Introduction
Studium der Drosophila melanogaster hat große Einblicke in die genetische Regulation einer Vielzahl von Phänomenen ist. Insbesondere gab es umfangreiche Forschung auf Ei-Entwicklung, da Oogenese eine tractable Weg zu vielen verschiedenen Entwicklungsprozessen, einschließlich Gewebe Strukturieren Zellpolaritätswechsel, Zellzyklus-Schalt und translationale Regulation 1,2,3,4 untersuchen. Ein wichtiger morphogenic Ereignis während der Oogenese ist die Spezifikation, den Erwerb von Motilität und Migration aus einem Satz von Zellen, die sogenannten Randzellen (in 5 überprüft). Da Zellmigration ist ein Schlüsselmerkmal von tierischen Morphogenese und weil die genetische Regulation dieses Prozesses ist gut konserviert, sind wahrscheinlich auch in anderen Zusammenhängen wichtig Mechanismen in Fliegen bestimmt. So untersuchen wir die molekularen Kontrolle der Grenzzellmigration. Für unsere Untersuchungen haben wir eine neue Methode, um die vorderen Pole der sich entwickelnden Eier Beobachtung entwickelt,denen Grenz Zellen entstehen, zu untersuchen, wie sie im Detail zu entwickeln.
Innerhalb der Eierstöcke, Eikammern bei verschiedenen Entwicklungsstadien existieren entlang Ketten genannt Ovariolen, die in einer dünnen Hülle (1A) umhüllt sind. Jedes Ei Kammer wird weitergehen, um ein Ei zu bilden. Während der Oogenese, müssen mehrere unterschiedliche Zelltypen in einer koordinierten Art und Weise zu entwickeln. Die D. melanogaster Eikammer aus 16 Keimlinien-Zellen, einschließlich einer Eizelle von einem einlagigen Follikelepithels 6 umgeben. Eine kleine Anzahl von spezialisierten Zellen, die so genannte polare Zellen, entstehen an den vorderen und hinteren Pole des Epithels. Die 6-8 enden Zellen stammen im anterioren Epithel der Eierkammer, von den Polarzellen 5,7 induziert. Mitte der Oogenese (Stufe 9), die Grenzzellen lösen sich von ihren Nachbarn und wandern zwischen den Nährzellen, die Eizelle an der hinteren der Eikammer 5,7 zu erreichen. Diese Bewegung muss erreicht werden,während die Grenzzellen in einer Cluster-Umgebung zwei unbewegliche Polarzellen, so dass dies eine Art kollektive Zellmigration. Erfolgreiche Migration der Grenzzellverband sorgt für die richtige Entwicklung der Mikropyle der Eierschale, die für die Befruchtung notwendig ist.
Die vorderen polare Zellen anweisen Grenzzellschicksals durch die Aktivierung eines Signalübertragungskaskade. Polar Zellen eine Cytokin, ungepaarte (UPD), die zu einer Transmembranrezeptor, Domeless (DOME) bindet, auf benachbarte Follikelzellen in Stufe 8 von Oozytenentwicklung 8,9. Die Bindung von UDP verursacht Janus Tyrosin-Kinase (JAK), um das Signal Transducer und Aktivator der Transkription (STAT) 8,10,11 phosphorylieren. STAT bewegt sich dann in den Kern, um die Transkription zu aktivieren. Langsam Border Cells (SLBO) ist ein Transkriptionsfaktor, der eine direkte transkription Ziel von STAT ist und wird auch für die Grenzzellmigration 12 erforderlich. Seitenansichten Eikammern zeigen that STAT-Aktivität wird in einem Gradienten über die vordere Epithel 8,11,13 geregelt. Follikelzellen nächsten zu den polaren Zellen die höchste aktiviert STAT, damit sie sich Randzellen und dringen in den benachbarten Keimbahngewebes.
