוא באמצעות explants עלה culturing לייצר עוברים גופניים. הבינוני כולל שילוב הורמון יוצא דופן - אוקסין (חומצת 1-naphthaleneacetic), ציטוקינין (6-benzylaminopurine), חומצת abscisic וחומצת gibberellic. ניתן להבחין בשלבים השונים הצומחים מתוך היבלת ללא נתיחה.
Introduction
קטניות הן המשפחה השלישית בגודלה של צמחים גבוהים עם כ -20,000 מינים ומשפחת בלאגאמינוסא (או Fabaceae) הם שני לדגנים באזור שנקטפו וייצור כולל 1. סויה היא היבול טיפח השלישי בגודלה. קטניות דגנים מספקות כשליש מחלבון תזונתי ושליש משמן צמחי למאכל אדם 2. קטניות עם קיבולת תיקונם N 2 גם לתרום למערכות חקלאיות ברות קיימא. Truncatula Medicago, כמו סויה, חלבון חנויות ונפט בפסיגים של הזרעים והוא מודל קטניות גנטי והגנומי עם משאבים גנטיים והגנומי רבים 3,4. בעוד מ ' truncatula אפשר התקדמות בהבנת הסימביוזה הקטניות-rhizobium 4 זה כבר מועסק יותר ויותר ללמוד ביולוגיה זרע קטניות 5-7 ועובר 8,9. עובר ארבידופסיס נחקר בהרחבה 10,11 אבל זה אניללא קטניות sa ואת הפרטים של עובר אינן זהות לMedicago 8,10. עובר Zygotic במ ' יש truncatula תכונות מעניינות, עם היפופיזה ייחודית רב-תאית, suspensor endoployploid ותא העברת בסיס 8.
עובר סומטי (SE) משמש בדרך כלל לחידוש צמחים 12. במודל הקטניות מ ' truncatula, קו זרע Jemalong 2HA (2HA) פותח מההורה Jemalong יש שיעור גבוה של עובר גופני 13. לאחרונה מספר העוברים שיוצרו כבר עלה באופן מהותי על ידי הוספת שתי חומצת gibberellic (GA) וחומצת abscisic (ABA) למדיום הוותיק 14. במקרה זה GA ומעשה ABA בסינרגיה, שהוא יוצא דופן בהתחשב בכך שGA וABA בדרך כלל לפעול באיבת 14. העוברים המופקים מיבלת לפתח על פני השטח המאפשר לשלב של עובר להיות בקלות נקבע visually ונקטף בקלות. לאחר ליד קווי isogenic שembryogenic (2HA) ולא embryogenic (Jemalong) מאפשרת החקירה של עובר גופני ושיש שני in vivo ובמערכות מבחנה מספקת אפשרויות ניסויים שונות.
הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של התפתחות עובר היא חיונית לזרע הבנה והתפתחות צמח. בקטניות, כמו בdicotyledons האחר, זה הפסיגים של העובר שלאחסן את המוצרים המשמשים לתזונת אדם. עובר מוקדם כרוך חלוקת תא מהירה, ודפוסי עובר נכונים. בכ 8 ימים לאחר ההפריה, מ ' עובר truncatula מגיע שלבים מוקדמים טבורית. אפיון מורפולוגי לא הצביע בדיוק על ידי ימים לאחר הפריה בתנאי חממה. לפיכך, גישה סטנדרטית יעילה כדי לציין את השלב של עוברים מתפתחים היא רבת ערך בלימוד regul הגנטיני של עובר zygotic המוקדם.
במאמר זה, אנו מספקים שני פרוטוקולים סטנדרטיים לאסוף עוברים מתפתחים למחקרים ביולוגיים של עובר במודל הקטניות מ ' truncatula. הראשון הוא לאסוף עוברי zygotic ידי שיוך מורפולוגיה עובר ותרמיל ואילו השני הוא עובר גופני באמצעות explants עלה culturing לספק מספרי עובר גדולים לגשת בקלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פיתוח העובר Zygotic
- חומר צמחי
- לגדול Medicago truncatula סוג בר Jemalong או isogenic הקרוב, מאוד מחדש generable גנוטיפ Jemalong 2HA 13 (המכונה 2HA) בחממה עם photoperiod 14 שעות ו / 19 ° טמפרטורת יום / לילה C 23 ° C.
