Abstract
Tidlig embryogenese å starte fra en enkelt celle zygote går gjennom rask celledeling og morfogenese, og er morfologisk kjennetegnet ved pre-globulære, globular, hjerte-, torpedo- og cotyledon etapper. Denne progressive utvikling er under tett regulering av et komplekst molekyl nettverk. Høsting tilstrekkelige tidlige embryoer på et tilsvarende utviklingstrinn er avgjørende for å undersøke cellulært og molekylært regulering av tidlig embryogenesis. Dette er ikke enkelt siden tidlig embryogjennomgår raske morphogenesis i en kort stund f.eks 8 dager for Medicago truncatula å nå tidlig cotyledon scenen. Her tar vi problemet ved to tilnærminger. Den første som etablerer en sammenheng mellom embryo utvikling og pod morfologi i å hjelpe indikere fasen av zygotiske embryo. Dette er spesielt basert på antall pod spiraler og utvikling av piggene. En alternativ måte å utfylle in vivo studies er via dyrkning blad eksplantater å produsere somatiske embryoer. Mediet omfatter en uvanlig kombinasjon hormon - en auxin (1-naftaleneddiksyre), en cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic syre og gibberlinsyre. De ulike stadiene kan skjelnes vokser ut av callus uten disseksjon.
Introduction
Belgfrukter er den tredje største familien av høyere planter med ca 20.000 arter og leguminosae (eller Fabaceae) familie er uten korn i området høstet og total produksjon 1. Soyabønner er den tredje største dyrket avling. Korn belgfrukter gir om lag en tredjedel av protein og en tredjedel av vegetabilsk olje til konsum to. Belgfrukter med sin N 2 fikseringskapasitet også bidra til bærekraftige landbrukssystemer. Medicago truncatula, som soyabønner, butikker protein og olje i cotyledons av sine frø, og er en genetisk og genomisk legume modell med betydelige genetiske og genomiske ressurser 3,4. Mens M. truncatula har aktivert fremskritt i forståelsen av belgfrukt-Rhizobium symbiose 4 har det blitt stadig mer brukt til å studere legume frø biologi 5-7 og embryogenese 8,9. Arabidopsis embryogenese har blitt grundig studert 10,11, men det jegsa ikke-belgfrukt og detaljene embryogenese er ikke identisk med Medicago 8,10. Zygotiske embryogenese i M. truncatula har interessante funksjoner, med en særegen flercellet hypofysen, en endoployploid suspensor og basal overføring celle 8.
Somatisk embryogenese (SE) er ofte brukt for regenerering planter 12. I legume modellen M. truncatula, til frøet linje Jemalong 2HA (2HA) har blitt utviklet fra den overordnede Jemalong har høy forekomst av somatisk embryogenese 13. Antall embryoer produseres har nylig blitt hovedsak økt ved å legge både gibberellinsyre (GA) og abscisic syre (ABA) til veletablert medium 14. I dette tilfellet GA og ABA handle synergi, noe som er uvanlig gitt at GA og ABA vanligvis handle antagonistically 14. Embryoene produsert fra callus utvikle seg på overflaten, noe som gjør at fasen av embryogenese til lett bestemmes visually og lett høstes. Å ha nær isogene linjer som er embryo (2HA) og ikke-embryo (Jemalong) letter etterforskningen av somatisk embryogenese og ha både in vivo og in vitro-systemer gir ulike eksperimentelle muligheter.
Forstå de cellulære og molekylære mekanismer av embryo utvikling er avgjørende for forståelsen frø og planteutvikling. I belgfrukter, som i andre dicotyledons, er det cotyledons av embryoet som lagrer de produktene som er brukt for human ernæring. Tidlig embryogenese innebærer rask celledeling, og riktig embryo mønster. I ca 8 dager etter befruktning, M. truncatula embryo kommer tidlig cotyledon etapper. Den morfologiske karakterisering er ikke akkurat indikert av dager etter befruktning i glasshouse forhold. Dermed er verdifullt i å studere den genetiske regul en effektiv standardisert tilnærming for å indikere den fasen av utviklings embryoerasjon av tidlig zygotiske embryogenese.