Um zu verstehen, wie die Grenzzellen innerhalb festgelegter und nehmen Sie aus dem Epithel, müssen wir beobachten, wie sich das Gewebe organisiert. Wenn wir sehen Eikammern von einer anterioren-on Sicht würden wir radiale Symmetrie der STAT-Aktivität in den Follikelzellen rund um die Polarzellen erwarten. Eine End-Ansicht würde auch genauer Unterschiede von Membranproteinen und Zell-Zell-Interfaces zeigen vor und während der Ablösung als Vergleich die Zellen in unterschiedlichen Brennebenen. Da Eikammern sind länglich und miteinander durch Stiel Zellen angebracht, auf Objektträger nieder sie seitlich, so dass es schwierig ist, den vorderen Architektur zu beobachten. So viele Informationen über die Zellen, an den Polen des Eies Kammerwurde von Seitenansichten abgeleitet. Obwohl einige Informationen durch algorithmische 3-D-Rekonstruktionen von optischen Schnitten, Lichtstreuung, Photobleaching und schlechtere Auflösungsgrenzen in der Z-Achse erhalten werden diese Angaben weniger detailliert und zuverlässig in der Abwesenheit von teuren Techniken wie superauflösende Mikroskopie 14 . Andere Arten von Abschnitt basierten Bildgebung (beispielsweise Elektronenmikroskopie oder Mikrotom Schnitte) erfordert umfangreiche Manipulation von Geweben, einschließlich Entwässerung, was die Wahrscheinlichkeit für Artefakte. So eine neue Methode zur Bild D. entwickelten wir melanogaster Eikammern während aufrecht. Diese Methode hat sich bereits bei der Aufklärung, wie bewegliche Zellen sind vom Schicksal bestimmt (siehe Repräsentative Ergebnisse und Manning et al, im Berichts) bewährt und dürfte im weiteren Sinne wertvoll in Studien anderer Aspekte der Oogenese sein.
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Protocol
1. Präparation Ovariolen
- Übertragen Sie etwa fünfzehn 2-4 Tage alte weibliche Fliegen und ein paar Männer auf eine frische fliegen Essen Fläschchen mit Mehr Trockenhefe. Verwenden Baumwolle als Plugin für die Fläschchen, und fügen Sie ein paar Tropfen Wasser auf die Baumwolle, die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten.
- Ort Vial in einem 25 ° C Inkubator für 14-16 h, um die Anzahl der Stufe 8-10 Eikammern maximieren.
Hinweis: Die Inkubationszeit variiert je nach Temperatur und gewünschte Bühne. - Bereiten Dissektion Medien, 0,1 M KPO 4 und NP40 Lösungen für den nächsten Tag erforderlich (siehe Materialien).
- Anesthetize die Fliegen mit CO 2, und legen Sie unter einem Dissektionsmikroskop. Pipette einige Tropfen Dissektion Medien in jeden Hohlraum in der Glas Depression Rutsche.
- Halten Zange in jeder Hand in einem ca. 30 ° Winkel zur Tischplatte und orientieren eine weibliche Fliege mit den Flügeln nach unten. Mit Ihrer nicht-dominanten Hand, nehmen Sie den weiblichen mit einer Pinzette, greifen sie an der einnterior des Bauches, in der Nähe des Brustkorbs, und tauchen sie in die Dissektion Medien in der Vertiefung Schieber (1A Einschub).
- Mit der anderen Pinzette, fassen Sie das Exoskelett an der ventralen posterioren des Bauches und durch durchbohren. Besorgen Sie sich die Eierstöcke am hinteren Ende, und ziehen Sie sie aus dem Bauch und legen Sie die frische Medien auf der anderen Seite der Mulde Rutsche. (1A kleines Bild). Vermeiden Auseinanderziehen des Darms. Entsorgen Sie die Karkasse.
- Wiederholen Sie mit den anderen weiblichen Fliegen bis alle Eierstöcke seziert werden. Entsorgen Sie die Männer.
- Mit einer Pinzette, halten Sie ein Eierstock am hinteren Ende (in der Nähe der größten Ei Kammern), und mit der anderen Hand mit einem Pinzette zu einem der vordersten Ei Kammern (Germarium) einklemmen. (1A).
- Langsam und stetig, ziehen eine Ovariole Kette aus dem Eierstock Scheide. Weiterhin individuell sezieren Ovariolen bis alle gewünschten Ei Kammern removed.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,8 für alle seziert Eierstöcke.