- פירס פני השטח של קליפת הזרע (עם מחט G 23) לפני זריעת הזרע כך המים שהורשו להיכנס לזרע ולספוג במים למשך הלילה. להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הזרע באופן מלא.
- לזרוע זרעים 3 בכל סיר בקוטר 15 סנטימטר (כולל של 10 סירים) בתערובת שתילה (חול, פרלייט, קויר-כבול הגס (1: 1) בתוספת 5 גרם של תקן Osmocote מדויק:: 1 דשן שחרור איטי) והעברה ל חממה. שמור השתיל הבריא לאחר נביטה ולכן יש צמח 1 לסיר ולהקיף ידי סבכה למפעל נובע לטפס.
- לגדול Medicago truncatula סוג בר Jemalong או isogenic הקרוב, מאוד מחדש generable גנוטיפ Jemalong 2HA 13 (המכונה 2HA) בחממה עם photoperiod 14 שעות ו / 19 ° טמפרטורת יום / לילה C 23 ° C.
- תרמילי קציר
- לאסוף תרמילים מwסוג הכשרת היישוב Jemalong או 2HA להשיג שלבי עובר המוקדם המתאימים כמתואר 9 ראשון.
הערה: שלבי התרמיל השונים מוצגים באיור 1 ושלבי עובר המקביל מוצגים באיור 2. - בדוק את השלבים השונים בתרמיל הקציר באמצעות קריטריונים לפי טבלת 1. מדוד את הזמן שחלף מהשלב 6 כדי לעזור שלבים נפרדים 6 ו -7 (טבלה 2).
- לאסוף תרמילים מwסוג הכשרת היישוב Jemalong או 2HA להשיג שלבי עובר המוקדם המתאימים כמתואר 9 ראשון.
- לנתח ביציות מתרמילים ובדיקת שלב העובר
- לבודד ביציות מתרמילים באמצעות מלקחיים עדינים לבד או מיקרוסקופ לנתח סטריאו ומלקחיים בהתאם לצורך. אם נדרש שלב העובר ניתן לבדוק במהירות באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי (איור 3).
- כן שונה הפתרון של Hoyer מכיל 7.5 גרם מסטיק ערבי, 100 כלורל גרם, 5 מיליליטר גליצרול, 60 מיליליטר deionized מים מזוקקים. ממיסים על ידי ערבוב במשך 3-5 שעות או לילה.
- במשך יותר לחדדמיקרוסקופיה ד לנקות את הביציות גזור ב15,16 הפתרון של Hoyer שונה. בזהירות להרים את הביציות ללא פגע ומקום בנפח קטן של הפתרון של Hoyer (מספיק כדי לכסות את הביצית) בטמפרטורת חדר עד ברור.
- צפה דגימות עם התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה. ללכוד תמונות iwth מצלמה דיגיטלי 9 (איור 2).
- להשיג ביציות אחידות ביותר מאזור התרמיל המרכזי ולצבור את המספר הנדרש. דוגמא מוצגת באיור 3 א. לאסוף את הביציות על קרח ולאחסן בטמפרטורה הנדרשת (חומצות -80 ° C לגרעין) לניתוח נוסף.
הערה: לפרטים על ניתוח סעיפים היסטולוגית, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים, וכלאה באתר אנא ראה ניירות 8,9.
2. פיתוח העובר סומטי במבחנה
- השתמש מ ' לא זן truncatulaכובע הוא מסוגל ליצור בקלות עובר בתרבות. לפרוטוקול זה לexplants העלה להשתמש בצמחי 2HA 13,17 שישנים 2-4 חודשים.
- קח עלונים מעלו trifoliate האחרון כמעט הרחיבו באופן מלא של גזע מתארך.