I denne artikkelen gir vi to standardiserte protokoller for å samle utviklings embryoer for biologiske studier av embryogenesen i legume modellen M. truncatula. Den første er å samle zygotiske embryoer ved å knytte embryogenese og pod morfologi, mens den andre er somatisk embryogenese via dyrkning blad eksplantater å gi lett tilgang til store embryo tall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. zygotiske Embryo Development
- Plant Material
- Grow Medicago truncatula villtype Jemalong eller dens nær isogen, svært re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (kjent som 2HA) i et glasshus med en 14 timers daglengde og 23 ° C / 19 ° C dag / natt temperatur.
- Pierce overflaten av frø frakk (med en 23 G nål) før sådde frøet slik at vannet får lov til å gå inn i frø og bløt i vann over natten. Legg nok vann til å fullt ut dekke frøet.
- Sow tre frø i hver 15 cm diameter potten (totalt 10 potter) i potting blanding (grov sand, perlite, kokos-torv (1: 1: 1) pluss 5 g Osmocote Exact Standard: slow release gjødsel) og overføring til glasshus. Beholde den sunn frøplante etter spiring så det er en plante per pott og surround av et espalier for anlegget stammer å klatre.
- Grow Medicago truncatula villtype Jemalong eller dens nær isogen, svært re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (kjent som 2HA) i et glasshus med en 14 timers daglengde og 23 ° C / 19 ° C dag / natt temperatur.
- Høsting Pods
- Samle pods fra wild typen Jemalong eller 2HA å få de riktige tidlig embryo etapper som først beskrevet ni.
MERK: De ulike pod stadier er vist i figur 1 og tilsvarende embryo stadier er vist i figur 2. - Sjekk de ulike pod stadier ved innhøsting etter kriterier som per tabell 1. Mål tiden gått fra scenen seks for å hjelpe separate trinn 6 og 7 (tabell 2).
- Samle pods fra wild typen Jemalong eller 2HA å få de riktige tidlig embryo etapper som først beskrevet ni.
- Dissekere ovules fra pods og sjekke fosteret scenen
- Isolere ovules fra pods bruker fine tang alene eller et stereo disseksjonsmikroskop og tang som nødvendig. Om nødvendig embryo stadiet kan raskt kontrolleres ved hjelp av en standard sammensatt mikroskop (figur 3B).
- Forbered modifisert Hoyer løsning inneholdende 7,5 g arabisk gummi, 100 g kloralhydrat, 5 ml glycerol, 60 ml avionisert destillert vann. Løs opp av omrøring i 3-5 timer eller over natten.
- For mer avgrensed mikros fjerne dissekert ovules i modifisert Hoyer løsning 15,16. Nøye plukke opp de intakte ovules og legg dem i et lite volum av Hoyer løsning (nok til å dekke ovule) ved romtemperatur inntil klar.
- Vis prøvene med kontrast differensial forstyrrelser (DIC) optikk. Fange bilder iwth et digitalt kamera 9 (figur 2).
- Innhent mest ensartede ovules fra den sentrale regionen av pod og samle de nødvendige antall. Et eksempel er vist i Figur 3A. Samle ovules på is og oppbevares ved ønsket temperatur (-80 ° C for nukleinsyrer) for videre analyse.
MERK: For detaljer om analyse av histologiske snitt, transmisjonselektronmikroskopi, og in situ hybridisering se papirer 8,9.
2. Somatisk Embryo Development In Vitro
- Bruk en M. truncatula sorten tHatten er i stand til lett å danne embryoer i kultur. For denne protokollen for blad eksplantater bruke 2HA planter 13,17 som er 2-4 måneder gammel.
- Ta Brosjyrer fra nyeste nesten fullt utvidet trifoliate blad av en forlengelse stammen.
- Hold trifoliate bladene på fuktig papirhåndklær i en kultur potten for å unngå dehydrering.
MERK: Når trifoliate bladene høstes de må brukes med minimal forsinkelse. - Fremstilling av kulturmediet
- Bruk P4 10: 4: 1: 5 medium i agar (0,8% v: v) i 9 cm petriskåler.