- Wenn Sie fertig sind, übertragen Ovariolen auf eine 0,6 ml Tube mit einem Kunststofftransferpipette.
- Lassen Ovariolen setzen sich am Boden der Röhre, dann nach Fixierung und Färbung Schritten fortfahren.
2. Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Ovariolen
- Dissektion Medium vorsichtig aus Ovariolen mit einer Pipette. Achten Sie darauf, keine Ovariolen oder Eikammern entfernen. Lassen Sie ca. 50 ul Ovariolen und Dissektion Medien.
- In 50 ul von 16% Paraformaldehyd und 150 ul 0,1 M KPO 4 Puffer in einem Rohr, und fügen Lösung Eikammern, sie zu beheben. Inkubation unter Schütteln für 10 min. ACHTUNG: Para ist giftig.
- Entfernen Fixiermittel und spülen Sie zweimal mit 0,5 ml NP40 Waschpuffer.
- Zweimal für 15 Minuten jeweils bei RT waschen.
- Siehe Standard-ZF-Protokoll 15 für den nachfolgenden Schritten.
- Kurz nach der Fixierung, fügenPrimärantikörper an den geeigneten Verdünnungen inkubieren O / N bei 4 ° C. In NP40 mehrmals waschen, dann fügen Sekundärantikörper (1: 200 Verdünnungen).
- Mehrmals waschen in NP40, dann fügen Sie DAPI (1: 1000) für 10 Minuten, dann wiederholen Wäschen. Sobald IF-Protokoll abgeschlossen ist, fügen Sie 200 ul von 50% Glycerin in PBS zu Eikammern und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 2 Std.
- Entfernen Lösung, ersetzen Sie es mit 70% Glycerin in PBS und mit Folie abdecken. Zeigen Probe bei 4 ᵒC bis einbaufertig. Unterdessen mit Schritt 3 fortfahren.
3. Geleistete Vorbereitung von Glycerin Jelly Slides
- Messen Sie mindestens 4 ml Gelee Glycerin mit einem Spatel und füllen ein Glas Zellkulturröhrchen in die Halbmarathonmarke. Schmelzen Glycerin Gelee in einem Wasserbad bei 55 ° C für 30 min.
- Gießen Sie einen kleinen Tropfen Glycerin, etwa 300 & mgr; l aus der Stammlösung auf zwei Objektträgern. Mit einem Gewebe, verbreiten Glycerin in einer dünnen layer über jede der Folien. Dies liefert eine Basis und ermöglicht die einfache Entfernung von Glycerin Gelee in Schritt 5.6.
- Schneiden Sie die Spitze aus einer gefilterten 1.000 ul Pipettenspitze. Verwenden Schnitt Pipettenspitze 1000-1500 ul warmen Glycerin Gelee langsam auf jedem Objektträger übertragen. Achten Sie darauf, um Blasen zu vermeiden.
- Lassen Glycerin Gelee Folien sitzen für 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt.
- Platzieren Sie jede Glycerin Gelee Folie in 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Bei 4 ° CO / N. Optional Speicher Glycerin Gelee Folien für bis zu 5 Tage bei 4 ° C.
4. Montage Egg Chambers
- Mit Proben aus Schritt 2.5, Pipette mehr 3 ul Tropfen Eikammern in 70% Glycerin in einem Glycerin Gelee Rutsche. Weiter Pipettieren 3 ul Tropfen, bis alle Eier Kammern sind auf dieser Folie. Stellen Sie sicher, jeder Tropfen mindestens zehn Eikammern. Inzwischen Hitze ein Kulturröhrchen aus Glycerin Gelee in einem 55 ° C Wasserbad.
- Stellen Sie das Glycerin Gelee Rutsche mit Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur ein Tropfen Eikammern ist in dem Sichtfeld (1B).
- Mit einer 30-Gauge-Nadel, wie einem Löffel, nehmen Sie die gewünschte Stufe Eikammer. Wenn nötig, separate gewünschten Ei Kammern von einem Ovariole Kette mit Hilfe der Nadel wie ein Messer.