- שמור את העלים trifoliate על מגבת נייר לחה בסיר תרבות כדי למנוע התייבשות.
הערה: לאחר העלים trifoliate נקצרים הם צריכים להיות מנוצלים עם עיכוב מינימאלי. - הכנה של מדיום התרבות
- השתמש 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים באגר (0.8% w: V) ב9 סנטימטרים צלחות פטרי.
הערה: 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים מורכב של מדיום בסיס P4 18 בתוספת 10 חומצת 1 מיקרומטר-naphthaleneacetic (NAA), 4 מיקרומטר 6-benzylaminopurine (BAP), 1 מיקרומטר חומצת abscisic (ABA) ו -5 מיקרומטר gibberellic חומצה (GA). השימוש בGA + ABA מאיץ היווצרות עובר וגורם לעליות מהותיות במספר עובר 14. - מרכיבים את מדיום בסיס P4 בL 1; בהיקף של מלחים גדול (לעשות calciuמ 'עד בנפרד), מלחי קטין וויטמינים (לוח 3), ברזל chelated (לפצות בנפרד), casamino חומצות (hydrolyzate קזאין), 30 גרם סוכרוז, 8 אגר ז.
- פתרונות מניות חנות של מלחים גדול, סידן, חומצות casamino, מלחים ויטמינים וקטין ב -20 מעלות צלזיוס aliquots המתאים. אחסן ברזל chelated ב 4 מעלות צלזיוס.
- מרכיבים את ברזל chelated (200x) על ידי המסת 7.44 גרם של Na 2 EDTA • 2H 2 O בכ 900 מיליליטר של מים מזוקקים deionized תוך ערבוב, ואז להביא את הפתרון ל98-99 מעלות צלזיוס תוך הוספת 1.853 גרם של 4 FeSO • 7H 2 א ' לבסוף לעשות עד 1 ליטר כאשר המרכיבים מומסים. חנות בענבר צבעונית בקבוקים ב 4 מעלות צלזיוס.
- מרכיבים את מדיום בסיס P4 עם פתרונות המניות כבטבלה 4. ההורמונים במדיום הם 10 מיקרומטר NAA, 4 BAP מיקרומטר, ABA 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר GA (ראה טבלת טבלה 4 וחומרים ספציפיים). הוסף את NAAוBAP לפני מעוקר ולהוסיף ABA וGA לאחר המעוקר וקירור לכ -55 מעלות צלזיוס, באמצעות עיקור מסנן עם 0.22 מיקרומטר סינון מצורף מזרק. מערבבים היטב על ידי מתערבל עדין.
- התאם את התקשורת לpH 5.8 עם 1 M KOH לפני מעוקר. החיטוי בC ° 121 במשך 20 דקות.
- לאחר המעוקר להוסיף ABA המסנן מעוקר וGA, ויוצקים כ 25 מיליליטר של תקשורת ל9 סנטימטרים צלחות פטרי סטרילי בזרימה למינרית או ארון Biohazard. מגניב ולתת את אגר קבע עם המכסה. ואז לשים על המכסה ולוודא שאין עיבוי על המכסה. תווית כנדרש ולאחסן ב 4 ° C (בקופסא קרטון כדי למנוע עיבוי מכסה).
- השתמש 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים באגר (0.8% w: V) ב9 סנטימטרים צלחות פטרי.
- עיקור של רקמת העלה
- לעבוד בזרימה למינרית עיקור UV או ארון Biohazard.
- מקום משאיר לרשת הכדור של infuser אביב תה autoclaved בעבר.
- לטבול את infuser תה המכיל את העלים ב -70% (v: v) אתנול ברחוב ללאסיר ture למשך 30 שניות.
הערה: לכל השלבים בהליך זה משתמשים 250 מיליליטר בורג סירי תרבות פוליקרבונט כובע שautoclaved. - מסננים ולאחר מכן להעביר ולטבול את רקמת עלה 1: 8 (v: v) אקונומיקה מדוללת (כלור 0.5%) במשך 10 דקות. מערבולת בעדינות מהעת לעת.