MERK: P4 10: 4: 1: 5 medium består av P4 basalmedium 18 pluss 10 mM 1-naftaleneddiksyre (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurine (BAP), 1 uM abscisic syre (ABA) og 5 uM gibberellic syre (GA). Bruken av GA + ABA akselererer embryo formasjon og forårsaker vesentlige økninger i embryo nummer 14. - Utgjør P4 basal medium i en L; bestående av store salter (pass calcium opp separat), mindre salter og vitaminer (Tabell 3), chelatert jern (utgjør separat), kasaminosyrer (kaseinhydrolysat), 30 g sukrose, 8 g agar.
- Butikkstamløsninger av større salter, kalsium, kasaminosyrer, mindre salter og vitaminer ved -20 ° C i egnede alikvoter. Oppbevar chelated jern ved 4 ° C.
- Utgjør chelated jern (200x) ved å løse 7,44 g Na2EDTA • 2H 2 O i ca 900 ml avionisert destillert vann under omrøring, deretter bringe løsningen på 98-99 ° C mens du legger 1,853 g FeSO 4 • 7H 2 O. Endelig fyll opp til 1 liter når ingrediensene er oppløst. Oppbevares i rav farget flasker ved 4 ° C.
- Utgjør P4 basal medium med stamløsninger som i tabell 4. Hormonene i medium er 10 mm NAA, 4 mikrometer BAP, 1fiM ABA, 5 mikrometer GA (se tabell 4 og konkrete materialer tabell). Legg til NAAog BAP før autoklavering og tilsett ABA og GA etter autoklavering og avkjøling til ca. 55 ° C, ved hjelp av filtersterilisering med et 0,22 um filter festet til en sprøyte. Bland godt med forsiktige virvel.
- Juster media til pH 5,8 med 1 M KOH før autoklavering. Autoklav ved 121 ° C i 20 min.
- Etter autoklave legge filteret sterilisert ABA og GA, og hell ca 25 ml av media i sterile 9 cm petriskåler i en laminær hette eller biohazard kabinett. Kjølig og la agar satt med lokket av. Deretter sette på lokket og pass på at det ikke er noen kondensat på lokket. Etiketten som kreves og oppbevares ved 4 ° C (i en pappeske for å hindre lokket kondensat).
- Bruk P4 10: 4: 1: 5 medium i agar (0,8% v: v) i 9 cm petriskåler.
- Sterilisering av Leaf Tissue
- Jobbe i et UV-sterilisert laminær hette eller biohazard kabinett.
- Stedet forlater inn i mesh ball av en tidligere autoklaveres våren te infuser.
- Fordype te infuser inneholder bladene i 70% (v: v) etanol i en blindture potten for 30 sek.
MERK: For alle trinnene i denne fremgangsmåten bruker 250 ml skrukork polykarbonat kultur potter som er autoklaveres. - Hell av vannet og deretter overføre og senk bladvev i 1: 8 (v: v) fortynnet blekemiddel (0,5% klor) i 10 min. Virvle forsiktig fra tid til annen.
- Tapp av blekemiddel og overføre te infuser i en kultur potten inneholder sterilt avionisert destillert vann. Virvle og drenere overflødig vann. Gjenta en gang med en frisk kultur pot sterilt avionisert destillert vann.
- Fjern bladene fra te infuser med steril tang til en frisk kultur pott sterilt avionisert destillert vann. Skru på sterile cap og skyll ved å snu og virvler. La bladene flyter på sterilt vann til den er klar til å forberede explants.
- Forberede og Plating eksplantater
- Ved hjelp av sterile teknikker, trim individuelle steriliserte brosjyrer fra kanten med en skalpell, og kutte de resterende rektangel i to eller three rektangulære eksplantater (8-10 x 3-5 mm) med midt vene i midten av hver eksplantat (figur 5A).
MERK: Størrelsen på eksplantat er ganske viktig i å initiere den første callusing. Utføre klippe på sterile lokk fra take-away mat containere. - Plate 6 eksplantater på agar-størknet kulturmedium i 9 cm diameter petriskåler (Figur 5B). Plate på eksplantater abaxial side ned for å opprettholde vanlig blad orientering.
- Forsegle petriskåler med Parafilm (figur 5C) strukket rundt fatet. Vevet er nå klart for inkubasjon.