- Um Verunreinigungen, die mit einer Abbildungs stören können, zu vermeiden, übertragen das Ei Kammer zur zweiten Glycerin jelly Schieber mit dem vorderen zugewandt links (1E -1). Wiederholen, bis es mindestens sieben Eikammern reihen sich in einer Spalte (Abbildung 1C).
- Bilden neue Spalten von sieben bis alle gewünschten Eikammern werden dem zweiten Glycerin jelly Träger übertragen.
- Reißen Sie ein kleines Stück Gewebe und Twist. Verwenden Sie diese Option, um das überschüssige PBS-Glycerin von den Ei Kammern durch leichtes Berühren jeden einzelnen zu absorbieren. Achten Sie darauf, Eikammern nicht entfernen.
- Schneiden Sie dieSpitze eines gefilterten 200 ul Pipettenspitze. Verwenden Sie diese Funktion, um 150 ul Glycerin Gelee, um alle Spalten der Eikammern decken zu übertragen.
HINWEIS: Die Menge an Glycerin Gelee benötigt, um die Säulen zu decken auf Eikammer Stufen und die Anzahl der Säulen. Menge eingestellt werden kann. - Lassen montiert Eikammern sitzen für 5 min bei RT, bis die obere Schicht aus Glycerin Gelee vollständig verfestigt (1D).
- Den Objektträger montiert Ei Kammern in einem 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Lagerung bei 4 ° CO / N, damit die Glycerin Gelee Schichten (in der dunklen Ort, wenn es Bedenken über Photobleaching) zusammen zu verfestigen.
5. Herstellung von Egg Chambers for Imaging
- Zeigen Schieber montiert Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur eine Spalte Eikammern ist in dem Sichtfeld.
- Mit einem Winkel von 45 ° Miniatur Skalpell, schneiden Sie ein straight Linie entlang der rechten Seite der ersten Spalte Eikammern (nahe der hinteren Seite der Eikammern). (1D-E)
- Als nächstes wird über der ersten Eierkammer an der Oberseite und unter der letzten Eikammer in der Spalte geschnitten. An diesem Punkt der Spalte Eikammern sollte auf drei Seiten geschnitten werden.
- Verwendung eines microknife, Scheibe entlang der linken Seite der Säule, so nahe wie möglich an der vorderen Seite der Eikammern (1E -3).
- Je 100 ul kaltem 1X PBT über die Schnitt Spalte.
- Verwenden Sie einen abgerundeten Kanten Spachtel, um das überschüssige Glycerin Gelee um drei Seiten des Schnittes Spalte Eikammern und entsorgen zu entfernen, während der Rest auf der Folie.
- Stecken Sie den Spachtel in den Schnitt an der vorderen Seite des Eier Kammern und trennen Sie die Spalte aus der Primär Glycerin Gelee Block.
- Bereiten Proben entweder invertiert (5.8.1) oder stehend (5.8.2) Mikroskopie.
- Für Inverses Mikroskop: Transfer ter Spalte Eikammern zu einem Deckglas mit vorderen Seite Eikammern nach unten. Die Schritte 5.2-5.8, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und gelagert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Eikammern, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Bild Eikammern direkt auf Deckglas.
- Für aufrechten Mikroskop: Übertragen Sie die Spalte von Ei Kammern auf einen Objektträger mit der vorderen Seite nach oben ein. Die Schritte 5,2-5,9, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und auf Objektträgern montiert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Ei Kammern und Deckblöcke mit einem # 1 ½ Deckglas.