- מסננים את אקונומיקה ולהעביר את infuser התה בסיר תרבות המכיל מים מזוקקים deionized סטרילית. מערבולת בעדינות וניקוז מים עודפים. חזור עוד פעם אחת עם סיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית.
- להסיר עלים מinfuser התה עם מלקחיים סטריליות לסיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. ברגים בכובע סטרילי ולשטוף על ידי היפוך ומתערבל. השאר עלים צפים על המים סטריליים עד מוכן להכין explants.
- הכנה וציפוי Explants
- באמצעות שימוש בטכניקות סטרילי, לקצץ עלונים מעוקרים בודדים מהקצה עם אזמל, וחתך את המלבן שנותר לשניים או thrEE explants המלבני (8-10 x 3-5 מ"מ) עם אמצע הווריד במרכזו של כל explant (איור 5 א).
הערה: הגודל של explant הוא די חשוב בייזום שפשף הראשון. לבצע את החיתוך על עפעפי סטרילי ממכלי מזון לקחת משם. - צלחת 6 explants במדיום התרבות-הגדילו את אגר ב9 מנות קוטר סנטימטר פטרי (איור 5). צלחת בצד abaxial explants למטה כדי לשמור על אוריינטצית עלה רגילה.
- לאטום את צלחות פטרי עם Parafilm (איור 5 ג) נמתחו סביב הצלחת. הרקמה מוכנה לדגירה עכשיו.
- באמצעות שימוש בטכניקות סטרילי, לקצץ עלונים מעוקרים בודדים מהקצה עם אזמל, וחתך את המלבן שנותר לשניים או thrEE explants המלבני (8-10 x 3-5 מ"מ) עם אמצע הווריד במרכזו של כל explant (איור 5 א).
- דגירה רקמה
- דגירה הצלחות בחושך על 28 מעלות צלזיוס בטמפרטורה מבוקרת חדר או ארון צמיחה לאורך כל תקופת התרבות.
הערה: explants ייזום dedifferentiation, לעבור חלוקת תא, התפשטות (היווצרות יבלת) ועובר (בידול). - תת expla ההבחנהNTS לאחר 3 שבועות למדיום חדש. בתת-תרבות זו להעביר את כל explant בעזרת מרית סטרילי נירוסטה ומלקחיים, בזרימה למינרית או ארון Biohazard. כשפשפתי מתרחש והיבלת חורגת מהגודל של אחד הגדול באיור 5 ג, להעביר 50% מהיבלת בודדת כאשר subculturing למדיום חדש.
- שים לב לעוברים הראשונים בכ -4 שבועות. אמנם יש מידה מסוימת של תיאום, לאסוף שלבי עובר שונים על תקופת דגירה 4-8 שבוע (איור 6 א ', ב'). לאסוף תחת מיקרוסקופ לנתח ותהליך על פי מטרות ניסוי.
- תת-תרבות כל 3 שבועות ולהסיר עובר מעת לעת, כך שexplants ימשיך לייצר עוברים במשך 3 חודשים.
- דגירה הצלחות בחושך על 28 מעלות צלזיוס בטמפרטורה מבוקרת חדר או ארון צמיחה לאורך כל תקופת התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
למבני תרמיל zygotic עובר שונה המתאימים לשלבי עובר השונים מוצגים באיור 1 א - F ואילו שלבי העובר השונים מוצגים באיור 2 א - F. על ידי בחירת תרמילים באותו השלב, דגימות של ביציות שניתן להשיג אחיד למדי (איור 3 א). על ידי שימוש בעובר RT-qPCR גנים ספציפיים יכולים להיות מזוהים בקלות ומחקרים כמובן זמן מוערך 9. כמה נתיחה נוספת תאפשר להעשרה נוספת של העובר (איור 3). עיבוד באתר יכולים להתבצע בקלות את אסטרטגיות הכלאה כמו גם כל מחקרים משלימים מעורבים אור (איור 4 א ', ב') ומיקרוסקופ אלקטרונים 8. של ערך מסוים במערכת זו הוא לייחודו של (איור 4 א ', ב') היפופיזה וsuspensor.