- Ved hjelp av sterile teknikker, trim individuelle steriliserte brosjyrer fra kanten med en skalpell, og kutte de resterende rektangel i to eller three rektangulære eksplantater (8-10 x 3-5 mm) med midt vene i midten av hver eksplantat (figur 5A).
- Tissue Inkubasjon
- Platene inkuberes i mørke ved 28 ° C i en kontrollert temperatur rom eller skap vekst gjennom hele dyrkningsperioden.
MERK: eksplantater vil initiere dedifferentiation, gjennomgå celledeling, spredning (callus formasjon) og embryogenesis (differensiering). - Subkultur differensierings explants etter tre uker på til frisk medium. På denne subkulturen overføre hele explant med en steril rustfritt stål stekespade og tang, i en laminær hette eller en biohazard kabinett. Som callusing oppstår og callus overstiger størrelsen av den største i figur 5C, overføre 50% av den individuelle callus når subdyrking i frisk medium.
- Observere de første embryoer i ca 4 uker. Mens det er en grad av synkronitet, samle ulike embryo scener over en 4-8 ukers inkubasjonstid (figur 6A, B). Samle under et disseksjonsmikroskop og fremgangsmåten i henhold til eksperimentelle formål.
- Subkultur hver 3. uke og fjerne embryoer med jevne mellomrom slik at eksplantater vil fortsette å produsere embryoer i 3 måneder.
- Platene inkuberes i mørke ved 28 ° C i en kontrollert temperatur rom eller skap vekst gjennom hele dyrkningsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For zygotiske embryogenesen forskjellig pod strukturer tilsvarende de forskjellige embryo trinn er vist i figur 1A - F, mens de forskjellige embryo trinn er vist i figur 2A - F. Ved å velge pods på samme nivå, prøver av ovuler som er ganske ensartet kan oppnås (figur 3A). Ved å bruke RT-qPCR embryo spesifikke gener kan lett oppdages og tidsforløp studier evaluert 9. Noe tilleggs disseksjon vil gi rom for videre anrikning av embryoet (Figur 3B). Prosessering for in situ hybridiseringsundersøkelser strategier kan lett utføres, så vel som eventuelle komplementære studier med lys (figur 4a, b) og elektronmikroskopi 8. Av særlig verdi i dette systemet er den egenart hypofysen og suspensor (figur 4A, B).
For somatisk embryogenese cUtting av den første eksplantat fra de enkelte folioles er vist i figur 5A. Eksplantene blir deretter plassert abaxial side opp i nær kontakt med agar (figur 5B). Etter callus formasjons embryo begynner å vises etter 3-4 uker, og etter 7 uker er det mange embryoer på cotyledon scenen (figur 5C). Ved å følge de gjennom platene mellom uke 4 og 7 embryoer ved diskrete trinn kan være plassert (figur 6A, B). De forskjellige stadier embryo kan lett observeres og slett plukket av for analyse. Dette kan være litt av en rask måte å få visse typer informasjon. For eksempel Figur 7 illustrerer hvordan embryoer i tidlig stadium cotyledon viste ekspresjon av en type MtOLEOSIN genet, men ikke en annen. Tidsforløp studier av det aktuelle genet kan deretter bli undersøkt ved hjelp av zygotiske eller somatiske embryoer. En spesiell fordel ved den somatiske embryo systemet er at omforming av callus kan utføres uten regenerering av en hel plante og gen-ekspresjon ved forskjellige stadier av embryogenesen visualisert ved anvendelse GUS (β-glukuronidase) eller fluorescerende markører. Et eksempel er vist i figur 6C.
Figur 1: Pod morfologi og embryo utviklingsstadier Pods på ulike stadier av utviklingen med embryoer ved diskrete stadier.. Stages 2-7 indikert. (A) og (B) er trinn 2 og 3 meget tidlige og tidlig pre-kuleformede (C) Trinn 4 tidlige globulære (D) -trinnet 5 sen kuleformet (E) Trinn 6 hjerte og (F) Trinn 7 sent torpedo. Baren er 2 mm. Stage jeg er blomstring (ikke vist).