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Representative Results
Die aufrechte bildgebenden Verfahrens konnten wir direkt die Organisation von Zellen in der vorderen Follikelepithels auf Stufe 8 zu sehen Ein allgemeiner Marker für Follikel Zellschicksal, die Augen Absent (EYA) Protein, sowie die Kern-DNA-Marker DAPI, hat auch Ausdruck in diesem Bereich der Zellen, und zeigten, dass alle Zellen könnten mit ähnlichen Färbungsintensitäten (2B ') zu sehen ist. Proteine, die in Reaktion auf das Cytokin UPD reguliert zeigten jedoch erlichen Muster Expressionsniveaus. Polar Zellen setzen UPD apikal vor diesem Stadium der Eientwicklung 16,17, so dass wir erwarten STAT radial über den Polarzellen, die manchmal der Fall war, aktiviert werden. Häufiger jedoch beobachtet, dass nachgeschaltete Ziele STAT einschließlich SLBO hatte komplexer Expressionsmuster. Zum Beispiel GFP Reporter SLBO Expression schien in den meisten, aber nicht alle Zellen, die die polare Zellen umgeben (2B, und sehen Manning et al überprüft wird). Uns ist aufgefallen leichte Unterschiede in der E-Cadherin-Expression / Lokalisierung (2B), die Veränderungen in Haftung widerspiegeln kann, aber mehr Arbeit wird erforderlich, um zu quantifizieren und zu interpretieren dieses Ergebnis werden. Diese Feinheiten nicht durch seitliche dreidimensionalen Rekonstruktion statt Eikammern (2C-D) nachweisbar. Die Unterschiede in der apikalen basalen Achse der Follikelzellen kann auch mit dem aufrechten Verfahren unterschieden werden. Wir verwendeten eine Reporterlinie für den Ringkanal Protein Visgun (VSG), das im apikalen Bereich von Plasmamembranen 18 (3A) vorhanden ist. Upright Abbildungs bestätigt VSG-Expression wurde im apikalen Teil der Follikel-Zellen erfasst, in der Nähe der engsten Stelle der polaren Zellen (3B).
Wir haben auch festgestellt, dass der aufrechte bildgebendes Verfahren funktioniert gut, um die vordere Epithel in der Stufe 9 Eikammern anzuzeigen. An diesem devellungs Stufe werden die Randzellen zusammen vereinigen rund um den Polarzellen (4A). Wir könnten diese verdichtet Cluster mit dem end-on-Bildgebung (4B-C) zu beobachten. Wie in Stufe 8, fanden wir ein ähnliches Niveau der EYA Expression in allen Epithelzellen (nicht gezeigt), während slbo -GFP sowie aktivierter Kern STAT markiert die bewegliche Randzellen (4B und 4C). Lokalisierung FAS3 Protein zeigte die Polzelle polaren Zelleninterface (4B). Zusätzlich wird in beiden Stufen 8 und 9 könnten wir die große Nährzellen zu sehen, wie durch DAPI oder Phalloidin-Färbung von kortikalen Aktin (nicht gezeigt), was zeigt diese Methode auch zur Untersuchung der Keimbahnzellen oder Keimzellen sein deutet -follicle Zell-Interaktionen.
Abbildung 1. Aufrechte Montage von Drosophila Eikammers. (A) Drosophila Fruchtknoten anzeigt Eikammer, Scheide und Ovariole. Abbildung zeigt die Position der Zange zum Ziehen des Ovariole langsam aus dem Eierstock Mantel. Einschub zeigt Positionierung der Fliege für die Präparation. Bauchseite der weiblichen Fliege nach oben zeigt. A-anterior-posterior P. (BD) Verfahren zur Montage Eikammern. (B) Ein kleiner Tropfen Eikammern in 70% Glycerin-PBS, unter einem Stereomikroskop betrachtet Dissektion. Der gelbe Pfeil zeigt eine Ovariole Kette; gelbe Pfeilspitze zeigt eine einzelne Ei Kammer. Roter Pfeil zeigt die Kante des Glycerin-PBS Abfall. (C) Spalten des Eikammern auf dünnen Schicht aus verfestigtem Glycerin jelly angeordnet. Yellow Pfeilspitze zeigt eine einzelne Ei Kammer. (D) eine zweite dünne Schicht geschmolzen Glycerin Gelee deckt die Eikammer Spalten, um sie zu verankern. Gelb gepunktete Linie zeigt an, wo Schnitte sollten nach O / N Inkubation bei 4ᵒC