לעובר גופני גאוטינג של explant הראשוני מfolioles הבודד מוצגת באיור 5 א. אז explants ממוקמים צד abaxial בקשר הדוק עם אגר (איור 5). לאחר יבלת עוברי היווצרות מתחילים להופיע לאחר 3-4 שבועות ועל ידי 7 שבועות יש מספר רב של עוברים בשלב טבורית (איור 5 ג). על ידי ביצוע הצלחות דרך בין שבועות 4 ו -7 עוברים בשלבים בדידים יכול להיות ממוקם (איור 6 א ', ב'). שלבי העובר השונים ניתן להבחין בקלות ובפשטות הרימו את ניתוח. זה יכול להיות דרך מהירה למדי כדי לקבל סוגים מסוימים של מידע. לדוגמא 7 איור מדגים כיצד עוברים בשלב מוקדם טבורית הראו ביטוי של סוג אחד של גן MtOLEOSIN אבל לא עוד. מחקרי קורסי זמן של הגן של עניין אז יכולים להיות נבחנו באמצעות zygotic או עוברים גופניים. יתרון מסוים של מערכת העובר הגופנית הוא שינוי של calluים יכול להתבצע ללא התחדשות צמח כולו וביטוי גנים בשלבים שונים של עובר דמיין באמצעות גאס (β-glucuronidase) או תוויות ניאון. דוגמא מוצגת באיור 6 ג.
איור 1: מורפולוגיה Pod ושלבי התפתחות עובר שקיקים בשלבים שונים של פיתוח עם עוברים בשלבים בדידים.. שלבי 2-7 מצויינים. (א) ו- (ב) הם שלבים 2 ו -3 בשלב מוקדם מאוד ובתחילת שלב קדם-כדורי (ג) 4 שלב מוקדם כדורי (ד ') 5 (ה) לב כדורי בשלב מאוחר 6 ושלב (F) 7 טורפדו מאוחר. בר הוא 2 מ"מ. שלב I הוא פריחה (לא מוצג).
איור 2: שלבי התפתחות העוברית. </ עוברי strong> מסומנים בשלבי פיתוח שונים. שלב () 3 שלב מוקדם מראש כדורי, (ב) 4 כדורית מוקדם, שלב (ג) 5 כדורי מאוחר, (ד) שלב 6 לב, ובמה (E) 7 טורפדו מאוחר. בר הוא 60 מיקרומטר.
ביציות מבודדות () קבוצה של ביציות עם 5 עובר שלב: איור 3.. (ב) ביצית שנצפה תחת מיקרוסקופ מתחם הסטנדרטי להראות עובר שניתן נכרת בסוף "וו". בר הוא 1 מ"מ () ו -200 מיקרומטר (ב ').
סעיף מורפולוגיה של העובר המוקדם () באמצעות תכנית עובר בשלב מוקדם מאוד: איור 4.ing עובר תקין (ארבעה תאים), היפופיזה (ארבעה התאים הבאים), suspensor (ארבעה תאים הבאים שיש לי vacuoles הגדול) וקשר לרקמות ביצית. סעיף (ב) דרך עובר טורפדו בשלב מוקדם (E) עם suspensor הבולט (S). מוכתם עם toluidine הכחול. בר הוא 10 מיקרומטר (א) ו -50 מיקרומטר (B).
איור 5:. Culturing explants לייצר עוברים גופניים () מראה עלה trifoliate בי explants מfoliole נלקחים. Explants (ב ') בציפוי על אגר. (ג) עובר סומטי המופק מexplants אחרי תרבות 7 שבועות. בר מ"מ is10
איור 6: שלבי עובר סומטי וזיהוי מיקומו של השתקף גןn באמצעות שינוי וגאס. () עוברים סומטי בכדורי (G), לב (H) וטורפדו שלבים (T). (ב) עוברי סומטי בשלב טבורית מוקדם. (ג) העובר כדורי שלב גופני מראה ביטוי גאס חזק לגן MtWOX9 בעובר תקין (E) וצביעת ירידה בהיפופיזה (H) וsuspensor (S). בר (A, B) הוא 100 מיקרומטר. בר (ג) הוא 50 מיקרומטר.