Figur 2: Embryo utviklingsfasen. </ Strong> Slettet embryoer på ulike utviklingsstadier. (A) Trinn 3 tidlig pre-globulære, (B) trinn 4 tidlige globulære, (C) Trinn 5 sen kuleformet, (D) -trinnet 6 hjerte, og (E) Trinn 7 sent torpedo. Bar er 60 mikrometer.
Figur 3: Isolert ovules (A) Gruppe ovules med scene 5 embryoer.. (B) ovule sett under standard sammensatt mikroskop for å vise embryo som kan bli spaltet ved "krok" ende. Bar er 1 mm (A) og 200 um (B).
Figur 4:. Morfologi av tidlig embryo (A) § gjennom svært tidlig embryo showeting embryo riktig (fire celler), hypofysen (neste fire celler), suspensor (neste fire celler som har store vakuoler) og forholdet til ovule vev. (B) § gjennom tidlig torpedo stadium embryo (E) med fremtredende suspensor (S). Farget med toluidinblått. Bar er 10 um (A) og 50 um (B).
Figur 5:. Dyrking eksplantater å produsere somatiske embryoer (A) trifoliate blad som viser hvor eksplantater fra foliole er tatt. (B) eksplantater sådd ut på agar. (C) Somatiske embryoer fremstilt fra eksplantater etter 7 uker kultur. Bar IS10 mm
Figur 6: Somatiske embryo etapper og identifisere plasseringen av genet expression ved hjelp av transformasjon og GUS. (A) Somatiske embryoer ved kuleformet (G), hjerte (H) og torpedo (T) trinn. (B) Somatiske embryo på tidlig cotyledon scenen. (C) Globular trinn somatisk embryo i sterk GUS-ekspresjon for MtWOX9 genet i riktig embryo (E) og minsk farging i hypofysen (H) og suspensor (S). Bar (A, B) er 100 mikrometer. Bar (C) er 50 mikrometer.
Figur 7: Gene expression duing embryogenese in vitro ved hjelp av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) Gene expression of OLEOSIN3 (A) og OLEOSIN4 (B) i tidlig stadium cotyledon embryoer skåret ut fra embryoer fra embryo callus.. Expression er relativ to blad. Standardfeil indikeres.
| Stage nummer | Embryo scenen | Pod scenen |
| Stage 1 | Flower på anthesis | |
| Stage 2 | Veldig tidlig pre-globular embryo | Pod med en eller to spiraler |
| Stage 3 | Tidlig pre-globular embryo | Pod med tre komplette spiraler |
| Stage 4 | Tidlig globular | Pod med fem komplette spiraler og pigger ikke synlig |
| Stage 5 | Late globular | Pod med seks spiraler og umodne pigger høyst pod bredde |
| Stage 6 | Hjerte scenen | Pod med seks spiraler og langstrakte modning pigger stiger pod bredde |
| Stage 7 | Torpedostadium | Pod med seks spiraler, modne tykkere lengre pigger og økt omkrets |
Tabell 1: Kriterier for innhøsting av pod stadier Morfologiske kriterier som brukes for å identifisere pod etapper tilsvarer definerte embryo etapper..
| Flower Stage 1 (S1) | Pod Stage 2 (S2) | Pod Stage 3 (S3) | Pod Stage 4 (S4) | Pod Stage 5 (S5) | Pod Stage 6 (S6) | Pod Stage 7 (S7) | |
| Dager | 0 | 1,5-2 | 0,5-1 | 0.5 | 0,5-1 | 1 | 1-1,5 |
Tabell 2. Tid kurs for pod samling. Tiden fra than tidligere embryo utviklingsstadiet angitt i dager.
| Store salter / L | Mindre salt / L | Vitaminer / L | |||
| mg | mg | mg | |||
| Kno 3 | 1875 | MnSO 4 • H 2 O | 10 | Myo-inositol | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | Tiamin HCl | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO4 • 7H 2 O | 2 | Nikotinsyre | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0,75 | Pyridoksin HCl | 1 | |
| MgSO4 • 7H 2 O | 225 | Na 2 Moo 4 • 2H 2 O | 0,25 | ||
| Kalsium separat | CuSO4 • 5H 2 O | 0.025 | |||
| CaCl 2 • 2 H 2 O | 300 | CoCl 2 • 6 H 2 O | 0.025 | ||
| Chelated jern separat | |||||
| FeSO 4 • 7H 2 O | 9,267 | ||||
| Na2EDTA • 2 H 2 O | 37.2 | ||||
Tabell 3: P4 Medium Komponentene av P4 medium..