werden. Roter Pfeil zeigt dieKante der zweiten Schicht aus Glycerin Gelee. Rote Zahlen geben die Reihenfolge des Schneidens der Eikammer Spalten (horizontal oben und unten Schnitte werden nicht gezeigt). Anterior ist auf der linken Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Imaging des vorderen Epithel frühzeitig 8 Eikammer. (A) Seitenansicht eines Stufe 8 langsamen Randzellen (slbo) Gen Reporter Eikammer (Genotyp: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, mit DAPI und primären Antikörpern wie angegeben oder für slbo> GFP gefärbt. Armadillo (ARM) ist der Fliegen Homolog des β-Catenin. Anterior (A) nach links, hintere (P) auf der rechten Seite. (BB ") End-on Blick auf ein Ei chamber. Dreidimensionale Rekonstruktion der Z-Stapel-Bildern einer Stufe 8 slbo- Gen Reporter Eikammer montiert aufrecht, mit primären Antikörpern gefärbt, wie angegeben. Magenta Sternchen zeigen Polarzellen. DAPI markiert die Kerne. (B ') slbo> GFP wird nur in den vermutlichen Randzellen (SLBO) ausgedrückt. E-Cadherin (E-CAD) ist ein Adhäsionsmolekül zu der Membran lokalisiert und in den Randzellen angereichert. (B '') Augen Abwesend (EYA) gefunden wird gleichmßig in den Kernen aller Follikelzellen außer polaren Zellen exprimiert. (C) Standard-Seitenansicht eines slbo -reporter Stufe 8 Eikammer mit DAPI (blau) und Antikörper gegen GFP (SLBO, grün), ARM (rot) gefärbt und FAS3 (weiß). Der Einschub zeigt die Achsen: die X-Achse wird nach unten (grüner Pfeil), Y-Achse nach links (roter Pfeil) und die Z-Achse ist in Richtung des Betrachters (blau) (D) zum Vergleich mit dem neuen Verfahren. Dieses Bild zeigt ein Ende auf Blick created durch eine dreidimensionale Rekonstruktion, verarbeitet mit Volocity Software unter Verwendung eines Z-Stapel von seitlichen Bilder der in C. Inset gezeigt Eikammer zeigt die gedrehten Achsen: die X-Achse wird nach unten (grüner Pfeil) Z-Achse nun auf der linken Seite (blauer Pfeil) und der Y-Achse ist in Richtung des Betrachters (rot). Einzelne Zellen sind aufgrund der niedrigen Auflösung in der Z-Achse verwischt; damit die in B gezeigt neuen Ansatz stellt einen bedeutenden Bildverbesserung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Vergleich der Proteinexpression in lateralen und vorderen Bereiche des Follikelepithels einer Etappe 8 Eikammer. (A) Rekonstruktion einer Seitenansicht einer Stufe 8 Eierkammer visgun (VSG) -GFP Reporter <sup> 21 bis 23, auf Antikörper gegen GFP oder ARM (weiß) gerichtet gefärbt. DAPI markiert die Zellkerne in blau, und große Schwester Zellkerne sind offensichtlich. VSG lokalisiert auf die Ringkanäle der Follikelzellen (grün). (BB ') End-on Blick auf ein Ei chamber.Three-dimensionale Rekonstruktion eines Z-Stapel von Bildern von einer Bühne 8 VSG-GFP-Reporter Eikammer, mit Bunt primären Antikörpern wie angegeben. SLBO Protein (rot) ist sowohl in polaren und Grenzzellkerne erkannt. ARM markiert Follikel Zellmembranen und wird in den Grenz Zellen angereichert; DAPI-Etiketten Kernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Abbildung von Stufe 9 Eikammern früh. (A) Seitenansicht eines Stufe 9 sl Anfangbo -reporter Eikammer. Die Randzellen (grün) haben im vorderen Epithel (weißer Pfeil) gebündelt. BC) Ende-on Blick auf die Ei Kammern. Dreidimensionale Rekonstruktion eines Z-Stapel von Bildern aus einem frühen Stadium 9 slbo- Gen Reporter Eikammer, gebeizt mit primären Antikörpern gegen die Proteine gerichtet, wie angegeben oder GFP. (B) slbo> GFP wird in den Grenzzellen exprimiert (grün) während Fasciclin 3 (FAS3, weiß) lokalisiert stark an die Membran zwischen den beiden polaren Zellen; DAPI markiert die Kerne (blau). Magenta Sternchen zeigen