איור 7: התבטאות גני duing עובר במבחנה באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) התבטאות גנים של OLEOSIN3 () וOLEOSIN4 (ב ') בעוברים בטבורית המוקדמת נכרת מן העוברים מיבלת embryogenic.. ביטוי הוא לא ביחסעלה o. סטיות התקן שצוינו.
| מספר שלב | שלב עובר | שלב Pod |
| שלב 1 | פרח בanthesis | |
| שלב 2 | העובר בשלב טרום-כדורי מוקדם מאוד | תרמיל עם ספירלות אחד או שתיים |
| שלב 3 | העובר בשלב טרום-כדורי מוקדם | תרמיל עם שלוש ספירלות מלאים |
| שלב 4 | כדורי מוקדם | תרמיל עם חמש ספירלות וקוצים שלמות אינו גלוי |
| שלב 5 | כדורי מאוחרת | תרמיל עם שש ספירלות וקוצים לא בוגרים שאינו עולה על רוחב תרמיל |
| שלב 6 | שלב לב | קוצי Pod עם שש ספירלות ומוארכות התבגרות עולים רוחב תרמיל |
| שלב 7 | טוֹרפֵּדוֹשלב | תרמיל עם שש ספירלות, להתבגר עבים קוצים ארוכים והיקף מוגבר |
טבלת 1: קריטריונים לקציר של שלבי תרמיל קריטריונים מורפולוגיים המשמשים בזיהוי שלבי תרמיל מתאים לשלבי עובר מוגדרים..
| פרח שלב 1 (S1) | תרמיל שלב 2 (S2) | Pod שלב 3 (S3) | Pod שלב 4 (S4) | Pod שלב 5 (S5) | Pod שלב 6 (S6) | Pod שלב 7 (S7) | |
| ימים | 0 | 1.5-2 | 0.5-1 | 0.5 | 0.5-1 | 1 | 1-1.5 |
כמובן טבלה 2. זמן לאוסף תרמיל. הזמן מtהוא שלב פיתוח עובר קודם שצוין בימים.
| מלחים גדולים / L | מלחי קטין / L | ויטמינים / L | |||
| מ"ג | מ"ג | מ"ג | |||
| Kno 3 | 1,875 | MnSO 4 • H 2 O | 10 | מיו-אינוזיטול | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | תיאמין HCl | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO 4 • 7H 2 O | 2 | חומצה ניקוטינית | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0.75 | פירידוקסין HCl | 1 | |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 225 | Na 2 Moo 4 • 2H 2 O | 0.25 | ||
| סידן נפרד | 4 CuSO • 5H 2 O | 0.025 | |||
| CaCl 2 • 2H 2 O | 300 | CoCl 2 • 6 שעות 2 O | 0.025 | ||
| ברזל chelated נפרד | |||||
| 4 FeSO • 7H 2 O | 9.267 | ||||
| Na 2 EDTA • 2H 2 O | 37.2 | ||||
טבלה 3: P4 בינוני הרכיבים של מדיום P4..