| Component | Beløpet / L |
| 10 x store salter | 100 ml |
| 100 x kalsium | 10 ml |
| 1000 x mindre salter | 1 ml |
| 200 x jern | 5 ml |
| 100 x kasaminosyrer | 10 ml |
| 1000 x vitaminer | 1 ml |
| Sukrose | 30 g |
| Agar | 8 g |
| Hormoner | |
| 1000 mikrometer NAA | 10 ml |
| 1000 mikrometer BAP | 4 ml |
| 1000 mikrometer ABA | 1 ml | </ Tr>
| 1000 mikrometer GA | 5 ml |
Tabell 4: Gjøre opp i P4 medium med hormoner Gjøre opp i P4 medium med hormoner fra stamløsninger..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet er relativt rett frem og la etterforskningen av belgfrukt embryogenese med all den moderne cellen og molekylære teknikker. Vi erkjenner at det er fordeler og ulemper ved både in vivo og in vitro tilnærminger. Både tillate mer fokus på tidlig embryo forhold til kultur av umodne frø 19.
I tilfelle av in vivo studier det som er beskrevet, er hovedsakelig isolering av ovule fra pod som er egnet for mange studier embryo. Det er selvfølgelig mulig ytterligere å anrike for embryo vev ved å skjære av "krok" området (figur 3B). Det er vanskelig å isolere det aller tidligste stadium av embryo- utvikling som under disection embryoet er ofte tapt da det ikke er godt festet til den tilstøtende vev, som gjør bruk av ovules fordelaktige. Bruke pod morfologi eliminerer merking av blomster og har en tid course regime for hver blomst. I tillegg er det potensial variasjon i utviklings timing metoder med mindre miljøet er veldig kontrollert. Optimum plantevekst er viktig, slik at pod dannelsen ikke skje under stressbetingelser. Bli kjent med pod utvikling og små justeringer kan gjøres for å definere morfologiske stadier for å matche spesifikke embryo utviklingstrinn.
I tilfelle av somatisk embryogenese, må det erkjennes at embryoene er avledet vegetativt og ikke fra en zygote. Dessuten er den ernæringsmessige kilde annerledes enn zygotiske embryo. I tilfelle av somatisk embryo, er det kulturmediet og omkringliggende callus, og i tilfelle av zygotiske embryo er det endospermen. Dette betyr at suspensor er mye bedre utviklet i tilfelle av zygotiske embryo (figur 4A, B). Den spesielle verdi av M. truncatula system er det store antall embryoer som svar på den uvanlige fire hormone-regimet. Hvis de store tallene ikke forekomme deretter sjekke detaljene som utgjør hormoner og deres tillegg til mediet bør sjekkes. Som med enhver kultur metodikk sterilitet eksplantatet vev uten skader (gjøre små justeringer i timingen av etanol og hypokloritt sterilisering ganger hvis dette er et problem) er viktig sammen med den forsiktighet i å opprettholde sterilitet under alle fremstillingsmåten.
Det vi har funnet er at det er verdifullt å utfylle in vivo og in vitro fremgangsmåter. Et eksempel fra våre egne studier er etterforskningen av transkripsjonsfaktoren MtSERF1 (SOMATISK EMBRYO RELATERT FACTOR 1), som er en etylen respons transkripsjonsfaktor genet. MtSERF1 ble først oppdaget i somatiske embryoer ved hjelp av RNAi, promoter-GUS fusions og in-situ hybridiseringer; og deretter vist til uttrykk i zygotiske embryogenese 20.
Studiet av belgfrukt embryogenese er viktig for hUman ernæring, og bruker M. truncatula embryoer sammen med de cellulære og molekylære teknologier nå tilgjengelig kan forbedre dette området. Insight kan oppnås i hvor embryo størrelse og dermed utbyttet kan optimaliseres sammen med den nødvendige karbohydrat, olje og proteinsammensetning. Disse determinants er i stor grad satt i gang tidlig i embryogenese 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