Polarzellen. (C) Beide Kern (aktiviert) STAT und slbo> GFP-Expression nur in den Randzellen gefunden, während E-Cadherin (E-CAD) markiert die Membranen der Follikelzellen und DAPI zeigt die Kerne. Magenta Sternchen zeigen Polarzellen. Färbeergebnisse werden individuell für slbo gezeigt> GFP (C ') und STAT (C' ') Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zu montieren und Bild klein, entwickelt Eikammern von einer End-on-Perspektive. Gemeinsame Methoden zur Bildgebung Ei Kammern für Seitenansichten optimiert und vor allem ermöglichen eine präzise Visualisierung von mediolaterale Follikelzellen, wenn mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt. Die Verwendung von Z-Stapeln oder 3-D-Rekonstruktion Hilfsmittel in Anzeigen mehrerer Brennebenen, aber ist immer noch für subzelluläre Auflösung der Pole des elliptischen Eikammern (2D) unzureichend. Dies kann zwar teilweise mit der neuesten Mikroskopietechniken wie Superauflösungsabbildungs überwunden werden, sind diese Verfahren teuer und nicht immer verfügbar. Wir haben gerade Bildgebung Protokolle angepasst für Drosophila-Embryonen 24,25, für die viel kleineren Ei Kammern verwendet werden. Es gibt mehrere wichtige Änderungen in der Methode, für die viel kleineren Größe Eikammern Vergleich zu Embryonen zu berücksichtigen. Ein wichtiger Bestandteil der beschriebenen Technik ist die physische separation von einzelnen Kammern, die nicht von Embryonen erforderlich ist. Eine weitere Änderung ist die Verwendung eines zweiten Glycerin jelly Schieber bei der Montage (4.4). Die Größe der Eierkammern und deren Befestigung durch Stielzellen in andere Eikammern erfordert Manipulation mit der Nadel und führt zur Zerstörung von Glycerin Gelee. Daher Eikammern muss mit einer Nadel auf eine neue Glycerin Gelee Rutsche für die Montage (4.5) überführt werden. Upright Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der Bereiche durch seitliche oder horizontale Blick verschwommen und enthüllt neue Informationen über die Gewebeorganisation während der Eientwicklung. Dies führte zu neuen Erkenntnissen über die Strukturierung Veranstaltungen, und wir schlagen vor, dass diese Methode verwendet, um zusätzliche Aspekte der Oogenese erkunden.
Wir haben einige wichtige Schritte in erfolgreiche stehende Montage bestimmt. Wir fanden, daß es notwendig ist, Ovariole Ketten vollständig aus der Hülle bei der Präparation zu entfernen, und die gewünschten Eikammern müssen vom ovariol geschnitten werdene Kette. Nicht kostenlos Eikammern vom Ovariole macht es schwierig, die richtige Bühne Eikammer (Schritt 4.3) abholen. Wir empfehlen die Arbeit mit kleinen Mengen an Glycerin Gelee zu einem durch Aliquotieren es in Röhrchen. Erhitzen Sie nicht Glycerin Gelee mehr als das Doppelte, da wiederholtes Erhitzen verändert seine Konsistenz und verhindert, dass es richtig (3,1) Verfestigen. Verwenden Sie Filterspitzen Absaugen Gelee in Pipetten zu vermeiden. Zulassen Glycerin Gelee auf Mikroskop-Objektträger für mindestens 8 Stunden bei 4 ° C zu verfestigen. Kürzen Sie diesen Schritt macht die Montage der Eikammern schwer (3.6). Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle PBS-Glycerin aus montiert Ei Kammern (4,6) zu absorbieren. Wenn zu viel Flüssigkeit vorhanden ist, verhindert, dass die oberste Schicht der Glycerin Gelee aus auf den Boden haften. In diesem Fall kann Eikammern schweben und Position ändern. Für beste Abbildungsergebnisse müssen Glycerin Gelee Blöcke so nahe an der vorderen Seite des Eikammern wie physikalisch möglich (5.4) geschnitten werden. Zu viel Glycerin Gelee auf dieseSeite sinkt die Bildqualität aufgrund der erhöhten Abstand zwischen der Probe und dem Deckglas.