| רכיב | הסכום / L |
| 10 x מלחים גדולים | 100 מיליליטר |
| 100 x סידן | 10 מיליליטר |
| 1,000 x מלחי קטין | 1 מיליליטר |
| 200 x ברזל | 5 מיליליטר |
| 100 x casamino חומצות | 10 מיליליטר |
| 1,000 x ויטמינים | 1 מיליליטר |
| סוכרוז | 30 גרם |
| אגר | 8 גרם |
| הורמונים | |
| 1,000 מיקרומטר NAA | 10 מיליליטר |
| 1,000 מיקרומטר BAP | 4 מיליליטר |
| ABA 1000 מיקרומטר | 1 מיליליטר | </ Tr>
| 1,000 מיקרומטר GA | 5 מיליליטר |
לוח 4: ביצוע עד בינוני P4 עם הורמונים המרכיב את מדיום P4 עם הורמונים מפתרונות מניות..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים שתוארו הם יחסית ישר קדימה ולאפשר חקירה של עובר קטניות עם כל התא העכשווי וטכניקות מולקולריות. אנו מכירים בכך שיש יתרונות וחסרונות של שני in vivo ובגישות חוץ גופית. שני לאפשר יותר דגש על עובר מוקדם בהשוואה לתרבות של זרעים בשלים 19.
במקרה של מחקרי in vivo מה שמתואר הוא בעיקר הבידוד של הביצית מהתרמיל אשר מתאים ללימודי עובר רבים. זה כמובן אפשרי כדי להעשיר עוד יותר לרקמות עובר על ידי חיתוך את אזור "וו" (איור 3). קשה לבודד את השלב מאוד המוקדם של פיתוח עובר כבמהלך disection העובר לעתים קרובות איבד כפי שהוא אינו מחובר היטב לרקמות הסמוכות, מה שהופך את השימוש בביציות יתרון. באמצעות מורפולוגיה תרמיל מבטל התיוג של פרחים ויש להם זמן גמשטר ourse לכל פרח. בנוסף יש השתנות פוטנציאל בשיטות תזמון התפתחותי אלא אם הסביבה נשלטת מאוד הדוק. גידול צמחים אופטימלי הוא חשוב כל כך שהיווצרות התרמיל אינה מתרחשת בתנאי לחץ. הכר את פיתוח תרמיל והתאמות קלות יכולות להתבצע להגדיר שלבים מורפולוגיים להתאים שלבי פיתוח עובר ספציפיים.
במקרה של עובר גופני, יש בו כדי להכיר בכך שהעוברים נגזרים לא-מיני ולא מהזיגוטה. כמו כן, המקור התזונתי שונה לעובר zygotic. במקרה של העובר הגופני, זה מדיום התרבות ויבלת שמסביב, ובמקרה של עובר zygotic זה האנדוספרם. משמעות דבר הוא הרבה יותר טוב suspensor פיתח במקרה של עובר zygotic (איור 4 א, ב). ערך המסוים של מ ' מערכת truncatula היא המספר הגדול של עוברים בתגובה לארבע hormon יוצא דופןמשטר דואר. אם המספרים הגדולים לא מתרחשים אז לבדוק את הפרטים של מה שהופך את ההורמונים ובנוסף למדיום צריך להיבדק. כמו עם כל עקרות מתודולוגיה התרבות של רקמות explant ללא נזק (לבצע התאמות קטנות לעיתוי של אתנול ופעמים עיקור היפוכלוריט אם מדובר בבעיה) חשוב יחד עם הטיפול בשמירה על סטריליות בכל צעדי preparative.
מה שמצאנו הוא שזה יקר כדי להשלים in vivo ובתהליכי מבחנה. דוגמא מהמחקרים שלנו היא החקירה של גורם שעתוק MtSERF1 (פקטור עוברי סומטיים 1) שהוא גן גורם שעתוק תגובת אתילן. MtSERF1 התגלה לראשונה בעוברים גופניים באמצעות RNAi, שילובי האמרגן-גאס וhybridisations באתר; ולאחר מכן הראה שבא לידי ביטוי בעובר zygotic 20.
המחקר של עובר קטניות הוא חשוב עבור hתזונת אומן, ובאמצעות מ ' truncatula עוברים יחד עם הטכנולוגיות התאיות ומולקולריות זמינות כעת יכול לשפר תחום זה. ניתן להשיג תובנות לגבי אופן שגודל עובר, ולכן תשואה יכולים להיות מותאם יחד עם הרכב פחמימות, שמן וחלבון הנדרש. גורמים אלה נקבעים במידה רבה ברכבת בעובר מוקדם 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