Es gibt einige Einschränkungen der Montage Proben in Glycerin Gelee. Zum einen erhöht sich der Abstand zwischen der Probe und dem Objektiv. Dieser Abstand bei hoher Vergrößerung, vor allem während der Verwendung einer Öl-Objektiv, können problemlos zu erstellen Fokussierung auf die Probe, was zu einer schlechten Bildqualität führen kann. Vor diesem Hintergrund ist es sehr wichtig zu schnitzen, die Glycerin Gelee Blöcke in unmittelbarer Nähe der Eierkammern. Obwohl das Glycerin Gelee optisch klar, nicht wahr defract etwas Licht. Eine weitere Einschränkung ist, dass Antikörper-Signal kann durch eine Kombination der Arbeitsabstand des Objektivs und der Dicke Glycerin jelly reduziert werden. Eine Erhöhung der Konzentration von sowohl primäre und / oder sekundäre Antikörper kann manchmal helfen bei der Verringerung dieses Problem. Obwohl es variiert je nach Antikörper, die wir in der Regel erworben bessere Bilder mit Hilfe der doppelten Konzentration an Neben antibody aufrecht Imaging im Vergleich zu dem in der Norm lateralen Abbildungswendeten Menge ab. Uns sind keine Alternativen zu Glycerin Gelee für die Montage Eikammern aufrecht. Andere Materialien, wie Agarose und Polyacrylamid wurden versucht, aber alle defracted Licht stärker, was zu einem Verlust an Klarheit, während Bildgebung. Somit ist diese Befestigungstechnik am besten, die derzeit zur Verwendung mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie ist.
Während wir auf den Bühnen der Grenzzelle Spezifikation und Einleitung Motilität konzentriert, könnte Ei Kammern unterschiedlicher Stufen in diesem Protokoll mit nur ein paar kleinere Anpassungen verwendet werden. Am wichtigsten ist, kann die Feinheit der Nadel geändert werden, um Ei Kammern unterschiedlicher Größe und Entwicklungsstufen zu manipulieren. Für Stufen 7-10, eine 30 G Nadel funktioniert gut, weil die Eierkammern passen problemlos in der Schräge. Bei frühzeitiger Eikammern eine größere Nadel (kleiner Fase) verwendet werden und ebenso eine kleinere Spurweite (größere Fase) sollte für eine spätere st verwendet werdenAlter Eikammern. Alles, was in einem höheren Entwicklungsstufe zu groß für dieses Messgerät (4.3). Auch jede Seite des Eis Kammer kann mit dieser Technik durch Anordnen des Glycerin jelly Block Eikammern mit dem interessierenden Bereich an dem Ziel abgebildet werden.
Montage kleiner Proben in Glycerin Gelee unterstützt hat das Potenzial, die in mehreren Kontexten zu sein. Diese Strategie könnte verwendet werden, um verschiedene Arten von kleinen, festen Gewebe aus anderen Organismen sichtbar zu machen, vor allem wenn es nicht ausreichen würde, um die Proben aus einer einzigen Perspektive zu untersuchen. Sobald diese Technik beherrscht, kann es verwendet werden, um Ei Kammern in einem beliebigen Winkel zu betrachten, je nachdem, wie das Ei Kammern im Gelee positioniert werden. Dieses Verfahren ermöglicht eine einzigartige Aussicht schaffen eine viel bessere dreidimensionale Verständnis zellulärer Organisation. Upright Bildgebung Eikammern in Verbindung mit Fluoreszenzantikörperfärbung ermöglicht die präzise Erfassung von Proteins und Zell-Zell-Kontakte, die unter Standard-Einbaubedingungen möglich wäre das nicht. Wir planen, diese Methode in der Abbildung der Zell-Zell-Interaktionen, die das Zusammenwachsen und die Ablösung der Grenzzellverband aus dem Epithel ermöglichen verwenden. Zu diesem Zeitpunkt kann der aufrechte bildgebendes Verfahren nicht mit Live-Proben verwendet werden, aber wir arbeiten auch dieses Hindernis zu überwinden. Wir erwarten, diese Methode auch auf andere Aspekte der Drosophila Oogenese studieren oder werden könnten, um andere kleine Gewebe an neue Blickwinkel angepasst werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
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